专利名称：：人TCRVβ7.1_H3F7基因及其筛选方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因序列，具体涉及人类T细胞抗原受体TCRV07.1—H3F7基因的序列及其筛选方法和应用。
背景技术：
：由于放疗和化疗对机体造成的严重性伤害以及效果的不如人意，生物治疗越来越成为肿瘤治疗研究的主要目标，其中免疫疗法是肿瘤生物治疗的一个主要组成部分。机体免疫系统产生的抗肿瘤免疫应答主要包括细胞免疫和体液免疫两大类，其中T细胞介导的细胞免疫应答是抗肿瘤细胞免疫的重要组成部分。T淋巴细胞是体内细胞免疫进行抗原识别的主要细胞群体，特定的抗原只能由特定氨基酸序列组成的T细胞抗原受体TCR识别，机体通过特定的TCR对肿瘤细胞特异性识别并杀伤肿瘤细胞。TCR是T细胞表面的特征性标志分子，是T细胞进行抗原识别，发挥细胞免疫重要功能的基础。TCR以非共价键形式与T细胞所特有CD3分子结合，组成具有跨膜结构的TCR-CD3复合体。TCR识别抗原所产生的活化信号由CD3分子转导至T细胞内。通常情况下TCR分子不能直接识别蛋白质抗原表位，只能识别特异性的抗原肽-MHC分子复合物，因此其识别过程具有抗原肽表位和自身腿C分子多态性部位的双特异性。MHC分子被认为是TCR进行抗原表位识别过程中不可缺少的辅助分子，其主要功能有提供TCR识别的必需的位点，增加识别过程中T细胞与相关分子结合的敏感性和牢固性，提供T细胞活化的辅助信号等等。MHC限制性的TCR对抗原肽的识别经典模式是，CD8+TCRaP+T细胞识别MHCI类分子结合的抗原肽，此类抗原肽长度一般为810个氨基酸。另一种识别模式是CD4+TCRa0+T细胞识别MHCII类分子结合的抗原肽，与fflCI类分子的凹槽两端封闭不同，由于II类分子的凹槽两端开放，可以容纳的抗原肽长度变化较大，为13-17个氨基酸残基甚至更多，由于结构上的差异，使II类分子所容纳的抗原肽的共同基序的结构远比I类分子复杂。TCR分子由两条不同肽链构成，二者均是跨膜蛋白，并由一条二硫键相连组成异二聚体结构，TCR的肽链有ci、P、y、5四种类型，根据TCR肽链的组合，可将人外周血中的T细胞分为两类，即TCRa3+T细胞和TCRYS+T细胞，其中TCRaP+T细胞的数量占绝大多数，在抗原肽识别发挥特异性细胞免疫过程中发挥着重要作用。TCRa基因TCRA定位在染色体的14q11-12位，TCRP基因TCRB定位于染色体的7q32-35位，TCRA包括v、J和C三个基因片段，而TCRB由V、D、J、C四个基因片段组成，V、D、J基因片段连在一起编码TCR分子肽链的可变区V区，C基因片段编码TCR分子肽链的恒定区C区。TCR基因与一般基因有着很大的不同，即其需要具有高度的可变性用于识别千差万别的抗原，这就需要TCR基因在胚系基因的发育过程中经历基因重排这一重要过程。TCR的胚系基因片段，特别是V和J，数目有很多种，在T细胞发育成熟的过程中，这些基因片段发生不同的重排和组合，产生数量巨大、识别特异性抗原的TCR。TCRA包括70-80个V基因片段，被分为41个家族，TCRA包括61个J基因片段，其中有50个为有功能的基因，TCRA还包括一个编码TCRa链恒定区的C基因片段。对于TCRB，比较权威的说法是TCRVP基因片段有65个，其中19个为假基因pseudogene，有功能的基因片段为46个，这46个TCRVe基因片段根据其序列相似性程度高低，将序列一致性低于75%的基因划分为不同家族，共得到了23个TCRVP基因家族，而序列一致性高于75%的片段为同一家族的亚家族，相关知识可见于RowenL,KoopBF，HoodLThecomplete685-kilobaseDNAsequenceofthehumanbetaTcellreceptorlocus.Science1996;272:1755-1762。TCRB还包括2个D基因片段、13个J基因片段和两个编码TCR3链恒定区的C基因片段。TCR基因的重排一般规律是在未成熟的T细胞中首先发生(D)J基因重排，然后V(D)J基因重排，在基因水平上进行，当TCRV基因重排完成后，在转录水平上实现V(D)J基因与C基因的重排，通过真核mRNA的剪接机制，最后得到成熟的包含V(D)JC基因片段的m脂A，经翻译组装成为完整的一条TCR肽链。因为众多的V、(D)、J基因片段只选一个参与重排，可以产生众多的V区基因片段组合，同时在V、(D)、J基因片段重排后的连接处可以丢失或N-核苷酸插入即加入数个核苷酸，以上机制显著增加了TCR的多样性。TCRa链和曰链都需要经过基因重排过程后，二者再进行组合装配，这样会产生更多的多样性。在T细胞的发育过程中一般TCRg链的重排进行过程中是与前TCRci组合进行发育，待TCR3链基因重排完成之后，才会进行成熟TCRa链的基因重排，这样最终发育成熟的T细胞表达的同一个TCR3链可能与多个不同的TCRa链进行组合，而对于每一个TCRa链来说，其只能与一种TCRP链进行组合。对不同基因片段多种连接的可能性和几种产生连接多样化的机制导致了识别抗原TCR的多样性。TCRa链和P链都由可变区V区和恒定区C区两部分组成，V区是识别抗原肽/MHC复合物pMHC的关键部位，TCRci链和P链的V区各含有三个与免疫球蛋白的V区结构类似的高变区，也称互补决定区CDR，一般用CDR1、CDR2和CDR3表示，另外，TC歸链还含有第四个高变区HV4或CDR4;TCRVcc链由TCRA基因V、J片段重排后转录翻译得到，TCRVe链由TCRB基因的V、D、J片段编码得到，其中CDR1、CDR2和HV4这三部分由V基因片段编码得到，而CDR3区存在比其他三区更高的变化程度，其是由V、(D)、J片段的重排连接后的基因片段编码而成，由于连接处可随机插入或丢失数个核苷酸，使最终翻译得到的CDR3区高度变化，因此要得到两个氨基酸序列完全相同的CDR3区几乎不太可能。已有众多的研究发现，TCR分子的V区中的CDR1和CDR2区在抗原识别过程中与腿C分子的识别密切相关，而HV4区在超抗原与TCRVP链的结合时发挥重要作用，但真正起到对抗原肽特异性识别作用的主要还是CDR3区，相关知识可见于GarciaKC,TeytonL，WilsonIA.StructuralbasisofTcellrecognition.AnnuRevImmunol,1999，17:369397。由于TCRci链和3链的V、(D)、J基因片段重排时会发生n-核苷酸的随机插入或删除，这样最后生成的TCRV区的CDR3出现同一序列的可能性极低，且各序列组成也无规律性可言，这样就无法对最终生成的TCR分子进行规类，于是就按照编码CDR1、CDR2及HV4区的TCRV基因片段对TCR分子进行规类，依照V基因片段序列的一致性差别归为不同的家族和亚家族，进行TCR分子的V基因的家族规类多是用来分析T细胞出现了针对某一种或某一类抗原出现的克隆增殖现象，其中以对V3基因的分析和研究最为多见。成熟的T细胞由胸腺组织向外周血输出，这些原始T细胞上TCRVa0分子的家族分步是呈现一定规律的，主要表现为Va和V3基因各家族比较均匀的平均分布现象，有部分家族略微比其他家族高，这一特征反应了机体免疫系统在未遇到特定抗原时的T细胞群体分布特点。当机体遇到外来抗原剌激后，相同或相似的抗原决定簇会驱使T细胞的群体分布发生改变，发生针对特定抗原决定簇的T细胞亚群的克隆性扩增现象，如果是针对同一个抗原决定簇的克隆扩增即为单克隆T细胞群，这些T细胞具有序列完全相同的TCRVa0分子，如果特定抗原的决定簇不只一个，则出现的T细胞扩增为寡克隆或多克隆，这些T细胞表达的TCRVa3分子氨基酸序列不完全相同。如果知道了这些异常TCRVcxp分子在机体免疫功能中所发挥的作用就可以加以利用，如果是有益的功能，就能利用这些特定TCRVci3基因修饰改造T细胞，制备出大量表达这种TCRVa3分子的效应细胞用于治疗；如果这种TCRVcie分子对机体是有害的，可以设计出针对这种克隆性T细胞的基因疫苗，用于清除这些有害的T细胞克隆。筛选肿瘤特异性TCR的一般方法是利用比较明确的肿瘤特异性抗原肽筛选单克隆的T淋巴细胞，再进行TCR基因的分析，但由于肿瘤特异性抗原的筛选异常困难，目前发现的一些肿瘤特异性抗原大多都是从人恶性黑色素瘤细胞中分离获得的，相应的TCR基因的筛选也都是针对黑色素瘤细胞的，MARYBETHS等人利用人工合成HLA-A2分子四聚体呈递下的黑色素瘤MART-1抗原肽筛选针对MART-1的T细胞克隆，得到一株MART-1反应性T细胞克隆M1F12，分析其TCR基因为TCRVa35"10.3，利用类似的方法RichardA.Morgan等人筛选出针对黑色素瘤gplOO抗原肽的TCR基因TCRVa19V312.3，进一步实验证实，这些TCR基因确能改造成熟T细胞，表达肿瘤抗原特异性TCR基因的T细胞在体外细胞学及荷瘤小鼠实验中都表现出较强的抗肿瘤活性。目前针对肝癌特定肿瘤抗原的TCR基因筛选还未见报道。而肝癌又是严重威胁人类健康的疾病，寻找到对症的TCR基因进行生物免疫疗法是非常重要和迫在眉睫的。
发明内容本发明的一个目的是提供一种人TCRVP7.1—H3F7基因。本发明另一个目的是提供所述基因的筛选扩增方法。本发明还有一个目的是提供所述人TCRVe7.1—H3F7基因的应用。本发明的技术方案是提供一种人TCRV37.1—H3F7基因，其基因序列由942个碱基组成，蛋白序列由312个氨基酸组成，序列表如下1-ATCGCJCTGCACJGCTGCTCTGCTCTGCGGnCTCTCTCTCCTGGGAGCAGTTCCCATAGAC-60l-M&CRLLCCAVLCLLGAVFID-2061-ACTGMGnACCCAGACACCAMACACCTWTCATc;GGAATGAC雄TAAGMGTCTTTG-12021-TEVTQTFKHLVMGMTNKKSL-40121-雄TCTGAACAACATATdGCACAGGGCTATGTATTGGTACAAGCAGAMGCTAA(;AAG-ISO'41-KCEQHMGHRAMYWYKQKAKK-S0181-CCACCGGAGCTCATGTTTGTCTACAGCTATCAGMACTCTCTATAMTCAAAGTGTGCCA-24061-PPELMFVYSYEKLSiriESVP-80241-AGTCGCTTCTCACCTCAATGCCCCAACAGCTCTCTCTTAAACCTTCACCTACACGCCCTG-30081-SRFSPECFNSSLLJfLHLHAL-100301—CAGCCAGMGACTCAGCCCTCTATCTCTCCWXAGCAGCCAAGCCGGGACAGGGMCACC-3S0101-QPEDSALYLCASSQAGTGNT-120361-GMGAGCTGTnTTTGGAGAAGGCTaAGGaGACCGTACTGGAGGACCTCMAAACGTG—420121-GELFFGEGSELTVLEDLKNV-140421-nCCCACCCGAGGTCGCTCTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAG-480141-FPPEVAVFEPSEAEISHTQK-160481-GCCACACTCGTCTGCCTCGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGrcGAGCTCAGCTCGTGG-5401S1-ATLVCLATGFYPDHVELSWW-180541-GTC'MTGGGAAGGAGGTCCACAGTCGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCMGGAGCAG-600181-VNGKEVHSGVSTDPQFLKEQ-200601-CCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTC-S60201-PALNDSRYCLSSKLKVSATF-220S61-TGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTCTCMGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAAT-720221-邻QNPRIfHFRCQVQFYGLSEN-240721-GACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCMACCTCTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGG-780241-DEWTQDRAKPVTQIVSAEAW-260781-GGTAGAGCAGACTGTCGCnCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACC-,261-GRADCGFTSESYQQGVLSAT-280841-ATCCTaATGAGATCTTGCTAGWMGGCCACCTTGTATGCiXTGCTGGTCAGTGCCCTC-900231-ILYEILLGKATLYAVLVSAL-300901-GTGCTGArcGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAG-942301-VLMAfflVKEKDSRG*X-320本发明同时提供了所述的基因的筛选扩增方法，包括以下步骤:(1)T淋巴细胞中提取细胞总RNA，转录成cDNA;(2)设计引物，以cDNA为模板进行PCR扩增反应；(3)扩增获得的产物基因克隆入表达载体pcDNA-kan上；(4)用限制性核酸内切酶EcoRI和HindIII将TCR基因和载体pcDNA-kan进行双酶切，再用T4DNA连接酶进行连接，最后在含卡那霉素的LB平板上筛选含重组质粒的阳性克隆细菌，将筛选得到的重组子进行测序。其中，步骤(2)所述引物为V7CK和C2CK，其序列如下V7CK:ATTGAATTC+GCC+ATGGGCTGCAGGCTGCTCTGCC2CK:GCCAAGCTT+CTAGCCTCTGGAATCCTTTCT引物前端都含有3个保护碱基序列，V7CK引物中还含有限制性内切酶EcoRI的序列和Kozark序列，C2CK引物中含有限制性内切酶HindIII的序列。步骤(3)所述克隆选用pcDNA-kan载体多克隆位点中的EcoRI和HindIII位点为基因插入位点。步骤(4)所述测序以T7通用引物和BGH反向测序引物作为测序引物。本发明提供了所述基因的应用，用所述基因转染T细胞，能增强其肿瘤识别和增强杀伤作用，基于这种作用，所述基因可应用于制备抗肝癌疫苗及其他药物。利用RT-PCR结合Southern杂交技术，本申请人在检测T细胞TCRP链V区亚家族表达情况中发现，相对于正常人，肝癌患者的TCR基因表达均有不同程度的减弱，即优势表达一个或少数几个TCRVβ亚家族，同时其它TCRVP亚家族显著减少或完全缺如，即有受体偏移现象。因此致使T细胞对于肿瘤抗原的识别及应答能力减弱，从而造成了肿瘤细胞的大量增值并引起一系列的严重症状。因此将此缺失的TCRV3基因，采用体外转染外周血单个核细胞以增强TCR识别抗原递呈细胞(antigenpresentcell,APC)提呈的肿瘤抗原的能力，可促进细胞毒性T细胞CTL活化，从而恢复对肿瘤细胞的识别与杀伤功能，最终全面恢复肿瘤患者的细胞免疫功能。本发明的有益效果是(1)提供了一种全新的基因序列，填补了本领域空白；(2)克隆出部分TCRVP7.l基因，并进行序列测定，有利于对l基因生物学研究；(3)为制备抗肿瘤疫苗、药物的研制提供必要的基础与技术实现手段，并提供了攻克肝癌的可靠前景。图lT7引物的测序结果(部分)图2BGH反向引物测序结果(部分)图3TCRVe7.1—H3F7基因序列图4TCRVe7.1—H3F7基因在未经转染T淋巴细胞上的表达情况图5TCRVP7.1—H3F7基因在转染组T淋巴细胞上的表达情况图6共聚焦显微镜检测TCRV37.1—H3F7基因转染前后在T细胞表面的表达情况图7双荧光标记激光共聚焦显微镜检测肿瘤细胞周围淋巴细胞浸润的情况图8倒置相差显微镜观察TCRVe7.1—H3F7基因转染T细胞对肿瘤细胞的杀伤情况图9TCRV67.1—H3F7基因转染T细胞作用肿瘤细胞后肿瘤细胞DNALadder检测图图10电镜观察TCRVP7.1—H3F7基因转染T细胞作用后肿瘤细胞核变图图11TCRV37.1_H3F7基因修饰的T细胞局部注射荷瘤SCID小鼠抗癌效果图图12TCRV07.1一H3F7基因转染T淋巴细胞作用荷瘤动物后肿瘤组织中淋巴细胞浸润图，HE染色，其中左上图为10X，右上图和左下图皆为100X图13免疫组化检测肿瘤组织中TCRVP7.1—H3F7基因转染T淋巴细胞的TCRV07.1一H3F7基因的表达情况，其中左图为10X，右图为40X图14荷瘤动物其它正常组织中无淋巴细胞浸润图，HE染色其中左图为脑组织40X，右图为肺组织40X，下图为肾组织40X具体实施例方式下面结合附图和具体实施例来进一步说明本发明。实施例l:利用基因优势取用的方法筛选出抗肝癌特异性TCRe基因收集肝癌患者和健康人的外周血单核细胞，分别和肝癌细胞共培养剌激后分离T淋巴细胞，然后用PBS将细胞洗两遍，细胞总RNA提取按照Invitrogen公司试剂盒提供的方法进行，用反转录试剂盒将提取的总RNA合成cDNA。分别设计合成TCR3基因家族26个家族成员的CDR3引物，以以上两种细胞中抽提总RNA反转录成的cDNA为模板进行PCR扩增反应。将扩增获得的产物利用浓度1.2%琼脂糖凝胶电泳分离后，选取保守序列设计并合成地高辛标记的探针进行Southern杂交并显影成像，发现健康人来源的T淋巴细胞经肝癌细胞刺激后，TCR0基因出现随机的扩增；而肝癌患者来源的T淋巴细胞经肝癌细胞刺激后，仅TCR日7.1亚家族出现明显扩增表达。实施例2:利用PCR方法扩增出完整的TCRVP7.1基因根据TCRV07.1亚家族的保守序列，设计扩增TCRV37.1基因家族编码序列的引物V7CK:ATTGAATTC+GCC+ATGGGCTGCAGGCTGCTCTGCC2CK:GCCAAGCTT+CTAGCCTCTGGAATCCTTTCT引物前端都含有3个保护碱基序列，V7CK引物中含有限制性内切酶EcoRI的序列，C2CK引物中含有限制性内切酶Hind111的序列，V7CK引物中还含有Kozark序列。从正常人血液样本，经过淋巴细胞分离——淋巴细胞RNA的提取——提取后RNA的逆转录一一PCR扩增这一系列的程序，最后将TCR07.1基因克隆入表达载体pcDNA-kan上。选用pcDNA-kan载体多克隆位点中的EcoRI和HindIII位点为基因插入位点，先以引物V7CK和C2CK从cDNA中扩增得到TCR基因，然后分别用限制性核酸内切酶EcoRI和HindI工I将TCR基因和载体pcDNA-kan进行双酶切，再用T4DNA连接酶进行连接，最后在含卡那霉素的LB平板上筛选含重组质粒的阳性克隆细菌。以T7通用引物和BGH反向测序引物作为测序引物，将筛选得到的重组子进行测序。经测序验证后，我们总共得到20个属于TCRP7.1基因家族的克隆，测序部分结果见图1和图2。随后我们进行了一系列的体外抗肿瘤实验，发现其中一个克隆的抗肿瘤效果特别明显，我们将此基因命名为TCRP7.1—H3F7，其完整编码序列以及氨基酸序列见附图3，其基因序列由942个碱基组成，蛋白序列由312个氨基酸组成，其基因序列表见图3。实施例3:TCRV37.1—H3F7基因修饰的T细胞体外诱导肝癌细胞的凋亡识别肝癌的特异性TCRVP7.1—H3F7基因转染T细胞后，流式细胞仪和激光共聚焦光镜检测，证实了TCRV07.1一H3F7分子的表达占优势地位，见图4-图8，图6中左图为对照组，右图为TCRVe7.1—H3F7基因转染组。图7中左图为TCRV日7.1—H3F7转基因T细胞与肝癌细胞作用后激光共聚焦显微镜示意图；右图为计算机软件分析示意图，柱状部分为T细胞与肝癌细胞特异性结合，结合较为紧密，其它为非特异。图8中左图为未转染T细胞组，右图为TCRVe7.l基因转染T细胞组。与肝癌细胞共培养，DNALadder检测，发现转染TCRV7.1—H3F7基因的实验组，肝癌细胞出现典型的凋亡DNALadder,电镜超微结构显示，只有TCRV07.1一H3F7基因转染组的肝癌细胞出现凋亡小体，见图9-10。图9中，1:正常肿瘤细胞；2:未转染T细胞作用组，1X107;3:TCRV37.1—H3F7基因转染T细胞作用组1，1X106;4:TCRV37.1JBF7基因转染T细胞作用组2，1X107;5:TCRVe7.1—H3F7基因转染T细胞作用组3，5Xl()8;6:TCRVe7.1—H3F7基因转染T细胞作用组4，1X108;7:TCRVe7.1—H3F7基因转染T细胞作用组5，1X109;8:DNAMarker。结果显示TCRVP7.1—H3F7基因转染的T细胞能增强其肿瘤识别和增强杀伤作用。实施例4:TCRVP7.1—H3F7基因修饰的T细胞局部注射荷瘤SCID小鼠表现出明显的抗癌效果经过长期深入的研究，本申请人己完成150只SCID鼠荷瘤模型的建立，初步观察了特异性TCR基因转染T细胞后的抗肝癌效果。实验组与对照组相比，对照组小鼠的瘤块继续增大，实验组瘤块逐渐减小，肝癌细胞生长明显抑制或消失，癌巢中与肿瘤周围及肝汇管区有大量淋巴细胞浸润并包围癌巢，而其他组织无淋巴细胞浸润。见图11-14。图11中，A对照组，B单纯PBMC组，CTCR7.l基因转基因组。同时，对各组荷瘤SCID鼠的存活时间及给药最大耐受剂量进行研究，摸索出较好的实验条件，见表l、表2。表1.脂质体ZTCRV^7.1—H3F7重组质粒转染PBMC小鼠iv给药后动物存活数细胞浓度107ml剂量(ul/只)开始动物数(只)死亡数(只)40022200201002050202520表2.脂质体/TCRV37.1—H3F7重组质粒转染PBMC小鼠iv给药后死亡时间分布<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><400>1atgggctgcMetGlv1Cys鄉ctg5etcLeutgcCystgtCysgcgAlagttVal10etcLeutgtCysetcLeuctgLeuggaGly15gcaAla48gttcccatagacactgaagttacccagacaccaaaacacctggtcatgValProlieAspThrGluValThrGinThrProLysHisLeuValMet20253096ggaatgacaaat￡iagaagtctttgaaatgtgaacaacatatggggcacGlyMetThrAsnLysLysSerLeuLysCysGluGinHisMetGlyHis354045144agggetatgtattggtacaagcagaaagetaagaagccaccggagetcArgAlaMetTyrTrpTyrLysGinLysAlaLysLysProProGluLeu505^60192atgtttgtctacagetatgagaaaetctctataaatgaaagtgtgccaMetPheValTyrSerTyrGiuLysLeuSerlieAsnGluSerValPro65707580240agtcgcttcteacctgaatgccccaacagetctetcttaaaccttcacSerArgPheSerProGluCysProAsnSerSerLeuLeuAsnLeuHis859095288etacacgccctgcagccagaagacteagccctgtatetctgcgccageLeuHisAiaLeuGinProGluAspSer人laLeuTyrLeuCys人laSer100105110336agecaagccgggacagggaacaccggggagctgttttttggagaaggcSerGinAlaGlyThrGlyAsnThrGlyGluLeuPhePheGlyGluGly115120125384tctaggctgaccgtactggaggacctgaaaaacgtgttcccacccgagSerArgLeuThrValLeuGluAspLeuLysAsnValPheProProGlu130135140432gtcgetgtgtttgagccateagaagcagagateteccacacccaaaagValAlaValPheGluProSerGluAlaGlulieSerHisThrGinLys145150155160480gccacactggtgtgcctggccacaggcttctaccccgaccacgtggagAlaThrLeuValCysLeuAlaThrG丄yPheTyrProAspHisValGlu165170175528ctgagetggtgggtgemtgggaaggaggtgcacagtggggtcage混LeuSerTrpTrpValAsnGLyLysGluValHisSerGlyValSerThr賜L85190576gacccgcagcccetc幼ggagcagcccgccetcaatgactecagatacAspProGLnProLeuLysGluGinProAlaLeuAsnAspSerArgTyr19520020562418Untitled.ST25.txtSEQUENCELISTINGaio〉广东药学院<120>人TCRVP7.1—H3F7基因及其筛选方法和应用<130〉<160〉2<170>Patentlnversion3-2<210>1<211〉942<212〉DNA<213〉人工序列CDS(942)oli-es-2tgcctgageagecgcctgagggtcteggccCysLeuSerSerArgLeuArgValSerA丄a210215Untitled.ST25.txtaccttctggcagaaccccThrPheTrpGinAsnPro220cgcaaccacttccgctgtcaagtccagttct.acgggetcteggagaat.ArgAsnHisPheArgCysGinValGLnPheTyrG丄yLeuSerGluAsn225230235240gacgagtggacccaggatagggccaaacct.gtcacccagategtcageAspGluTrpTh:rGinAspArgAlaLysProValThrGinlieValSer245250255gccgaggcctggggtagagcagactgtggcttcacctecgagtcttacAlaGluMaTrpGlyArgAlaAspCysGlyPheThrSerGluSerTyr260265270cagcaaggggtcctgtctgccaccateetctatgagatettgetagggGinGinGlyValLeuSerAlaThrlieLeuTyrGlulieLeuLeuGly275280285aaggccaccttgtatgccgtgctggtcagtgccetcgtgctgatggccLysAlaThrLeuTyrAlaValLeuValSerAlaLeuValLeuMetAla290295300grtggtcaagagaaaggattec￡igaggctagMetValLysArgLysAspSerArg6iy305310<210〉<211><212><213〉2313PRT人工序列《歸2MetGlyCysArg1LeuLeu5CysCysAlaValLeuCysLeuLeu10Gly15AlaValProlieAspThrGluValThrGinThrProLysHisLeuValMet202530GlyMetThrAsnLysLysSerLeuLysCysGluGinHisMetGLy〖Us354045ArgAlaMetTyrTrpTyrLysGinLysAlaLysLysProProGluLeu505560MetPheVal-TyrSerTyrGluLysLeuSerlieAsnGiuSerValPro65707580SerArgPheSerProGluCysProAsnSerSerLeuLeuAsnLeuHis859095LeuHisAlaLeuGinProGluAspSerAlaLeuTyrLeuCysAlaSerL00105110SerG丄nAlaGlyThrGlyAsnThrGlyGluLeuPhePheGlyGluGly115120125SerArgLeuThrValLeuGluAspLeuLysAsnValPheProProGluL30L35140ValAlaValPheGluProSerGluAlaGlulieSe:rHisThrG丄nLys14515015516067272076S816864912942AlaThrLeuValCysLeuAlaThrGLyPheTyr165170Untitled.ST25.txtProAspHisValGlu丄75LeuSerTrpTrpValAsnGlyLysGluValHisSerGlyValSerThrL80185i90AspProGinProLeuLysGluGinProAlaLeuAsnAspSerArgTyr195200205CysLeuSerSerArgLeuArgValSerAlaThrPheTrpGinAsnPro210215220ArgAsnHisPheArgCysGinValGinPheTyrGlyLeuSerG丄uAsn225230235240AspGLuTrpThrGinAspArgAlaLysProValThrGLnlieValSer245250255AlaGluAlaTrpGlyArgAlaAspCysGlyPheThrSerGluSerTyr260265270GinGinGlyValLeuSerAlaThrlieLeuTyrGlulieLeuLeuGly275280285LysAlaThrLeuTyrAlaValLeuValSerAlaLeuValUuMetAla290295300MetValLysArgLysAspSerArgGly305310权利要求1、一种人TCRβ7.1_H3F7基因，其特征是基因序列由942个碱基组成，蛋白序列由312个氨基酸组成，序列表如SEQIDNO1。2、一种权利要求1所述的基因的筛选扩增方法，其特征是包括以下步骤(1)T淋巴细胞中提取细胞总RNA，转录成cDNA;(2)设计引物，以cDNA为模板进行PCR扩增反应；(3)扩增获得的产物基因克隆入表达载体pcDNA-kan上；(4)用限制性核酸内切酶EcoRI和HindIII将TCR基因和载体pcDNA-kan进行双酶切，再用T4DNA连接酶进行连接，最后在含卡那霉素的LB平板上筛选含重组质粒的阳性克隆细菌，将筛选得到的重组子进行测序。3、根据权利要求2所述的方法，其特征是步骤(2)所述引物为V7CK和C2CK，其序列如下V7CK:ATTGAATTC+GCC+ATGGGCTGCAGGCTGCTCTGCC2CK:GCCMGCTT+CTAGCCTCTGGMTCCTTTCT引物前端都含有3个保护碱基序列，V7CK引物中还含有限制性内切酶EcoRI的序列和Kozark序列，C2CK引物中含有限制性内切酶HindIII的序列。4、根据权利要求2所述的方法，其特征是步骤(3)所述克隆选用pcDNA-kan载体多克隆位点中的EcoRI和HindIII位点为基因插入位点。5、根据权利要求2所述的方法，其特征是步骤(4)所述测序以T7通用引物和BGH反向测序引物作为测序引物。6、一种权利要求1所述基因的应用，其特征是在制备能识别肿瘤和杀伤肿瘤药物方面的应用。7、根据权利要求6所述基因的应用，其特征是应用于制备抗肝癌药物或疫苗方面的应用。全文摘要本发明公开了一种新的人类TCRVβ7.1_H3F7基因，提供了其基因序列表，本发明同时提供了所述基因的筛选扩增办法以及应用，为制备抗肝癌肿瘤疫苗及其他药物的研制提供必要的基础与技术实现手段，并提供了攻克肝癌的可靠前景。文档编号A61P35/00GK101100666SQ20071002874公开日2008年1月9日申请日期2007年6月22日优先权日2007年6月22日发明者吴凤麟,晗沈,肖兰凤,邵红伟,伟陈,黄树林申请人:广东药学院