专利名称：DLK1基因的用途以及siRNA、BM-MSCs和FGF2的制作方法
技术领域：
本发明涉及肝脏纤维化治疗领域，特别涉及DLKl作为靶点在肝脏纤维化治疗中 的用途。
背景技术：
肝炎、肝代谢性疾病以及由此产生的肝纤维化和肝硬化是临床常见病，近年来调 查显示，因肝病导致死亡的人数逐年增加，各种肝脏疾病已经成为影响人类寿命的一个重 要原因。对于肝脏疾病仍缺乏理想的治疗措施，约10%的病人最终因为肝功能衰竭去世。 目前针对各种急慢性肝病，采取维持和支持疗法；原位肝移植因供肝缺乏，费用昂贵，尚存 在免疫排斥问题，故其临床价值受限，受益者极少；生物人工肝和肝细胞移植同样因为肝细 胞来源有限而不能在临床上发挥更大作用。因此寻找有效的肝病治疗手段显得十分迫切。尽管不同的病因导致肝病的发病机制不同，但各种病因引起的慢性肝病大多都伴 有肝纤维化的发生，其中很大一部分会发展成为肝硬化甚至肝癌。肝脏纤维化本身是肝脏 对各种原因所导致慢性损伤的一种修复反应，其实质是肝脏修复过程中产生的细胞外基质 (ECM)过度沉积。众多研究显示，肝星状细胞(HSC)的活化是肝脏纤维化发生和发展的中心 环节。肝星状细胞又称储脂细胞、Ito细胞、维生素A储存细胞等，是肝脏间质细胞之一，位 于肝细胞与肝窦内皮细胞之间的窦周隙(Disse间隙)内，在正常情况下呈静止状态。在肝 脏损伤过程中各种因子能够刺激下，HSC能够活化，从而转化为具有伸缩功能的肌纤维样母 细胞，表达α -SMA并释放大量胞外基质，如I型胶原等。因此慢性肝病特别是肝硬化的防 治，其关键是降低肝脏纤维化程度，而抑制慢性损伤过程中HSC的活化无疑是一种有效的 治疗肝脏纤维化策略。近年来，在抑制HSC活化或诱导活化HSC凋亡方面已有一些研究，如研究表明 IFN-α ,IFN-Y均可抑制HSC增殖、活化；硒、锌制剂、金属硫蛋白、白藜芦醇、水飞蓟素及许 多中药都可通过抗氧化作用抑制HSC增殖、活化；干预三磷酸肌醇激酶、分裂原活化蛋白激 酶、蛋白激酶C、钠/氢(Na+/H+)交换及整合素等细胞内信号通路，可在一定程度上进行针 对HSC活化和肝脏纤维化的治疗。但总体而言，对于抑制肝损伤过程中HSC的活化仍缺乏 十分有效的药物或方法，因此发掘有效抑制HSC活化的新靶点，从而研制抗纤维化新药意 义重大。DLKl，又称为脂肪前体细胞因子1 (pref-Ι)，是一个具有6个表皮生长因子样重复 结构的跨膜蛋白，能够经蛋白酶水解而产生两种游离形式，大小分别为50kDa和25kDa。以 往众多研究表明DLKl主要参与脂肪细胞分化，能够抑制脂肪前体细胞向脂肪细胞分化。其 中主要由50kDa大小的游离形式发挥此项作用，而25kDa形式生物学功能目前还不清楚。此 外也有研究显示DLKl参与间质细胞定向、基质细胞和pre-B细胞相互作用以及祖细胞(成 肝细胞，肌卫星细胞)发育等生命活动。但目前DLKl是否参与慢性肝病中肝脏纤维化进程 尚不清楚。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种DLKl基因在作为治疗肝脏纤维化的靶点的 用途，以及用于治疗肝脏纤维化的siRNA、骨髓间充质干细胞和细胞因子FGF2。为了解决上述技术问题，本发明提供一种DLKl基因的用途作为治疗肝脏纤维化 靶点。作为本发明的DLKl基因的用途的改进以DLKl基因为靶点，设计相关药物降低 DLKl表达，抑制肝星状细胞活化，从而降低肝脏纤维化。本发明还同时提供了一种用于治疗肝脏纤维化的siRNA，其序列为5，-p. CCCUAUUAAUGCAUGAUAAdTdT-3，(正向)5，-P. UUAUCAUGCAUUAAUAGGGAG-3，(反向)。上述序列中P是表示在5’端进行了磷酸化修饰，“.”表示起连接作用；3 ‘dT悬 垂为了增加RNA稳定性。本发明还同时提供了上述siRNA在制备治疗肝脏纤维化的药物中的应用。本发明还同时提供了骨髓间充质干细胞在制备治疗肝脏纤维化的药物中的应用。本发明还同时提供了细胞因子FGF2在制备治疗肝脏纤维化的药物中的应用。本发明的发明人在肝脏损伤修复研究中，发现DLKl是一个与肝纤维化密切相关 的调控因子，是肝纤维化治疗的一种新分子靶点。表现在DLKl在正常肝脏中基本不表达， 慢性肝损中，DLKl表达明显上调且持续表达。体外实验证明DLKl能够促进HSC活化。体 内研究进一步表明，针对DLKl基因的化学合成siRNA、骨髓间充质肝细胞干细胞(BM-MSCs) 和细胞因子FGF2都能以DLKl为靶点，显著降低其表达，同时明显抑制HSC活化、降低肝脏 纤维化程度。由此说明，DLKl基因是肝脏损伤过程中抑制HSC活化、降低纤维化的有效靶 点，针对DLKl的siRNA、BM-MSCs和FGF2都是降低DLKl表达，从而治疗肝脏纤维化的有效 制剂。在本发明中，SiRNA可通过化学合成获得，骨髓间充质干细胞、碱性成纤维细胞生 长因子(FGF2)均可通过市购方式获得。本发明利用小鼠CCl4慢性肝损伤模型，首次证明以DLKl基因为靶点，通过尾静脉 注射针对DLKl基因的siRNA、BM-MSCs和FGF2能够抑制DLKl表达，从而显著抑制HSC活 化、降低肝纤维化程度。本发明的DLKl基因作为肝脏纤维化治疗新靶点的优势在于降低 DLKl基因的表达能够显著抑制HSC的活化、降低肝脏纤维化水平。siRNA的实际用法和用量如下将siRNA溶于PBS缓冲液中，然后按照4 6mgsiRNA/kg (体重)进行静脉注射。一般情况下，每50 μ g的siRNA溶解于Iml的PBS缓 冲液中。骨髓间充质干细胞的实际用法和用量如下将骨髓间充质干细胞悬浮于PBS缓冲 液中，然后按照3 3.5X107个将骨髓间充质干细胞/kg(体重)进行静脉注射。一般情 况下，每IO6个骨髓间充质干细胞溶解于100微升PBS缓冲液中。碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)的实际用法和用量如下将细胞因子FGF2溶于 PBS缓冲液中，然后按照40 60 μ g细胞因子FGF2/kg体重进行静脉注射。一般情况下，每 50 yg的细胞因子FGF2溶解于3. 3ml的PBS缓冲液中。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是慢性肝损伤小鼠肝脏中DLKl表达检测图；图1中，Normal和CC14分别表示正常和CCl4损伤小鼠肝脏。A, western blot检 测慢性损伤2天(2D)、1周(IW)、2周(2W)、3周(3W)和4周(4W)DLK1蛋白表达；B，对上面 western blot结果的光密度统计，以β -actin为内参。图2是体外DLKl活化HSC情况检测图；图2中，control、L和S分别表示正常HEK293细胞上清处理组、转染DLK1-L和 DLKl-S的HEK293上清处理组。A，RT-PCR检测新鲜分离和处理7天的HSC中脂肪性质基因 (PPAR γ )和活化标志基因(α -SMA和col I ( α 1))表达；B，荧光定量PCR检测α -SMA和 col Ι(α 1)基因表达变化，*表示与control组比较差显著(P < 0. 05) ；C,形态学观察处 理7天后HSC细胞中脂滴情况，免疫荧光检测α-SMA蛋白水平变化，Bar = IOOym5D,对于 C中α -SMA单位面积细胞上荧光强度进行统计，**表示与control组比较差异极显著(P < 0. 01)。图3是注射DLKl siRNA后DLKl表达检测图；图3中，CC14、PBS和siRNA分别表示CCl4损伤组、CCl4损伤后注射PBS的对照 组、CCl4损伤后注射SiRNA的实验组。**表示实验组与CC14损伤组比较差异极显著(P < 0. 01)。图4是注射DLKl siRNA后肝星状细胞活化标志检测图；图4中，CC14、PBS和siRNA分别表示CCl4损伤组、CCl4损伤后注射PBS的对照组、 CCl4损伤后注射SiRNA的实验组。*表示实验组与CC14损伤组比较差显著(P <0.05)，** 表示实验组与CC14损伤组比较差异极显著(P <0.01)；左图代表a-SMA(a平滑肌肌动 蛋白)mRNA表达变化，右图代表col I ( α 1) (I型胶原)mRNA表达变化。图5是注射DLKl siRNA后天狼猩红染色检测肝脏纤维化图；图5中，CC14、PBS和siRNA分别表示CCl4损伤组、CCl4损伤后注射PBS的对照组、 CCl4损伤后注射SiRNA的实验组。Bar = 50 μ m。图6是移植MSCs后DLKl表达检测图；图6中，CC14、PBS和MSCs分别表示CCl4损伤组、CCl4损伤后注射PBS的对照组、 CCl4损伤后移植MSCs的实验组。**表示实验组与CC14损伤组比较差异极显著(P <0.01)。图7是移植MSCs后肝星状细胞活化标志检测图；图7中，CC14、PBS和MSCs分别表示CCl4损伤组、CCl4损伤后注射PBS的对照组、 CCl4损伤后移植MSCs的实验组。**表示实验组与CC14损伤组比较差异极显著(P<0.01)； 左图代表a-SMA(a平滑肌肌动蛋白)mRNA表达变化，右图代表col I ( a 1) (I型胶原) mRNA表达变化。图8是移植MSCs后天狼猩红染色检测肝脏纤维化图；图8中，CC14、PBS和MSCs分别表示CCl4损伤组、CCl4损伤后注射PBS的对照组、 CCl4损伤后移植MSCs的实验组。Bar = 50 μ m。图9是注射FGF2后DLKl表达检测图；图9中，CC14、PBS和FGF2分别表示CCl4损伤组、CCl4损伤后注射PBS的对照组、CCl4损伤后注射FGF2的实验组。**表示实验组与CC14损伤组比较差异极显著(P <0.01)。
图10是注射FGF2后肝星状细胞活化标志检测图；图10中，CC14、PBS和FGF2分别表示CCl4损伤组、CCl4损伤后注射PBS的对照组、 CCl4损伤后注射FGF2的实验组。**表示实验组与CC14损伤组比较差异极显著(P<0.01)； 左图代表a-SMA(a平滑肌肌动蛋白)mRNA表达变化，右图代表col I ( a 1) (I型胶原) mRNA表达变化。图11是注射FGF2后天狼猩红染色检测肝脏纤维化图；图11中，CC14、PBS和FGF2分别表示014损伤组、CCl4损伤后注射PBS的对照组、 CCl4损伤后注射FGF2的实验组。Bar = 50 μ m。
具体实施例方式实施例1 慢性肝损伤小鼠模型制备和DLKl表达检测利用10% (体积浓度)四氯化碳(溶剂为橄榄油)对八周鼠龄的ICR小鼠(体 重约30克)诱导化学肝损伤，每只小鼠腹腔注射0. 25ml 10% CCl4，每周2次，连续注射4 周，建立肝纤维化模型，注射后的小鼠在无菌环境下正常饲喂。提取正常、损伤2天、1、2、3和4周小鼠肝脏总蛋白，Western blot检测DLKl表 达取50 μ g蛋白上样，跑SDS-PAGE电泳；冰浴中恒流200mA转膜(硝酸纤维素膜)2小时； 按照0. lml/cm2膜面积加入封闭液，BP 2% BSA(2g BSA溶于100ml PBST，其中PBST为PBS 加0.05% (体积比)的TWEEN20)，室温平缓摇动2小时；弃封闭液，以0. lml/cm2膜面积加 ADLKl (Rat anti mouse, Enzo Life Sciences), 4 if ^ ；If—㈱，PBST Μ^Ξ.^, 每次IOmin ；以0. lml/cm2膜面积加二抗，室温平缓摇动1小时；弃二抗，PBST洗膜三次，每 次IOmin ；以0. lml/cm2膜面积加显色液。结果表明正常肝脏几乎检测不到DLKl表达，慢性损伤过程中，DLKl易于诱导且 持续表达，且Western blot检测显示DLKl蛋白以50kDa和25kDa左右两种形式存在(如 图1所示)。实施例2 体外实验证明DLKl促进HSC活化HSC细胞分离培养正常小鼠肝脏，胶原酶-链蛋白酶灌流，收集单个分散肝细胞， 将细胞悬液小心加至8. 2% Nycodenz (Axis-shield)上，800g离心25分钟，收集中间层HSC 细胞，IMDM(supplemented with 10% FBS and 1 % penicillin/streptomycin) 37°C, 5% CO2条件培养。DLKl蛋白制备克隆DLKl基因胞外区和信号肽及邻近1_3个EGF样结构；将克隆 片段插入载体P⑶ΝΑ6中；质粒用脂质体2000转染ΗΕΚ293细胞；收集转染72小时后无血 清细胞上清液，500g离心IOmin ；western blot检测表达蛋白；其中胞外区表达所得蛋白为 DLKl大片段(DLKl-L)游离蛋白，信号肽及邻近1_3个EGF样结构表达所得蛋白为小片段 (DLKl-S)游离蛋白。DLKl蛋白处理HSC细胞新鲜分离HSC细胞用DLKl-L和DLKl-S处理(约40ng/ ml)，7-14天后，显微镜观测、RT-PCR、real-time PCR和免疫荧光检测HSC活化情况。正常 HEK293细胞无血清上清液处理组作为对照。其中HSC活化标志性基因a-SMA(a平滑肌肌 动蛋白)和col I(Cil) (I型胶原)，引物分别是
α -SMA, GGGAGTAATGGTTGGAATGG (sense)GGCAGTAGTCACGAAGGAATAG (antisense)，coll(α 1), AACTTTGCTTCCCAGATGTCCT(sense)TCGGTGTCCCTTCATTCCAG(antisense)，由上海英俊公司合成。结果表明培养7天后，HSC明显活化，脂肪类基因PPARY表达下调，而活化标志 基因α -SMA和col Ι(α 1)表达明显上调，其中DLKl-L组相比较对照组，基因表达水平显著 提高，而DLKl-S组无显著差异。形态学观察显示处理7天后，对照组和DLKl-S组细胞仍有 明显脂滴存留，而DLKl-L组细胞中几乎观察不到脂滴。处理14天后，免疫荧光检测α-SMA 表明相比于对照组，DLKl-L组有更强的α -SMA表达，而DLKl-S组无显著差异(如图2所 示)。由此证明DLKl体外能够促进HSC活化，且起作用的主要是DLK1-L。实施例3 =SiRNA抑制DLKl表达，降低HSC活化和肝脏纤维化上述肝纤维化模型小鼠，CCl4注射第2周，尾静脉注射针对DLKl的siRNA，序列 为5，-P. CCCUAUUAAUGCAUGAUAAdTdT-3，(正向)，SEQ ID NO 1 ；5，-P. UUAUCAUGCAUUAAUAGGGAG-3，(反向) SEQ ID NO :2。由上海吉玛制药技术有限公司合成。50 yg siRNA溶解在ImlPBS中快速通过尾静脉注射，然后8小时和24小时后 每只小鼠再分别注射一次(50yg siRNA)；同时对其他同样损伤的小鼠注射Iml PBS作 为对照。之后对所有小鼠继续按上述方法进行肝损伤2周，取小鼠的肝脏组织，一部分用 TRizol(Invetigen)提取总RNA，提取方法按说明书进行，然后用逆转录试剂盒RNA PCR kit (AMV) Ver3. O(TaKaRa)进行逆转录。real time-PCR检测DLKl基因表达，引物序列为 GGAGAAAGGCCAGTACGAATG(sense), CTGTTGGTTGCGGCTACGAT (antisense) ；real time-PCRit 一步检测肝星状细胞活化的标志性基因α-SMA和col I (a 1)，引物如上所述；另一部分石 蜡包埋后进行组织切片，切片厚度5 μ m，天狼猩红染色，直观展示纤维化程度。上述引物由 上海英俊公司合成。结果表明，siRNA注射组小鼠，DLKl基因表达明显受到抑制(如图3所示)，同时 与对照组小鼠相比，实验组小鼠肝星状细胞活化标志a-SMA和col I(a 1)表达显著下降， 表明肝星状细胞活化受到抑制(如图4所示)，天狼猩红染色随后也证明肝脏纤维化程度明 显得到改善(如图5所示)。由此说明尾静脉注射针对DLKl基因的siRNA能够抑制DLKl 表达，从而有效抑制肝星状细胞活化、降低肝脏纤维化。实施例4 骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)移植抑制DLKl表达，降低HSC活化和肝 脏纤维化如实施例1所述的连续注射CC142周的小鼠，尾静脉注射第三代BM-MSCs(lX IO6 个细胞/只小鼠)，随后对所有小鼠继续按上述方法进行肝损伤2周，取小鼠的肝脏组织，一 部分用TRizol (Invetigen)提取总RNA，提取方法按说明书进行，然后用逆转录试剂盒RNA PCR kit (AMV) Ver3. O(TaKaRa)进行逆转录。real time-PCR检测DLKl基因表达，引物如上 所述；real time-PCR进一步检测肝星形细胞活化的标志性基因α -SMA和col I ( α 1)表 达，引物如上所述；另一部分石蜡包埋后进行组织切片，切片厚度5 μ m,天狼猩红染色，直 观展示纤维化程度。引物由上海英俊公司合成。
结果表明，BM-MSCs移植组小鼠，DLKl基因表达明显受到抑制(如图6所示)，同 时与对照组小鼠相比，小鼠肝星状细胞活化标志α-SMA和col I(a 1)表达显著下降，表明 肝星状细胞活化受到抑制(如图7所示)，天狼猩红染色随后也证明肝脏纤维化程度明显得 到改善(如图8所示)。由此说明尾静脉移植BM-MSCs能够抑制DLKl表达，从而有效抑制 肝星状细胞活化、降低肝脏纤维化。实施例5 :FGF2抑制DLKl表达，降低HSC活化和肝脏纤维化如实施例1所述的连续注射CC142周小鼠，按50ng/g体重剂量对实验组小鼠尾静 脉注射FGF2，另外取对照组注射PBS。然后对所有小鼠继续按上述方法进行肝损伤2周， 取小鼠的肝脏组织，一部分用TRizol (Invetigen)提取总RNA，提取方法按说明书进行，然 后用逆转录试剂盒RNA PCR kit (AMV) Ver3. O(TaKaRa)进行逆转录。real time-PCR检测 DLKl基因表达，引物如上所述；real time-PCR进一步检测肝星形细胞活化的标志性基因 α-SMA和col I(Cil)表达，引物如上所述；另一部分石蜡包埋后进行组织切片，切片厚度 5 μ m，天狼猩红染色，直观展示纤维化程度。引物由上海英俊公司合成。结果表明，FGF2注射组小鼠，DLKl基因表达明显受到抑制(如图9所示)，同时与 对照组小鼠相比，实验组小鼠肝星状细胞活化标志α-SMA和col I(a 1)表达显著下降，表 明肝星状细胞活化受到抑制(如图10所示)，天狼猩红染色随后也证明肝脏纤维化程度明 显得到改善(如图11所示)。由此说明尾静脉注射FGF2能够抑制DLKl表达，从而有效抑 制肝星状细胞活化、降低肝脏纤维化。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
DLK1基因的用途，其特征是作为治疗肝脏纤维化的靶点。
2.根据权利要求1所述的DLKl基因的用途，其特征是以DLKl基因为靶点，设计相关 药物降低DLKl表达，抑制肝星状细胞活化，从而降低肝脏纤维化。
3.一种用于治疗肝脏纤维化的siRNA，其特征是序列为 5，-P. CCCUAUUAAUGCAUGAUAAdTdT-3，(正向)5，-P. UUAUCAUGCAUUAAUAGGGAG-3，(反向)。
4.如权利要求3所述的siRNA在制备治疗肝脏纤维化的药物中的应用。
5.骨髓间充质干细胞在制备治疗肝脏纤维化的药物中的应用。
6.细胞因子FGF2在制备治疗肝脏纤维化的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了DLK1基因的用途作为治疗肝脏纤维化的靶点；即以DLK1基因为靶点，设计相关药物降低DLK1表达，抑制肝星状细胞活化，从而降低肝脏纤维化。本发明还同时公开了siRNA、骨髓间充质干细胞和细胞因子FGF2在制备治疗肝脏纤维化的药物中的应用。
文档编号A61K48/00GK101940795SQ20101021282
公开日2011年1月12日 申请日期2010年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者潘若浪, 王萍, 董伟仁, 邵健忠, 项黎新 申请人:浙江大学