一种3个运动能力相关基因的pcr-ldr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用LDR法同时检测3个运动机能相关基因的联合检测试剂盒，该试剂盒可在3个小时内同时检测三个运动机能相关基因中的3个热点突变，该试剂盒包括PCR扩增试剂和LDR反应试剂；所述PCR扩增试剂包括：PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增ACTN3、EPO、CKMM三个基因中3个热点突变的引物混合物；所述LDR反应试剂试剂包括：PCR产物、10×连接缓冲液、LDR探针、TaqDNA连接酶等。一共包括3对PCR引物和3组检测探针。本发明以上述3个基因为检测对象，该方法灵敏度高；相对传统测序技术，本试剂盒能完成一次性获得3个关键与运动能力显著相关基因的基因型，实现了对运动能力的高通量筛查，具有经济、高效和高准确率等优势。
【专利说明】-种3个运动能力相关基因的PCR-LDR检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测【技术领域】，具体是一种3个运动能力相关基因的PCR-LDR检 测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 随着人类基因组计划的完成，后基因组计划的全面展开，以基因工程为主导的生 物技术在体育运动问题领域的应用得到广泛的关注。基因遗传工程应用于运动员选材是大 势所趋，它必将从根本上引起运动选材理论和方法的革命。运用遗传学的理论和方法进行 运动选材已经有了初步进展。与个体运动能力的相关多个基因位点已经被发现，遗传工程 应用于运动选材的前景广阔而紧迫目前较为成熟的运动人材基因筛选的相关位点包括：
[0003] I. ACTN3 基因
[0004] ACTN3是一个与爆发力相关的基因，该基因位于人体第11号染色体上，它的R等位 基因所编码产生的α -辅肌动蛋白-3只存在于骨骼肌的快肌纤维中，正常情况下其16号 外显子的第1747位核苷酸的碱基为c，能指导编码ACTN3蛋白；当该位点发生了 c到T的 突变，基因链产生了终止密码子，取代了氨基酸残基第577位的精氨酸，使快肌纤维无法合 成ACTN3蛋白，从而导致α -辅肌动蛋白-3的缺失。已经有大量研究证明，577R位点的CC 基因型则由于拥有两个ACTN3基因使得爆发力相关的运动能力明显优于CT和TT型。
[0005] 2. CKMM 基因
[0006] 肌酸激酶（CK)是Cr+MgATP+H--PCr+MgADP反应的关键酶。CK与磷酸肌酸组成 肌酸一磷酸肌酸穿梭系统，在细胞内的作用：一是，在高能量需求时作为"暂时的能量缓冲 系统"保持ATP/ADP的比率；二是，作为能量转运单位，将能量从产生部位转运到利用部位。 肌型肌酸激酶是一种组织特异性酶，主要在骨骼肌中表达，心肌中也有少量表达。肌肉中 CKMM主要集中在M线附近，其主要功能是在肌球蛋白头部生成高浓度的ATP，为肌肉收缩及 运动提供能量，CKMM也存在肌质网CaATP酶附近，可能影响Ca的再聚集，从而影响肌肉的 工作能力。研究表明，人的CKMM基因的多态性与耐力以及耐力训练效果有关。
[0007] CKMM基因多态性的三种基因型分别为：AA型、GG型和杂合子AG型。研究结果显 示：与耐力训练前相比，训练后相通亚极限强度运动时，AA、AG型的人运动能力提高显著， 但GG型训练后各种指标改变不明显。因此GG型基因为耐力训练中最不敏感，携带A等位 基因的AA型、AG型人对耐力训练的敏感性显著高于和GG型。
[0008] 最新研究表明在高强度运动后出现的肌痛、肌酸激酶增高等横纹肌溶解症状，与 ACE与CKMM基因有密切的关系。运动后与D等位基因（ACE基因）和G等位基因（CKMM基 因）的个体更易出现肌酸激酶高反应。而同时具有DD基因型（ACE基因）和GG基因型 (CKMM基因）的人，会出现运动后肌酸激酶异常升高，D+G基因型有相加作用。
[0009] 3.促红细胞生成素（EPO)基因
[0010] EPO基因是促进红细胞生成增多的关键调节基因，通过促进红细胞生成增多来提 高机体携氧和运氧能力，可以通过促进红细胞生成增多来提高携氧和运氧能力，可以促使 机体更快的产生能量，EPO还能促进红细胞释放进入血液，减轻低氧对机体的损伤即能增强 个体对低氧环境的适应性，是可以让运动员跑的更久的基因，在越野、长跑等耐力项目中拥 有更多的EPO能给机体提供更多的能量。研究发现不同种族人群中EPO基因 SNP/T354IG多 态性分布存在差异性，优秀基因型T/G能增强个体对低氧的适应性和耐受性。因此EPO基 因序列多态性可能与不同个体间对低氧适应性具有差异性。针对位于人类EPO基因全序列 第3541bp处，在EPO基因3'端增强子上，一个T/G单核苷酸多态性，即SNP/T3541G的研究 表明，在EPO基因 T354IG位点的三种基因型：TT型、TG型、GG型中，携带T等位基因的人群 低氧适应能力较GG型更强。
[0011] 目前常用的基因检测方法有：直接测序（direct sequencing, DS)、连接酶检测 反应（ligase detection reaction, LDR)、限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP)、变性高效液相色谱分析（denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC)、定量 PCR，其中利用 DNA 分析仪直接测序是 金标准，但是上述方法分别存在着成本高、准确率低、操作繁琐和重复性差等问题。
[0012] 本试剂盒采用聚合酶链式反应-连接酶检测反应（polymerase chain reaction-ligase detection reaction，PCR_LDR)结合毛细管电泳技术来检测3个运动能 力相关基因，LDR的原理是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别，若高温连接酶一 旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着单个核苷酸的错配，即会阻止杂 交探针的连接。该方法灵敏度高、判读清晰准确、采样方便，相对测序法一次出一个序列， PCR-LDR连接酶反应整合了多个位点使用测序仪完成既保证了准确率又节约了时间，大大 节约了人力物力和时间。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的是提供一种同时检测3个运动能力相关基因的PCR-LDR检测试剂盒
[0014] 为了实现上述目的，该试剂盒包括PCR扩增和LDR反应试剂；包括3对PCR引物和 3组检测探针。
[0015] 本发明以ACTN3、CKMM和EPO等3个基因的基因型为检测对象，通过对上述运动基 因的扩增和毛细管电泳，与基因分型标准物的对比，3小时内即可筛选出含有上述位点突变 的个体。本试剂盒首次采用复合LDR连接酶检测反应，同时对ACTN3、CKMM和EP03个基因 进行PCR-LDR扩增，而后经毛细管电泳后分析片段大小，即可实现对3个基因位点的同时检 测。该方法灵敏度高，判读清晰准确；相对传统测序技术，本试剂盒能完成一次性获得3个 关键耳聋基因突变诊断结果的高通量筛查，具有经济、高效和高准确率等优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 本发明分型完整清晰，结果如图1-7所示：
[0017] 图1 :26号样本血斑来源DNA使用本试剂盒进行测序分型后结果，其中ACTN3、 CKMM、EPO三个基因的分型结果依次为：CC纯合、A/G杂合、T/G杂合，与测序结果一致。提 示该个体具有较好的爆发力、较好的训练敏感性和较强的低氧适应能力。
[0018] 图2 :81号样本血斑来源DNA使用本试剂盒进行测序分型后结果，其中ACTN3、 CKMM、EP0三个基因的分型结果依次为：(：/1\6/6、1'/1'，与测序结果一致。提示该个体具有较 好的爆发力和较强的低氧适应能力。
[0019] 图3 :90号样本血斑来源DNA使用本试剂盒进行测序分型后结果，其中ACTN3、 CKMM、EP0三个基因的分型结果依次为：1'/1'4/^、6/6，与测序结果一致。提示该个体具有较 好的训练敏感性。
[0020] 图4 :56号样本血斑来源DNA直接测序结果，其中ACTN3基因型为，C/T，提示该个 体具有较好的爆发力。
[0021] 图5 :56号样本血斑来源DNA直接测序后结果，其中CKMM基因型为：A/G(利用反 向序列设计测序引物），提示该个体具有较好的训练敏感性。
[0022] 图6 :56号样本血斑来源DNA测序分型后结果，EPO基因型为：T/G，提示该个体具 有较强的低氧适应能力。
[0023] 图7 :56号样本血斑来源DNA使用本试剂盒进行测序分型后结果，其中ACTN3、 CKMM、EP0三个基因的分型结果依次为：(：/1'4/63/6，与测序结果一致。提示该个体具有较 好的爆发力、较好的训练敏感性和较强的低氧适应能力。
[0024] 图 8 :凝胶电泳图，泳道从左至右为 IOOObp Marker，CKMM(359bp)，ACTN3(560bp) 及 EP0(405bp)。
【具体实施方式】
[0025] 1.基因组DNA准备
[0026] 待检样品选用磁珠或Chelex-IOO法提取基因组DNA，提取的样品基因组DNA定量 在约 lng/ul-10ng/ul。
[0027] 2. PCR 反应：
[0028] 按如下过程实验：
[0029] 体系：25ul
[0030]
【权利要求】
1. 一种同时检测3个运动基因的PCR-LDR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包 装盒体（I)，PCR扩增和LDR反应试剂； 所述PCR扩增试剂分别为PCR扩增ReactionMix (2)和（3);所述LDR反应试剂为LDR 反应 ProbeMix (4)和（5); 所述3个运动能力相关基因为ACTN3C>T，CKMMA>G，EP0T>G ; 实验所需模板和引物如下： 其中用于ACTN3基因目的片段长度为560bp，其引物序列如下： ACTN3F:GCCACCCACAACTTTAGGCT ACTN3R:CATATACAGATGAGCCCGAG 用于CKMM基因目的片段长度为359bp，其引物序列如下： CKMMF:GGGATGCTCAGACTCACAGA CKMMR:AACTTGAATTTAGCCCAACG 用于EPO基因目的片段长度为405bp，其引物序列如下： EPO-F:ACTCTTGGCTTTTCTGTTTTCTGGG EPO-R:GTGTGGCATCAGCCGAAGAGAC 用于ACTN3T>C突变基因位点检测的特异探针为： ACTN3_M:5' P-GTCAGCCTCGGGCAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC ACTN3_C:TTTTTTTTTTCCCATGATGGCACCTCGCTCTCG ACTN3_T:TTTTTTTTTTTTTCCCATGATGGCACCTCGCTCTCA 用于CKMMA>G突变基因位点检测的特异探针为： CKMM_M: 5J P-TGGCTCCCCATTTCTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC CKMM_A:TTTTTTTTTTTTTTCCAGTCCCTTACTTTCTCAAGAACCTGCCA CKMM_G:TTTTTTTTTTTTTTTTTCCAGTCCCTTACTTTCTCAAGAACCTGCCG 用于EP0T3541G突变位点检测的特异探针为 ： EP0_M: 5 ' P-CACCTTATTGACCAGCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC EP0_T:TTTTTTTTTTTTTTCTGCGGTGAGGCCTTGAATGGAGA EP0_G:TTTTTTTTTTTTTTTTTCTGCGGTGAGGCCTTGAATGGAGCo
【文档编号】C12Q1/68GK104313147SQ201410558366
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月20日 优先权日:2014年10月20日
【发明者】步迅, 张全芳, 刘艳艳, 夏子芳 申请人:山东省农业科学院生物技术研究中心