专利名称：Ly6h基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因，其在大脑中有很高水平的特异性表达，尤其是这样一种基因，其编码隶属于Ly6家族(参见下文引用的文献)的一种新型蛋白，该蛋白用于纯化血干细胞、研究血细胞的分化、激活免疫细胞、抑制活性免疫细胞的产生、治疗肿瘤等等。本发明进一步涉及一种由所述基因编码的新型蛋白及其特异性的抗体。另外，本发明也涉及到一种用于神经变性疾病如早老性痴呆的治疗或预防的组合物。
Ly6家族在骨髓及淋巴细胞中有高水平的特异性表达,其因此被用于T细胞分化及造血干细胞的标记(免疫细胞生物学(Immunol.CellBiol.,),73,277-296(1995)]。虽然其在体内的很多功能仍未知，但其在淋巴系统中的表达受到高度调控的发现提示这些蛋白在免疫系统中有着重要的作用，尤其是在T细胞的分化及功能方面。例如，据报道，Ly6c调控CD8+T细胞通过整合素依赖性粘附返回淋巴结[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,94,6898-6903(1997)]。
另外,许多GPI-固着蛋白已知与蛋白激酶互相作用[科学(Science)，254,1016-1019(1991)]。例如，Ly6与pS61ck及p59fyn的相互作用提示其可能与T细胞的信号传导有关[Eur.J.Immunol.,23,825-831(1993)]。同样也已经报道了获自Ly6a缺陷性小鼠的T细胞在对抗原刺激反应时增殖能力的增强[J.Exp.Med.,186,705-717(1997)]。其不仅可能调控T细胞的活化，同时也可能调控B细胞的活化[J.Immunol.,144,2197-2204(1990)]。
另外,几个GPI-固着蛋白已知在淋巴系统及神经系统中被表达并且发挥作用[自然(Nature),379,826-829(1996)；Curr.Biol.,7,705-708(1997)]。已有报道，Ly6家族中的Ly6a.2及Ly6E在这两个系统中呈递并发挥作用[Proc.Nati.Acad.Sci.,USA.,85,2255-2259(1996)；J,lmmunol,157,969-973(1996)]。
阐明Ly6家族的这种蛋白所起的生理学作用及编码该蛋白的基因及其所延伸的其他信息，被认为在与血干细胞纯化、血细胞的分化研究、免疫细胞的激活、免疫细胞激活的抑制、肿瘤的治疗等相关联的基础科学研究及制药领域是非常有用的。
最近有报道，在患有早老性痴呆症的病人体内存在与年龄相关性脑萎缩相应的脑颞叶过度萎缩[Jobst,K.A.,et al.,Lancet,343,829-830(1994)]，这提示与脑颞叶相关的一些基因或基因组在某种程度上与早老性痴呆症的发生及发展有关系。根据逻辑上分析，该已被鉴别且详细描述的基因应该对早老性痴呆病症的治疗和预防起一定的作用。
因此，本发明的目的是提供上述信息，尤其是一种属于Ly6家族的新的人类蛋白及编码该蛋白的基因。
本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，其用于治疗或预防不同的神经变性疾病，尤以早老性痴呆症为代表。
本发明的发明者研究获自不同人体组织的基因，并成功分离及表征满足上述目的的新的脑特异性基因。发明者进一步发现这种新分离的基因的表达水平在早老性痴呆症病人的颞叶中显著降低，包括海马及内嗅皮层；这正是早老性痴呆症发生和发展、痴呆及其它身心障碍的病因因素；该基因及其表达产物对于治疗和预防早老性痴呆症有显著作用。本发明正是建立在上述发现的基础之上。
(a)具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白(b)具有将如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列删除、替代或增加一个或多个氨基酸后形成的氨基酸序列的蛋白，其生理学活性选自神经元生存支持活性、神经延长活性、神经再生活性、神经胶质激活活性及记忆(脑记忆形成)活性中的至少一种。
本发明同样提供了上述基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示，更为特别的是其为一个人类基因。
另外，本发明提供了一个基因其包括下述核苷酸序列(a)或(b)，尤其是相应的人类基因。
(a)一个含有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的多聚核苷酸(b)一个多聚核苷酸，其在严格条件下与具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的DNA进行杂交。
本发明进一步提供了一个含有所述基因的基因表达载体、含有所述基因表达载体的寄主细胞、一个由所述寄主细胞表达的表达产物、一个为本发明基因编码的蛋白及一个与所述表达产物或所述蛋白进行结合的抗体。
本发明进一步提供了一种治疗或预防神经变性疾病的组合物，其包括所述蛋白或其等价物，或作为一种活性成分与药物载体结合的所述表达产物。更为详细的是，本发明提供了一种治疗或预防神经变性疾病的组合物，其中所述活性成分是一种具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白或其等价物；或一种基因产物，其通过含有如SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列的基因的全部或部分表达而获得，且其生理学活性选自神经元生存支持活性、神经延长活性、神经再生活性、神经胶质激活活性及脑记忆形成(记忆、编码)活性中的至少一种。
特别是，本发明提供了一种治疗及预防早老性痴呆症、阿尔茨海默类型痴呆、脑缺血及帕金森病的组合物。
此外，本发明提供了一个含有SEQ ID NO:2所示核苷序列中的至少20个连续核苷酸组成的有义寡聚核苷酸链、一个基因治疗组合物，其含有所述的寡聚核苷酸有义链作为活性成分与药物载体结合、及一个含有由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中的至少10个连续组成核苷酸形成的寡聚核苷酸序列的基因特异性探针。
此外，本发明提供了一个用于筛选候选组合物的方法，此组合物或者能够连接到所述蛋白、其等价物或表达产物上，或者能够影响所述蛋白、其等价物或表达产物的活性。还提供了一个用于所述筛选的试剂盒和被筛选的所述组合物。
氨基酸、多肽、核苷酸序列、核苷酸等等的表述在说明书中都使用简写，其与IUPAC-IUB(IUPAC-IUB生物术语通讯(Communicationon Biological Nomenclature),Eur.J.Biochem.,138,9(1984))、“与核苷酸序列和/或氨基酸序列相关的专利说明书的书写准则”(日本专利局编辑)及本领域内编码或符号使用习惯所推荐的规则一致。
本发明基因的一个具体的实施例是一个由名为＂LY6H＂的PCR产物的DNA序列演绎的基因,如后实施例所述。其核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。
LY6H基因是一个cDNA，其含有一个420个密码子可读框(ORF)编码一个具有如SEQ ID NO:1所示140个残基的氨基酸序列的新脑特异性蛋白(LY6H蛋白)，且其具有一个854个核苷酸的全长序列。
使用FASTA程序在GenBank/EMBL数据库中进行检索[Person,W.R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,85,2444-2448(1988)]，发现作为本发明基因表达产物的LY6H蛋白与鼠Ly6家族蛋白具有很高的同源性[Immunol.Cell Biol.,73,277-296(1995)]。此外还发现了高度的基因对基因同源性。因此，本发明的基因被认为是一种新的人类Ly6基因。
经过测序随机选自一个胎儿人脑cDNA库的超过28000cDNA克隆，本发明的LY6基因被鉴别为这样一种基因，其在脑中被特异性表达。通过RH染色体绘图[Hum.Mol.Genet.,5,339-346(1996)]，基因在染色体上的定位被认为在8q24.3。
因此，本发明的基因及表达产物有助于监测该基因在不同组织中的表达、通过基因工程技术制备人类LY6H蛋白及构建其抗体，由此使造血干细胞的纯化，血细胞分化的研究，免疫细胞的激活或抑制、肿瘤的治疗等成为可能。
此外，本发明所提供的表达产物(多肽)使得神经变性疾病如早老性痴呆症、阿尔茨海默类型痴呆、帕金森病及脑缺血的预防及治疗药物的供应成为可能。更进一步，本发明的基因有义链可被用作一种药物组合物用于基因治疗，从而可以抑制或阻止上述神经变性疾病的发生与发展。
本发明进一步提供了一种方法，用于筛选连接于本发明表达产物(多肽)或影响其活性的组合物。还提供一个相关的筛选试剂盒及被筛选的组合物。对于该筛选组合物的鉴别，可以利用与本发明基因表达产物结合的抗体来进行。
在说明书中，术语“基因”被用于意指一个双链DNA及其组成单链DNA，无论正义或反义，无论长短。因此，除非特别指出，本发明的基因(DNA)包括一个含有人类基因组DNA的双链DNA、一个包括cDNA的单链DNA(有义链)、一个具有与所述有义链互补序列的单链DNA(反义链)及所述DNA的片断。
本发明的基因(DNA)可以包括一个引导序列、一个编码区域、外显子及内含子。多聚核苷酸包括RNA及DNA。DNA包括cDNA、基因组DNA及合成DNA。多肽包括其片断、同源体、衍生物或突变体。突变体包括天然形成的等位基因、天然不存在的突变体、其氨基酸序列通过删除、替代、增加和/或插入发生变异的突变体及与修饰的氨基酸序列功能相同的突变体。
氨基酸序列的这种修饰(如突变)例如可以源自自发突变或遗传后修饰，也可以通过人工诱导天然基因产生(如本发明的特异性基因)。
这些突变体与未突变多肽至少可以有70％的同源性，较好为80％，更好为95％，最好为97％。上述多肽、其突变体及同源体具有一个共有的保守结构特征，并且可能具有如本发明基因的表达产物的生物学活性，例如神经元生存支持活性、神经元生长促进活性、神经再生活性及神经胶质激活活性。通过使用序列分析软件如FASTA[Clustal,V.,Methods Mol.Biol.,25,307-318(1994)]搜索数据库如SWISSPLOTS数据库，可以分析多肽的同源性。
编码该突变体的基因对于氨基酸替换不发生作用。因此，该核苷酸序列编码的氨基酸残基不发生改变。
可保守性替换的氨基酸残基，即此氨基酸残基可被其他氨基酸残基替代但不丢失具有原始氨基酸残基的多肽的活性，及相应的原始氨基酸残基列举如下原始氨基酸残基保守性替代的氨基酸残基Ala SerArg LysAsn Gln,HisAsp GluCys SerGln AsnGlu AspGly ProHis Asn或GlnIle Leu或ValLeu Ile或ValLys Arg、Aln或GluMet Leu或IlePhe Met、Leu或TyrSer ThrThr SerTrp TyrTyr Trp或PheVal Ile或Leu此外，Cys可以被替换为另一种不同的氨基酸残基，例如Ser,Ala或Val。
本发明的基因和表达产物提供了用于阐释、详述、诊断、预防和治疗神经变性疾病如早老性痴呆症、脑缺血及帕金森氏病的信息及方法。本发明的基因同样可被有效地用于开发新的药物，此药物能够诱导用于治疗所述神经变性疾病的基因的表达。此外，监测本发明基因的表达及在个体或组织中的表达产物，以及监测基因突变(删除或点突变)或其异常表达，可被有效地用于阐释及诊断所述神经变性疾病。
本发明的基因包括但并不限于具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列(其编码一个具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白)的基因，例如，一个具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的基因(LY6H基因)。例如，本发明的基因可以是一个基因，其编码一个通过指定修饰源自上述定义氨基酸序列的氨基酸序列；一个基因，其编码一个具有与上述定义氨基酸序列有指定同源性的氨基酸序列；或者一个基因，其具有与上述任一基因具有指定同源性的核苷酸序列。
上面提到的对于一个已定义的核苷酸序列或氨基酸序列的指定的同源性意味着该同源性至少不低于70％，优选不低于90％，更优选不低于95％，最优选不低于97％。本发明包括了具有该同源性的同源体(基因同源体及蛋白同源体)。
本发明的基因包括“一个基因，其编码的多肽的氨基酸序列(修饰的氨基酸序列)由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列删除、替代或者增加一个或多个氨基酸后形成”。“删除、替代或者增加”的范围和/或位置并非特别限制在当具有修饰氨基酸序列的多肽在生物学功能上等价于具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽(LY6H蛋白)时。上面提到的生物学“功能”包括神经元生存支持活性、神经延长活性、神经再生活性、神经胶质激活活性、及记忆(脑记忆形成)活性等生理活性，且“等价物”是一个具有这些功能的多肽。因此，具有此修饰氨基酸序列的蛋白包括一个具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的片断(一个连续残基片断)的蛋白(等价物)及生理学活性类似于上述全长氨基酸序列的蛋白。更进一步，编码具有上述修饰氨基酸序列的多肽的基因可能是一种基因，其可与本发明编码一个具有修饰前氨基酸序列的多肽的基因一起监测。被用于所述修饰的术语“多数”一般指不少于2个至几个，但该范围并不是限制性的。
本发明的LY6H基因的同源体(及该基因表达产物的同源体)意指一系列相关的基因(及其表达产物)，其在序列上具有同源性，且基于结构特征、相同的基因表达模式、所述生物学功能的相似性其已被认为是一个基因家族。其当然包括本发明基因的等位基因。
一个氨基酸序列的修饰(突变)可以自然发生，例如通过自发突变及翻译后修饰，但也可在天然基因的基础上人工诱导(例如本发明的特异性基因)。本发明覆盖一些或所有具有上述特征的修饰基因，不考虑突变或修饰的原因或方式。
所述氨基酸序列人工修饰(突变)方法包括基因工程技术例如定点突变[酶学方法(Methods in Enzymology),154,350,367-382(1987)；ibid.,100,468(1983)；核酸研究(Nucleic Acids Res.),12,9441(1984)；＂Zoku Seikagaku Jikken Koza(生物化学实验，第二丛)1″:IdenshiKenkyuho(基因研究方法)Ⅱ，日本生物化学协会(ed.),p105(1986),etc.]、化学合成方法例如磷酸三酯法及磷酰胺法[J.Am.Chem.Soc.,89,4801(1967)；ibid.,91,3350(1969)；科学(Science),150,178(1968)；Tetrahedron Lett.,22,1859(1981)；ibid.,24,245(1983)]及这些方法的组合。
具体来说，DNA可以通过化学方法合成，例如磷酸三酯法或磷酰胺法，通过市售的自动寡核苷酸合成仪可以完成该合成。通过合成一个互补链，且在适宜条件下退火或利用一适宜引导序列及DNA多聚酶，可由化学合成的单链片断制备双链片断。
本发明基因的一个具体的实施例是一个具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的基因。该核苷酸序列的编码区(如SEQ ID NO:2所示序列)是一个编码如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的各自氨基酸残基的密码子的组合的实施例。本发明的基因不限制于具有所定义的核苷酸序列的基因而且包括通过选择编码每一个氨基酸残基的密码子的任意组合获得的核苷酸序列的基因。密码子的挑选可以参照寄主细胞中密码子的使用通过常规的方法进行[核酸研究(Nucleic Acid Res.),9,43(1981)]。
更进一步，本发明的基因包括一个与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列具有一定水平同源性的核苷酸序列。由所述同源性水平推断，多聚核苷酸及互补的多聚核苷酸与SEQ ID NO:3所述的核苷酸序列至少具有70％的同源性，较好为90％，更好为95％。具有如此水平同源性的基因可以作为一种多聚核苷酸，其在严格条件下与具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的DNA进行杂交。更为具体的是，具有所述同源性水平的基因范畴内包括一个基因，其核苷酸序列在6×SSC在65℃下过夜或50％甲酰胺-4×SSC在37℃下过夜培养的条件下能与具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的DNA进行杂交。这里，SSC代表标准柠檬酸盐(1×SSC=0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠)。
以本发明所述基因在说明书中所述的任一具体实施例所提供的序列信息为基础，利用常规的基因工程技术可以很容易制备和分离本发明基因。[例如，分子克隆，第2版(MolecularCloning,2dEd),Cold SpringHarbor Lab.Press(1989)；Zoku Seikagaku Jikken Koza(生化实验，第2系列(Experinents in Biochemistry,Second Series)):“Idenshi Kenkyuho(基因研究方法(Methods in Gene Research))Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ，日本生化协会(ed.),(1986)]。
更为详细的是，从合适的来源制备cDNA库也可完成上述实验，其中通过利用传统程序并使用本发明基因的特异性抗体或合适的探针从该库中挑选目的克隆，可使本发明的基因得以表达。[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,78,6613(1981)；科学(Science),222,778(1983)]。
可用于上述程序的cDNA的来源,可以包括表达本发明基因的不同的细胞及组织及由此获得的培养细胞，尤其是脑组织。可以以传统的方式从这样一个来源进行全部RNA的分离、mRNA的分离和纯化、及cDNA的获得和克隆。此外，cDNA库是可购得的，且利用这样一个cDNA库可实施本发明，例如，这些cDNA库可获自CLONTECH Lab.Inc。
从cDNA文库中筛选本发明的基因的方法并不是专门限制性的，传统的方法也可以被使用。筛选方法的实施例包括一种免疫筛选方法，其用cDNA所产生蛋白的特异性抗体去挑选出相应的cDNA克隆；一种方法，其利用一探针选择性连接到目的DNA序列，例如噬斑杂交法、克隆杂交法及上述方法的组合。
按照本发明基因的核苷酸序列信息化学合成的DNA通常可以作为上述方法的探针。已经获得的本发明的基因或其中的片断也可被有效地用作探针。按照本发明基因的核苷酸序列信息建立的正义引物及反义引物可被用作筛选探针。
作为探针使用的核苷酸序列可以是相应于SEQ ID NO:2的部分核苷酸序列，且其包括至少10个连续的核苷酸，较好为20个连续的核苷酸，更好为30个连续的核苷酸，最好为50个连续的核苷酸。此外，具有如SEQ ID NO:2所示的寡核苷酸序列的阳性克隆也可被用作探针。
在获取本发明基因时，可优先使用PCR进行DNA/RNA扩增[科学(Science),230,1350(1985)]。尤其是当一全长cDNA很难从库中获取时，可优先使用RACE方法[cDNA末端的快速扩增(Rapidamplification of cDNA ends)；Jikken Igaku(实验药学(ExperimentalMedicine)),12(6),35(1994)],尤其是5′-RACE方法[M.A.Frohman,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,8,8998(1988)]。
参照此处公开的本发明基因的序列信息，可以很科学地确定且使用传统的方法合成在该PCR方法中所使用的引物。使用前述传统方法可以进行扩增DNA/RNA片断的分离或纯化，如凝胶电泳法。
使用双脱氧测序法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,74,5463(1977)]或者化学测序法[酶学方法(Methods in Enzymology),65,499(1980)]或者更为方便的商业用途的测序试剂盒，可对由上述方法获得的本发明基因或各种DNA片断进行测序。
例如，利用如此获得的本发明基因，使用本发明基因的核苷酸序列的全部或一部分可特异性监测本发明基因在一个体或指定的组织中的表达或不表达。
上述监测可以通过传统方法进行。例如使用RT-PCR(反转录聚合酶链式反应；E.S.Kawasaki,et al.,Amplification of RNA.In PCRProtocol.A guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.,SanDiego,21-27(1991)]、RNA印迹法[分子克隆(Molecular Cloning),Cold Spring Harbor Lab.(1989)]、用原位RT-PCR进行细胞水平上的测定[Nucl.Acids Res.,21,3159-3166(1993)]或者原位杂交、NASBA[核酸序列基础上的扩增(Nucleic acid sequence-based amplifimtion)，自然(Nature),350,91-92(1991)]及类似的传统技术来进行RNA扩增。首选使用RT-PCR检测方法。
当使用PCR方法用于上述目的时所使用的引物并未限制在以下范围内其为本发明基因特有的，能够选择性扩增特定的基因，能够在本发明基因的序列信息的基础上进行科学地确定。一般来讲，引物具有本发明基因的一部分序列，其大约是10-35个核苷酸的长度，最好是15-30个核苷酸的长度。
因此，本发明的基因包括可作为特定引物和/或特定探针用于检测本发明LY6H基因的DNA片断。
上面提到的DNA片断可被定义为一种多聚核苷酸，其在严格条件下与具有如SEQ ID NO:2所显示的核苷酸序列的多聚核苷酸进行杂交。上面提到的严格条件可以是针对引物或探针的一般条件，其并未特别限制。例如，上面提到的条件6×SSC、65℃、过夜或50％甲酰胺-4×SSC、37℃、过夜培养。
通过在标准的基因工程技术中应用本发明的基因，可大量制备此基因的表达产物(多肽)或一个含有其的蛋白，同时具有很高的重现性。
因此，本发明进一步提供了一种多肽其具有本发明基因编码的氨基酸序列(本发明的表达产物)、一种用于制备该多肽的本发明基因的载体、一个用该载体转染的寄主细胞、一种包括培养寄主细胞在内的用于制备本发明多肽的方法。
具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽(LY6H蛋白)是本发明多肽的一个特定的实施例。本发明多肽并不限制于该LY6H蛋白，还包括其同源体。该同源体可以是一种多肽，其氨基酸序列由如SEQ IDNO:1所示氨基酸序列删除、替代、或增加一个或多个氨基酸后形成，且其保留LY6H蛋白的功能。该同源体的一个特定的实施例是所述LY6H基因同源体的表达产物(LY6H等价基因包括其等位基因)。
更进一步，本发明LY6H蛋白的同源体包括与含有如SEQ IDNO:1所示氨基酸序列的多肽(其获自任一哺乳动物如马、羊、牛、犬、猴、猫、熊，及啮齿类如大鼠、小鼠、兔子等)活性或功能相同的蛋白。
利用传统的重组DNA技术[例如，科学(Science),224,1431(1984)；生物化学及生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.),130,692(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,80,5990(1983)]，基于本发明所提供的基因序列信息，可制备本发明的多肽。
更为特定的情况，所述多肽的制备包括下列程序构建一个重组DNA(表达载体)，其允许编码目的蛋白的基因在寄主细胞中表达；使用载体转化寄主细胞；培养所产生的转化体；从液体培养基收集多肽。
上面所提到的寄主细胞可以是任何一个原核细胞或真核细胞。原核寄主细胞可以是大肠杆菌、枯草杆菌或其他普通的细菌，最好使用大肠杆菌，尤其是大肠杆菌K12。真核寄主细胞包括脊椎动物细胞、酵母细胞及其前体，还有猴细胞系COS[Cell,23:175(1981)]，中国仓鼠卵巢细胞及其二氢叶酸还原酶缺陷细胞[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,77:4216(1980)]。作为后者，酵母属酵母细胞可被优先考虑，但并不排除其他选择。
当原核细胞被用作寄主细胞时，通过使用一个可在特定的寄主细胞中复制的载体并且在本发明基因的上游增加一个启动子及一个SD(Shine及Dalgarno)序列，可以制备表达质粒结构，以便该基因可在那里表达，且蛋白合成起动必需的起始密码子(如ATG)也可被有效使用。经常使用获自大肠杆菌的质粒例如pBR322,pBR325,pUC12,pUC13等等作为上面所提到的载体。但是这些并非唯一的选择，其他已知的载体也可被使用。使用大肠杆菌的表达系统所使用的商业载体包括PGEX-4T(Amersham Pharmacia Biotech)、pMAL-C2、pMA1-P2(New England Biolabs)、pET21、pET21/lacq(Invitrogen)及pBAD/His(Invitrogen)。
当脊椎动物细胞被用作寄主细胞时所使用的表达载体常具有一个处于要表达的本发明基因上游的启动子、RNA接合位点、聚腺苷酸化位点及一个转录终止序列。该载体可进一步具有一个必需的复制起点。例如这样一个表达载体，其为携有SV40的早期启动子的pSV2dhfr[分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.),1:854(1981)]。除了上述载体外，几个已知的商业上使用的载体也可被使用。商业上使用的用于动物细胞表达系统的载体包括用于动物细胞的载体，例如pEGFP-N、pEGFP-C(CLONTECH)、pIND(Invitrogen)、pcDNA3.1/His(Invitrogen)等等，及用于昆虫细胞的载体，例如pFastBac HT(Gibci BRL)、pAcGHLT(PharMingen)、pAc5/V5-His、pMT/V5-His及pMT/Bip/V5-his(allInvitrogen)。
具有酸性磷酸酯酶基因的启动子的pAM82[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,80:1(1983)]是使用酵母细胞作为寄主细胞时的表达载体的一个具体的例子。商业的用于酵母细胞的表达载体包括pPICZ(invitrogen)及pPICZα(Invitrogen)。
启动子也并不特别限定。当埃希氏杆菌属用作寄主细胞时，色氨酸(trp)启动子、lpp启动子、lac启动子、recA启动子、PL/PR启动子等等可被有效使用。当寄主细胞是芽孢杆菌属时，SP01启动子、SP02启动子、penP启动子等等可被使用。当酵母细胞被用作寄主细胞时，pH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等等可被优先使用。当寄主细胞是动物细胞时，启动子优选SV40-衍生启动子、反转录病毒启动子、金属硫因启动子、热休克启动子、细胞巨化病毒启动子及SRα启动子。
作为本发明基因的表达载体，传统的结合蛋白表达载体可以优先被使用。pGEX(Promega)对于谷胱甘肽S转移酶(GST)-融合蛋白的表达是载体的一个具体例子。
多聚核苷酸序列中编码成熟多肽的序列有助于多肽从寄主细胞中表达和分泌。此多聚核苷酸序列包括分泌序列、引导序列及标记序列。(hexahistidine标记，histidin标记)用于在细菌细胞中结合成熟多肽的纯化，在哺乳动物细胞中该标记为血球凝集素(HA)标记。
将重组DNA(表达载体)引入寄主细胞的方法及相关的转化方法并不特别限制，各种标准方法也可被使用。
获得的转化体可以用传统的方法进行培养，借此按照本发明专门设计的基因所编码的目的蛋白在细胞内、细胞外、或细胞膜上表达且产生(聚集/分泌)。
所使用到的培养基按照其所采纳的寄主细胞的类型从不同的传统培养基中进行选择，该培养基必须有利于寄主细胞的生长。
本发明的重组蛋白(LY6H蛋白)可以通过不同的分离技术充分利用其物化特性进行选择性分离和纯化，例如[＂Seikagaku Data Book(生化数据手册)Ⅱ＂,1175-1259，第一版，第一次印刷，June 23,1980,TokyoKagaku Dojin K.K.；生物化学(Biochemistry),25(25),8274(1986)；Eur.J.Biochem.,163,313(1987),etc.]。
这些技术例如有传统的重组方法、蛋白质沉降剂的处理(盐析法)、离心、渗透休克法、超声波分裂、超滤法、不同类型的层析技术如分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、亲和层析及高压液相层析(HPLC)、透析、及上述技术的组合。优选的技术包括亲和层析，其柱上偶联了本发明蛋白的特异性抗体。
在设计编码本发明多肽的目的基因时，具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的LY6H基因可被优先使用。如果需要，可在各氨基酸残基的特异性密码子发生转变之后使用该基因。另外，当为LY6H基因编码的氨基酸序列中的任一氨基酸残基或部分序列通过替代、删除或增加进行修饰时，该修饰可以通过前述不同方法来完成，如定点突变方法。
本发明的多肽可按照SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列化学合成的标准方案来进行制备。该方法包括多肽合成的传统液相方法及固相方法。
更为具体的情况是，多肽合成的方法包括所谓的逐步延长方法，其中组成氨基酸一个接一个地偶联以进行链的延长；及片断缩合法，其包括预先合成包括有几个氨基酸的片段，然后将这些片断偶联。本发明蛋白的合成可通过上述两种方法之一进行。
上述多肽合成所使用的缩合方法可以是传统的方法，包括叠氮化合物法、混合酸酐法、DCC法、活化酯法、氧化还原法过程、DPPA(二苯基磷酰叠氮)法、DCC+添加剂(1-羟基苯并三唑、N-羟基丁二酰胺、N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺等)法及Woodward's试剂法。
这些方法中要用到的溶剂可以选自本领域内周知的用于多肽合成缩合反应的普通溶剂。例如其包括二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、六甲基磷酸胺、二氧六环、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯等及其混合物。
在进行多肽合成反应时，氨基酸或多肽片断中的任何不应参加反应的羧基基团可以首先被保护，一般酯化成低烷基酯，如甲酯、乙酯、叔丁酯等等；或者一个芳烷基酯，如苄酯、p-甲氧基苄酯、p-硝基苄酯等等。
谈及在其侧链上具有一个功能基团的任一氨基酸，例如，酪氨酸残基的氢氧基基团，可以首先用一个乙酰基、苯甲基、苄氧羰基、叔丁基或其他基团进行保护，尽管该保护并非必不可少。更进一步，一个精氨酸残基的胍基基团可以用合适的保护基团如硝基、对甲苯磺酰基、p-甲氧苯磺酰基、亚甲基-2-磺酰基、苄氧羰基、异冰片氧羰基、金刚烷氧羰基等。
从保护的氨基酸、多肽或者本发明蛋白终产物中脱除该保护基团的反应可同样以常规方法进行，例如，通过催化还原，或者使用液态氨/钠、氟化氢、溴化氢、氯化氢、三氟乙酸、乙酸、蚁酸、甲磺酸或其他试剂的方法。
本发明的多肽可以通过上面提到的不同技术进行纯化，例如离子交换树酯层析、分配层析、凝胶层析、反向分配等多肽化学领域内的常规方法。
本发明的多肽可以被有效地用作免疫原以制备其特异性的抗体。通过使用该免疫原，可以获得抗血清(多克隆抗体)及单克隆抗体。
诱导抗体的技术是本技术领域内共知的，已知的操作程序可以应用于本发明[e.g.Zoku Seikagaku Jikken Koza(Experiments inBiochemistry,Second Series)＂Men-eki Seikagaku Kenkyuho(免疫生物化学方法(Methods in Immunobiochemistry))＂，日本生物化学协会编辑(1986)]。
例如，普通的动物例如兔子、豚鼠、大鼠、小鼠、小鸡等等可被任意选择作为免疫动物以获得目的抗血清。用所述的免疫原进行免疫，使用传统方法收集血液。
单克隆抗体的制备可以使用传统的技术手段进行，其包括在一个用所述免疫原免疫的动物的浆细胞(免疫细胞)及一个浆细胞瘤之间构建一个杂交瘤，挑选产生目的抗体的克隆并培养该克隆。选择免疫动物一般考虑其与在细胞融合时所使用的浆细胞瘤之间的相匹配性，一般优先使用小鼠或大鼠。免疫操作程序可以与所述抗血清的制备相同，如果需要的话，也可和传统佐剂联合使用。
在所述杂交中所使用的浆细胞瘤并不特别限制，包括几种骨髓瘤细胞例如p3(p3/x63-Ag8)[自然(Nature),256:495-497(1975)]、p3-U1[微生物学及免疫学的当代主题(Current Topics in Microbiology andImmunoloy),81:1-7(1978)]、NS-1[Eur.J.Immunol.,6:511-519(1976)]、MPC-11[细胞(cell),8:405-415(1976)]、SP2/0[自然(Nature),276:269-271(1978)]等，R210[自然(Nature),277:131-133(1979)]及鼠类的其他细胞和由此派生的细胞。
所述免疫细胞及所述浆细胞瘤细胞的杂交可以通过已知技术在传统杂交促进剂如聚乙二醇(PEG)或者仙台病毒(HVJ)的存在下进行。目标杂交瘤的分离可以以已知方式进行[酶学方法(Meth.In Enzymol.),73:3(1981)；Zoku Seikagaku Jikken Koza(ditto)]。
目标抗体诱导细胞克隆的搜索及单克隆抗体的制备同样可以以常规方式进行。例如，抗体诱导杂交瘤细胞的搜索可以使用常规用于检测抗体的各种技术，例如ELISA[Meth.in Enzymol.,70:419-439(1980)]、噬斑方法、印迹方法、凝集反应方法、奥脱洛尼方法、放射性免疫分析等，同时使用本发明蛋白作为抗原。
从所得杂交瘤获得本发明抗体的方法如下通过以传统方法培养杂交瘤并收集培养上清液作为抗体，或将该杂交瘤移至一相容的哺乳动物且收集腹水形式的抗体。前一种方法适宜于产生高纯度的抗体而后一种方法适宜于该抗体的大规模制备。这样产生的抗体可以通过传统方法进一步纯化，如盐析法、凝胶过滤法、亲和层析等。
获得的抗体的特点在于其与本发明LY6H蛋白的结合亲和性，且其可被有效地用于LY6H蛋白的纯化及通过免疫学技术确定或鉴别该蛋白。另外，由于已证实在一个患有早老性疾病(其是一种神经变性疾病)的病人的脑颞叶中本发明基因的表达减少，所以该抗体可用于筛选LY6H蛋白的兴奋剂或拮抗剂。
本发明也提供了上述新的抗体。
本发明的多肽在医药领域内是非常有用的，它可作为药物产品的活性成分。因此，本发明提供了一个药物组合物，其含有本发明的多肽并将其作为其中的活性成分。
本发明多肽作为所述药物组合物或在其中的有效性可归于该脑特异性多肽固有的神经元生存支持活性、神经延长活性、神经再生活性，神经胶质激活活性及记忆活性。证实这些活性的方法的实施例包括下述针对每一种活性的方法。
1)神经元生存支持活性下述方法可用于定量本发明多肽的神经元生存支持活性。例如，从一个SD鼠胎儿的全脑中无菌分离海马且用酶进行处理，并在含有终浓度为2×105细胞/cm2的10％牛胎血清-DMEM的聚L-赖氨酸(Sigma)预包被的96孔板上培养。
在细胞生长24小时的最后，培养基改为含有DMEM的1％N2补充物(Gibco)。然后，加入本发明的活性成分多肽(发明组)。而在对照组中，加入经沸水热处理5分钟的本发明多肽(煮沸蛋白组)。
将以上述方向制备的每一组细胞(培养物)培养72个小时。然后，用Promega细胞滴度96-孔分析系统进行MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]实验，可以测出本发明多肽对海马神经元的神经元生存支持活性。
相似地，如上从相同的SD鼠胎儿的全脑中无菌分离腹侧中脑，然后如上以相同的方式进行MTT试验，本发明多肽对中脑神经元的神经元生存支持活性可以被测出。
2)多巴胺能神经元生存支持活性作为一种评价本发明多肽的神经元生存支持活性的方法，下面的多巴胺能神经元生存支持活性的定量方法将被提及。将如1)准备的每一组细胞或培养物培养72小时后，与4％多聚甲醛-PBS在室温下进行混合15分钟，然后，使用1％Triton X 100/PBS，使培养物透过膜。
为了避免抗体的非特异性结合，细胞在10％羊血清-PBS中培养一个小时，然后，使用一个抗酪氨酸羟化酶的多克隆抗体(Chemicon，在PBS中稀释1000倍)，然后在4℃下温育16个小时。除去抗体液以后，细胞用PBS进行洗涤，然后，加入过氧化物酶标记的葡聚糖聚合物偶联的羊抗兔免疫球蛋白(Dako)，在室温下温育一个小时。
酪氨酸羟化酶阳性细胞的检测可以通过以二氨基联苯胺为底物的显色反应来完成。在这个方法中，可使用酪氨酸羟化酶阳性细胞的数量作为指标测试本发明多肽的多巴胺能神经元生存支持活性。
3)神经延长活性本发明多肽的神经延长活性(轴突延长促进活性)的确定可以通过使用PC12细胞如下完成[ATCC收藏号CRL1721；Science,229,393-395(1985)]。PC12细胞在修饰过的含有5％热失活的(56℃,30min)马血清及10％的牛胎血清(FCS)的Dalbecco's MEM(D-MEM)中进行继代培养,然后移殖至一个胶原蛋白覆盖的直径35mm塑料有盖培养皿中，且浓度为6×104细胞/3毫升。移殖2天后，培养基换成含有不同浓度的本发明的多肽及神经生长因子(NGF；Wako Pure Chemical Ind.)及FCS的D-MEM。然后继续培养。第三天，使用相差显微镜观察细胞的形态变化。通过与对照组比较估计神经突的是否形成或神经突生长是否得到促进，可以评价本发明多肽的轴突延长促进性。
4)神经胶质激活活性例如，可以通过按照Kniss等或Bogler等的方法[Kniss,D.A.,及Burry,R.W.,Brairi Res.,439,281-288(1988)；Bogler,O.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,87(16),6368-6372(1990)]确定本发明多肽对于FGF激活神经胶质的影响，来评价神经胶质激活活性。
5)记忆活性记忆活性可按照Morris的water-maze方案进行评价[Morris.R.G.M.,J.Neurosci.Meth.,11,47-60(1984)]。
另一种估价方法包括将LY6H蛋白或其拮抗剂或激活剂通过筛选使其进入一个具有Alzheimervs疾病的动物模型中,例如突变的β淀粉前体蛋白基因或突变的早老1型基因的转基因小鼠[例如.Nature,373,523-527(1995)；Nature Med.,5,560-564(1999)]，并与未处理的对照组比较评价该种疾病的进展度或者神经变性的程度。
此外，为了获得在人颞叶中进行表达的基因(基因治疗)，可使用一种腺病毒载体[Straus,E.S.,Plenum Press New York,451-496(1984)；Setoguchi,Y.,et al.,Blood,84,2953-2964(1994)]。这样，一种可能的操作步骤包括在腺病毒载体中克隆本发明的基因，在干细胞中对其进行培养，将其直接导入颞叶或通过外周静脉血管输入，且检查阿尔茨海默类型痴呆或早老性痴呆是否得以改善或其进程受到抑制。
作为本发明药物组合物活性成分的多肽包括其药用合格的盐。该盐包括具有碱金属、碱性稀土金属或者铵的非毒性盐，例如钠盐、钾盐、锂盐、钙盐、镁盐、钡盐及铵盐。这些盐可使用本领域惯用的技术进行制备。更进一步，所谓盐包括非毒性酸加成盐，其可以使用合适的有机或无机酸与本发明的活性成分多肽反应进行制备。具有代表性的非毒性酸加成盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、醋酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、p-甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡羧酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、磺酸盐、羟乙酸盐、马来酸盐、抗坏血酸盐、苯磺酸盐、萘磺酸盐等。
本发明的药物组合物包括由具有药用有效量的本发明多肽和一个适宜的非毒性药物载体或者稀释液组成的组合物。
可被用于所述药物组合物(药理学准备)的药物载体包括稀释液或赋形剂，其可以照惯例根据剂型，例如填充剂、扩容剂、粘合剂、致湿剂、崩解剂、表面活性剂及润滑剂等，进行使用。这些可以根据所使用组合物的单位剂型进行科学地选择。
本发明尤为优选的药物组合物可以使用不同的添加剂来进行制备。这些添加剂可表述于普通的蛋白制备方法中，例如稳定剂、杀虫剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。
稳定剂包括人类血清白蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。这些可单独使用或与必要的表面活性剂等联合使用。与表面活性剂联合使用可导致活性成分更为稳定。
L-氨基酸并不特别限制，其还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。
糖类并不特别限制，其还可包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等等，及他们的衍生物。
表面活性剂并不特别限制，其可以包括离子或非离子表面活性剂。表面活性剂的实例有聚氧化乙烯乙二醇山梨聚糖烷基酯，聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯及脂肪酸甘油酯。
所使用到的纤维素衍生物也不特别限制，其可以包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羧甲基纤维素钠。
所述糖与其他添加剂的添加量可以参照普通使用量进行选择。一般来讲，所使用糖的比例为在每微克活性成分中不少于0.0001mg，最好在大约0.01至10mg之间。所使用表面活性剂的比例为在每微克活性成分中一般不少于0.00001mg，最好在0.0001至0.01mg之间。人血清清蛋白作为一种稳定剂，可使用的比例为每微克活性成分中不少于大约0.0001mg，最好在大约0.001至0.1mg之间。作为另一种稳定剂，氨基酸的量可从每微克活性成分中大约0.001至10mg之间选择。纤维素衍生物的加入水平不少于大约0.00001mg，并优选约0.001至大约0.1mg之间。
本发明药物组合物活性成分的量可以在一个很大范围自由选择，但一般选自下列范围，大约0.00001到大约70重量百分比，优选大约0.0001到大约5重量百分比。
本发明的药物组合物可进一步添加一个缓冲液、一个等渗剂及一个螯合剂来进行补充。缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、ε-氨基已酸、谷氨酸及其相应的盐(他们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如，钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钠、氯化钾、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。这些添加剂的加入水平可以在传统的使用水平范围内。
本发明的药物制剂可以以液体的形式提供，而且以冻干的形式进行保存。该冻干的制剂可以临时溶解，例如溶在一个含有合适浓度的水、盐等的缓冲液中。
本发明药物组合物的单位剂型可以是多种型式，其可按照治疗目的进行选择。代表性的剂型包括固体剂型，例如片剂、丸剂、粉剂、干粉剂，颗粒、胶囊等等；液态剂型，例如溶液、悬浮液、乳状液、糖浆、酏剂等等。这些剂型可以按照给药途径一般分为口服制剂、注射制剂、鼻剂、阴道栓剂、直肠栓剂、舌下片剂、药膏及其它。这些药剂的每一种剂型可以按照配方或确定的制药程序来制备。
例如，所述药物载体的片剂的生产中使用不同的赋形剂，例如乳糖、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素、硅酸、磷酸钾等等；粘合剂，例如水、乙醇、丙醇、单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明胶溶液、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等；崩解剂，例如羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、低取代度的羟丙基纤维素、干淀粉、海藻酸钠、琼脂粉末、海带多糖粉末、碳酸氢钠，碳酸钙等等；表面活性剂，例如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯等等；崩解抑制剂，例如蔗糖、硬脂酸甘油酯、可可油脂、氢化油等等；吸收促进剂，例如季铵、十二烷基硫酸钠等等；致湿剂，例如甘油、淀粉等等；吸收剂，例如淀粉、乳糖、高岭土、斑脱土、硅胶等等；润滑剂，例如纯化的滑石粉、硬脂酸盐、硼酸粉末、聚乙二醇等等。
如果有必要的话，这些片剂可用传统的包衣进行包裹以提供一个糖衣片剂、明胶包被的片剂、肠衣片剂及薄膜包被片剂。双层或多层片剂也可被使用。
可被用于生产丸剂的药物载体包括不同的赋形剂，例如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可油脂、氢化植物油、高岭土、滑石粉等等；粘合剂，例如阿拉伯胶粉、黄芪胶粉末、明胶、乙醇等等；以及崩解剂，例如海带多糖及琼脂。
胶囊可以以传统方式进行制备。将本发明的活性成分与药物载体进行混合，然后将该混合物填充至一个硬的明胶胶囊壳、软的胶囊壳等。
口服给药的液体制剂包括药用合格的溶液、乳状液、悬浮液、糖浆、酏剂等等，并用常用的惰性稀释剂(例如水)进行配制。这些剂型也可包括有一种润湿剂、乳化剂、悬浮剂及/或其他辅助添加剂。其可以以确立的制药程序进行制造。
用于注射给药的液体制剂包括无菌的水溶液及非水溶液、乳化液或悬浮液。其可以使用如水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、乙氧代异十八醇、聚氧化异十八醇、聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯及橄榄油等植物油等稀释液进行制备。此外，可配制可注射的有机酯类，例如油酸乙酯。更进一步，也可以加入传统的增溶剂、缓冲剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、崩解剂等等。
上述不同的药剂以常规的方式进行消毒。用一个细菌滤膜进行过滤，用杀生物剂处理，用紫外线照射或热处理。更进一步，可以提供他们的无菌的固体组合物形式，其可以临时被溶解在无菌的水或合适的无菌介质中。
用于直肠或阴道给药的药物生产中，可使用的药物载体有聚乙二醇、可可油脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成的甘油酯等等。
药膏，例如糊剂、乳剂及胶冻，可以使用如白矿酯，石蜡，甘油、纤维素衍生物、丙二醇、聚乙二醇、硅树酯、斑脱土、橄榄油等植物油等稀释剂来进行制备。
鼻腔或舌下给药的组合物可以使用众所周知的标准赋形剂通过惯用方法来制备。
如果必需的话，本发明的这些药物制剂可以加入着色剂、防腐剂、香料、调味剂、甜味剂或其他药物。
这些药物制剂的给药方法并不特别限制，可以按照具体的剂型、患者的年龄、性别及其它因素、患病严重程度及其它可变因素来进行选择。例如，片剂、药丸、溶液、悬浮液、乳状液、颗粒及胶囊可以经过口服给药。而注射用产品可进行静脉给药，其或者单独注射，或者与传统的葡萄糖、氨基酸或其他灌输液混合注射；或者，如果需要的话，可以单独进行肌内注射、皮内注射、皮下注射、腹膜内注射。直肠栓剂可给药至直肠，阴道栓剂可给药至阴道，鼻剂可给药至鼻腔，舌下制剂可以通过口腔给药，药膏可局部给药以使药物透过皮肤渗入。
上述任一药物制剂的剂量并不特别限制，其可以按照预期的治疗目的、给药方法、治疗的持续时间、患者的背景如年龄、性别及其它因素，从一个很广泛的范围进行选择。一般来讲，推荐的活性成分常用剂量为每公斤患者的体重大约0.01μg-10mg/天，优选大约0.1μg-1mg/天。上述剂量可以以每天一次、两次或者更多次给药。
更进一步，正如在其后将要描述的工作实施例所指出的那样，本发明所述基因的表达在早老性痴呆症患者的颞叶中已经终止或者减弱。因此，通过构建一个携有本发明基因的一部分或者全部的表达载体并将其引入颞叶组织中以使得该基因在组织中强迫表达，有可能抑制颞叶中神经变性，其包括神经元的过分萎缩，早老性痴呆症病情的进展可以因此得到抑制。因此，本发明进一步提供了一种用于基因治疗的药物组合物(基因治疗试剂)，其具有上述神经变性抑制活性。
本发明基因进一步提供了上述表达载体或者用于基因治疗的载体、被本发明基因通过所述载体引导而转染的细胞、及一个用于基因治疗的药物组合物，其包括上述任一活性成分。
使用所述基因治疗试剂的基因治疗过程选自以下的至少一种，其包括有用于引导且表达本发明基因的载体，用本发明基因通过所述载体导入神经变性疾病患者脑神经元或颞叶组织中去的转染的细胞。通过这样一种途径，在该组织中神经变性可以得到抑制，早老性痴呆症、阿尔茨海默类型痴呆、帕金森病、脑缺血可以得到缓解。
现在进一步详细描述基因治疗。在下面一个基因治疗过程中，使用常规的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学及免疫学技术，除非特别指出其他的技术。这些技术均有介绍，尤其是Maniatis,T..,et al.,Molecular Cloning:A laboratory manual(Cold Spring HarborLaboratory),Cold Spring Harbor,New York(1982)),Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning:A laboratory manual,2nd Ed.(Cold Spring harborLaboratory),Cold Spring harbor,New York(1981)),Ausbel,F.M.,etal.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,NewYork(1992)),Glover,D.,DNA Cloning,Ⅰ及Ⅱ(Oxford Press(1985)),Anand,Techniques forthe Analysis of Complex Genomes(Academic Press(1992),Guthrie,G.,et al.,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic Press(1991))以及Fink,et al.,Hum.Gene Ther.,3,11-19(1992)。
通过使用一个携有本发明基因的一部分或全部的基因治疗载体,或者一个借助所述载体被本发明基因转染的细胞，可以进行基因治疗。该基因治疗可以是将LY6H基因或其功能补充到那些所述基因不能表达的细胞中去的方法。通过这样的基因治疗，受体细胞或者靶细胞周围的神经变性可以得到抑制。
本发明的基因或者基因的一个片断可以由一个适于在染色体外保存基因的载体引入到细胞中去。在这种情况下，特定的基因可被染色体外的细胞表达。而且，当通过引入基因片断进入脑神经系统的颞叶位置(这里并未发现该基因有所表达)，LY6H基因将要表达时，基因的特定片断可以是一编码LY6H蛋白一部分的基因片断，其中的LY6H蛋白为细胞生存和非生瘤性生长必需的。
基因转移载体可以是许多已知载体中的任何一个，其中本发明基因被亚克隆化，这些后面将要进一步描述。
基因转移载体向靶细胞的导入可以使用将DNA引入到不同的细胞的现有技术，这些技术为本领域技术人员所熟知，例如电穿孔、磷酸钙转染(共沉降)、病毒转导及其它技术。被本发明基因转染的细胞可被用作一种治疗大脑的神经变性紊乱的药物，其含有大脑神经系统过早萎缩的抑制剂；或被用作治疗研究的模型。
正如上面所提到的那样，当将本发明基因或基因片断引入本发明的基因治疗时，其提高了相关基因产物在大脑神经或周边组织中的表达，以致大脑神经在表达该基因的组织中的萎缩得到抑制。该基因治疗可有效用于脑神经组织，其中LY6H基因或LY6H蛋白在这些组织中的表达已经被废止。其还可有效用于脑神经组织，其中所述基因的表达水平显著降低。
按照本发明的基因治疗可以如下进行。首先，按照计算机X线断层造影(CT)筛选基因治疗的候选患者。具体做法是，将扫描位置固定在具有阿尔茨海默病症早老性痴呆症的患者的颞叶处以检查颞叶是否萎缩或萎缩的进展情况。
然后，为了实现本发明基因的表达，在靶细胞中创造细胞内LY6HmRNA并促进其翻译以加速LY6H基因的表达。对于这个目的，最好产生一个相对于该基因mRNA的正义寡聚核苷酸链并将其导入到目标细胞中去。通过上述基因治疗，使得该细胞具有促进LY6H基因表达的活性，脑受体细胞或靶细胞中的神经变性可由此得到抑制。
按照上述使用正义寡聚核苷酸进行基因治疗的方法，通过将LY6H基因亚克隆进一个逆转录病毒、腺病毒或者AAV衍生的载体并将载体转染进脑神经靶细胞，引起该正义寡聚核苷酸的表达。由此，脑神经变性得以抑制且神经变性症状的也随之缓解或停止。
当本发明基因的一个正义寡聚核苷酸链被引进一个大脑神经元或组织以增加LY6H蛋白的表达时，该正义寡聚核苷酸不必是LY6H基因的全长核苷酸，其可以是修饰产物，其中其保留了母基因的实际功能且提高了LY6H基因或包括可保留所述功能的部分序列在内的片断的表达。
可用于引导目的基因并用于DNA重组及染色体外基因维持的载体在本技术领域内都是已知的，且任何一种已知的载体可被用于本发明的实施。这样的载体例如有病毒或一个质粒载体，其含有与表达控制因子结合的LY6H基因正义寡聚核苷酸的一个复制子，并且其能在靶细胞中表达正义寡聚核苷酸产物。任何一个上面提到的表达载体可以被用到，但优选如下所公开的载体作为起始载体USP5252479及WO93/07282(具体为pWP-7A、pWP-19、pWU-1、pWP-8A、pWP-21和/或pRSVL)或pRC/CMV(Invitrogen)。更好的载体应该为各种病毒载体，其下文将要描述。
作为在基因治疗载体中使用的促进剂，优选那些因各种疾病有待治疗的受影响组织所固有的促进剂。这些促进剂可以是清蛋白、α-胎蛋白、α1-抗胰蛋白酶、铁传递蛋白、肝中的甲状腺素运载蛋白、结肠中的碳酸酐酶Ⅰ及癌胚抗原。当作用组织为子宫及胎盘时，这些促进剂可以是雌激素，芳香酶，细胞色素P450，胆固醇侧链切割酶P450，及17α-羟化酶P450。
对于前列腺，前列腺特异性抗原、gp91-fox基因及前列腺特异性激肽释放酶可以作为促进剂。对于胸腺，erb-B2、erb-B3、β-酪蛋白、β-乳球蛋白及乳清蛋白可以作为促进剂。对于肺，表面活性剂蛋白C及尿球蛋白可以作为促进剂。对于皮肤，K-14-角蛋白，人类角蛋白1或6及leucline可以是这样的促进剂。对于大脑，胶质原纤维酸性蛋白、成熟的星形胶质特异蛋白、髓磷脂、酪氨酸羟化酶胰腺绒毛蛋白、胰增血糖素及胰岛淀粉状多肽可以是这样的促进剂。对于甲状腺，甲状腺球蛋白及降血钙素可以是这样的促进剂。对于骨骼，α1胶原蛋白、骨钙素及骨骼唾液酸糖蛋白可以是这样的促进剂。对于肾脏，肾素，肝脏/骨骼/肾碱性磷酸酶及促红细胞生成素可以是促进剂。对于胰腺，其可以为淀粉酶及PAPl。
更进一步，在产生用于引导正义寡聚核苷酸链的载体中，如上述，基于本发明基因所提供的核苷酸序列信息并使用标准的基因工程技术，可以很容易准备及获得待引导的正义寡聚核苷酸(其具有本发明基因序列的全长或部分序列)。
可以通过本领域共知的各种技术来转移载体以将正义寡聚核苷酸引入细胞中去，如电穿孔、磷酸钙转染(共沉降)、病毒转导等。由所述正义寡聚核苷酸转染的细胞在处于单独的状态时具有脑神经变性抑制活性，因而可被用作抑制或终止神经变性损伤进展的药物或治疗研究的模型。
在基因治疗中，上述用于引导寡聚核苷酸链的载体可被局部注射到患者颞叶或周边区域，或进行全身性注射。更进一步，其可与干细胞一起培养，然后通过全身或局部注射给药。通过这样给药，载体可被引入患者脑部的神经细胞。当转导基因并不永久性地处于每一靶细胞的染色体上时，可以通过周期性重复注射使其摄入。
按照本发明的基因治疗方法包括体内技术，其包括将用于引导所述正义寡聚核苷酸的构成物(正义寡聚核苷酸转移载体)直接导入体内；及离体技术，其包括将基因转移到培养的干细胞中去，然后经过移殖或其他步骤将细胞引入患者体内。将所述正义寡聚核苷酸直接引入细胞的基因治疗同样也是可行的。
本发明基因的正义寡聚核苷酸链所进入的靶细胞可以按照基因治疗的目的进行科学选择。例如，靶细胞包括有脑神经元、脑神经组织及淋巴细胞、纤维原细胞、肝实质细胞及造血细胞。
在上述基因治疗中引入正义寡聚核苷酸链的方法包括病毒引导技术及非病毒引导技术。
至于病毒引导技术，考虑到这样的事实，即要被转移的正义寡聚核苷酸链是一个专门表达于正常脑细胞的外源物质，则可使用逆转录病毒载体的方法。可使用的其他病毒载体包括腺病毒载体、HIV(人类免疫缺陷性病毒)载体、腺伴随病毒(AVV)载体、疱疹病毒载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体及埃-巴二氏病毒(EBV)载体。
现在具体描述构造用于转移正义寡聚核苷酸链的病毒载体的方法及将该正义寡聚核苷酸链转移到靶细胞或目标组织中去的方法。
逆转录病毒载体系统包括一个病毒载体及一个辅助细胞(包装细胞)。辅助细胞指的是这样一个细胞，其已经表达了编码逆转录病毒的结构蛋白gag(在病毒颗粒中的结构蛋白)、pol(反转录酶)、env(壳蛋白)等等的基因，但是其还未形成病毒颗粒。在另一方面，该病毒载体具有包装信号及LTR(长末端重复)，但其缺少为病毒复制所必须的结构基因，例如gag,pol,env等。包装信号是一个序列，其在组装病毒颗粒的过程中起到一个标签的作用。选择性基因(neo,hyg)及已连接于克隆位点的目标正义寡聚核苷酸链插入到病毒基因中去。为了获得高滴度的病毒颗粒，使用一个尽可能短的插入子，提供一个很广泛的包装信号(包括gag基因的一部分)，并小心不要离开gag基因的ATG位点。这些都非常重要。
当携有目标正义寡聚核苷酸的载体DNA被转移到辅助细胞中时，载体基因组RNA为辅助细胞所形成的病毒结构蛋白所包裹，由此病毒颗粒形成且分泌。作为重组病毒的病毒颗粒感染靶细胞，结果，从病毒基因组RNA反转录的DNA序列被整合进细胞核中，以致插入载体的正义基因得以表达。
可以使用粘连蛋白片断的技术以提高目的基因的转移效率，其中此蛋白片段含有细胞粘连区、肝磷脂结合位点和偶联片断[Hanenberg,H.,et al.,Exp.Hemat.,23,747(1995)]。
用于上述逆转录病毒载体系统的逆转录病毒载体实例是获自鼠白血病病毒的逆转录病毒[McLachlin,J.R.,et al.,Proc.Natl.Acad.Res.Molec.Biol.,38,91-135(1990)]。
下面详细描述使用腺病毒载体的方法,腺病毒载体可按照下面所述的方法进行构建，Berkner,K.L.,Curr.Topics Microbiol.Tmmunol.,158,39-66(1992),Setoguchi,Y.,et al.,Blood,84,2946-2953(1994),Kanegae,H.et al.[Jikken Igaku(Experimental Medicine),12,28-34(1994))及Ketner,G.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,91,6186-6190(1994)。
例如，为了构建一个非增殖的腺病毒载体，腺病毒的早期区域E1和/或E3首先被切除，然后，一个含有目的外源基因表达单元(其含有待转移的正义寡聚核苷酸链、所述正义寡聚核苷酸链的转录启动子、用于保障该转录基因稳定性的多聚腺苷酸)的质粒载体、腺病毒基因组DNA的一部分及一个含有腺病毒基因组的质粒被用来共转染293细胞。当由此产生同源重组以替代基因表达单元E1时，获得一个携有目的正义寡聚核苷酸链的非增殖的腺病毒载体。也可通过将腺病毒基因组DNA结合到装配型质粒载体来构建一个具有末端蛋白的3′-末端腺病毒载体。此外，YAC载体也可以用于构建腺病毒载体。
下面简要描述腺伴随病毒(AAV)载体的构建。AAV被发现是污染腺病毒培养体系的一种小病毒。细小病毒属，其在能够在寄主细胞中独立增殖而不需要辅助病毒进行病毒复制，及需要辅助病毒的依赖病毒属已确定为这种病毒。该AAV具有一个很广泛的寄主范围，且是一种感染不同类型细胞的普通病毒。病毒基因组是一个含有4680个核苷酸的线性单链DNA，其两个末端均有145个核苷酸且具有ITR(反向末端重复)序列特征。该ITR区域是复制起点且能起到引物的作用。该ITR对于病毒颗粒的包装及AAV整合进寄主细胞染色体DNA是必须的。关于病毒蛋白，编码非结构蛋白的基因组的左半段为调控蛋白Rep，其控制着复制及转录。
通过利用AAV的特性使其整合进染色体DNA来进行重组AAV的构建，从而可制备目的基因转移载体。该方法下面进行详细描述。首先，构建一个在野生型AAV的5′端及3′端保留有ITRs且携有待转移的正义寡聚核苷酸链的质粒(AAV载体质粒)。病毒复制和病毒颗粒形成所必须的病毒蛋白从另一个辅助质粒中获取。必须保证两个质粒之间无共同的核苷酸序列存在，以使野生型病毒在DNA重组过程中不会出现。然后，这两个质粒通过转染的方法被转移进入293细胞，再用腺病毒作为辅助病毒(当使用293细胞时，腺病毒是非增殖病毒)感染细胞，这样就产生了目的非增殖性重组AAV。既然重组AAV存在于细胞核中，将细胞冷冻解冻并复原且将污染的腺病毒加热至56℃以使之失活。然后，如果必要的话，重组AAV通过氯化铯超速离心法进行分离且浓缩。以这种方式，可以获得用于基因转移的目的重组AAV。
EBV载体的构建可以使用Shimidzu等所描述的方法[Shimidzu,N.,SAIBO KOUGAKU(Cell Technology,14(3),280-287(1995)]。
现简要描述用于转移本发明正义寡聚核苷酸链的EBV载体的构建。EB病毒(埃-巴二氏病毒)为疱疹病毒属的一种,其首次由Epstein及其合作者从非洲淋巴瘤的培养细胞中分离得到[Kieff,E.及Liebowitz,D:Virology,第二版Raven Press,New York,1990,pp1889-1920]。该EBV具有细胞转化活性,且为了将其作为一种基因转移的载体，有必要准备一个缺失该转化活性的病毒。这些可以如下进行操作。
首先，克隆邻近于目标DNA(其中将要插入目的的外源基因)的EBV基因组，然后，插入该外源基因的一个DNA片断及一个抗药性基因，以构建一个载体用于制备重组病毒。然后，当用一个合适的限制性酶进行切割时，用于制备重组病毒的载体被转染到EBV阳性的Akata细胞。然后，用抗表面免疫球蛋白处理以促进病毒的产生，同源重组形成的重组病毒与野生型的Akata EBV一起得以回收。重组病毒被感染进入EBV阴性Akata细胞，且在一个药物的存在下，挑选抗性菌落。由此获得没有野生型EBV的重组病毒专一感染的Akata细胞。此外，通过在重组病毒感染的Akata细胞中引入病毒活性，目的的重组病毒载体可以大批量制备。
在本发明的基因治疗中将目的基因引入靶细胞或组织中去的方法包括有下面两个具有代表性的方法。
第一个方法包括从待治疗的患者体内收集目标细胞，在白细胞介素-2(IL-2)等存在的条件下体外培养该细胞，以转移逆转录病毒载体所携带的目的正义寡聚核苷酸链，然后重新移殖至结果细胞上(体外方法)。该方法适于由基因缺陷或癌症导致的遗传性疾病的治疗。
第二种方法是直接转移基因的方法，其包括将目的的正义寡聚核苷酸直接注射入患者体内或目标位点如大脑组织(直接方法)。
更为具体的是，第一种方法可以以所例举的下列方式进行。使用血筛从单核细胞中细小分离获白患者的单核细胞，例如干细胞，并在IL-2的存在下在一适宜的培养基例如AIM-V培养基中培养72小时，随后加入携有待引入正义寡聚核苷酸的载体。为了增强正义寡聚核苷酸的转移效率，细胞在精蛋白存在下在32℃下培养1小时，然后在2500ppm下离心，再在10％的CO2气体及37℃下培养24小时。重复该程序几次以后，细胞在IL-2的存在下进一步培养，例如可在AIM-V培养基下培养48小时，然后用盐进行洗涤。对活细胞进行计数，通过所述原位PCR评价正义寡聚核苷酸的转导效率，或者当目标是酶的活性时评价酶活性程度。
如细菌或真菌在培养细胞中的培养、支原体感染的存在与否、内毒素的搜索等安全性检查可用于证实其安全性。然后，用预计的正义寡聚核苷酸的有效剂量转化的培养细胞通过静脉点滴注射重新回到患者体内。上述步骤以几个礼拜或几个月为间隔重复进行，以完成基因治疗。
病毒载体的剂量可以根据靶细胞来进行科学选择。通常优选的剂量是，每1×108目标细胞病毒滴度1×103cfu-1×108cfu。
上述第一种方法也可采取一种替换方法，其包括共培养具有携有目标正义寡聚核苷酸的逆转录病毒载体的病毒产生细胞及患者的细胞，以将正义寡聚核苷酸引入靶细胞中去。
对于基因治疗所采用的第二种方法(直接方法)，特别优选进行一个体外预实验，以检查目的正义寡聚核苷酸是否确实可以通过载体基因cDNA的PCR或原位PCR等基因转移方法进行引导，或者检查预期的治疗效果，例如特定活性的提高或靶细胞的生长或生长抑制，是否可以通过引入目的正义寡聚核苷酸来实现。此外，当用到一个病毒载体时，通过进行增殖逆转录病毒等的PCR研究、确定逆转录酶的活性、或者通过RCR技术来监控包裹蛋白(env)基因等，来证实引导目的正义寡聚核苷酸在基因治疗中的安全性。这些非常重要。
对于早老性痴呆症、阿次海默类型痴呆症或帕金森疾病的本发明的基因治疗可以是对神经变性疾病的治疗，其包括从患者体内收集干细胞或脑神经细胞，通过酶处理等方法建立一个培养细胞系，使用AAV等将目的正义寡聚核苷酸引入到目标脑神经细胞中去，用G418细胞进行筛选，测量IL-12等在体内的表达量，给予放射性处理，然后将细胞接种到患者脑组织或者颞叶位点。
本发明进一步提供了一个药物组合物或制剂(基因治疗试剂)，其包括本发明的正义寡聚核苷酸转移载体或用该正义寡聚核苷酸转化的细胞系，其中正义寡聚核苷酸作为活性成分以药理有效量与合适的非毒性药物载体或稀释液组合。
可被用于本发明药物组合物(药物制剂)的药物载体包括稀释液或赋形剂，例如填充剂、扩容剂、粘合剂、致湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂等等，其可以按照药物组合物的使用模式来使用，而且可以按照预期的单位剂型进行选择。
本发明药物制剂的单位剂型与所提到的本发明的多肽制剂制备相同。按照治疗目的可以选择合适的剂型。
下面详细描述按照本发明的神经变性疾病治疗和预防的方法。
本发明提供了一种治疗神经变性疾病的方法，例如早老性痴呆症、阿次海默类型痴呆症、脑缺血或帕金森疾病等，其中涉及到LY6H多肽的过量或短缺。当LY6H多肽活性过度时，可以采取几种方法。第一种方法包括以有效剂量给予一抑制化合物(拮抗剂)，通过与药用合格载体结合阻断其与配体、底物、受体、酶等的结合或者抑制第二信使，由此抑制LY6H多肽的功能，进而改善异常的状态。另一个替代的方法包括给予可溶型LY6H多肽，其能够和内源LY6H多肽竞争性地与配体、底物、受体、酶等结合。该竞争性物质的一个典型的实施例包括LY6H多肽的一个片断。在另一种方法中，给予一个可溶性的能与内源LY6H多肽竞争性结合配体的LY6H。该竞争性物质的一个典型的实例包括LY6H多肽的一个片断。
在另一种方法中，通过对LY6H基因产物运用基因表达抑制技术，可抑制编码内源LY6H多肽的基因的表达。已知该技术包括使用内源性或分次给药的反义序列[例如，Oligodeoxynucleotides asAntisense Inhibitors of Gene Expresion,CRC Press,Boca Raton,FL(1988),O′Connor,J.Neurochem 56:560(1991)]。作为一种替代方法，使用一个能够与所提供的基因形成三股螺旋的寡聚核苷酸[e.g.Lee etal.,Nucleic Acids Res.,6:3073(1979)；Cooney等等，Science,241:456(1988)；Dervan等等，Science,251:1360(1991)]。这些寡聚物可以同样给药，或者相关寡聚物可在体内进行表达。
对于涉及LY6H及其活性的过低表达的异常症状的治疗，可以使用几种不同方法。第一种方法包括把一能以有效治疗剂量联合药用合格载体激活LY6H的化合物给药到一受治体中，并以此改善该症状。在另一种方法中，经过基因治疗，受治体中的相关细胞可启动LY6H的内源性产生。例如可以使本发明的多聚核苷酸通过一缺陷性逆转录病毒载体如上所述进行表达。然后，分离该逆转录病毒表达结构且用一个携有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒质粒载体导入包装细胞中去，以致包装细胞形成含有目的基因的传染性病毒颗粒。将得到的细胞给药到受治体中，以对其进行体内调控，从而可使多肽在体内进行表达。至于基因治疗的综述，可参考Human Molecular Genetics,T.Strachan及A.P.Read,BIOS Scientific Publishers Ltd.(1996),第20章-基因治疗及基于分子遗传学的其他治疗方法，包括其中所引用的特定参考资料。一个替代方法包括将合适的药物载体与治疗剂量的LY6H多肽联合给药。
细胞可以在磷酸盐缓冲盐(pH 7.4)、Ringer′s溶液或胞内组合物注射液中进行配制，或者配成一种剂型，其可用于与有助于提高基因传移效率的物质如精蛋白一起给药。
上述药物制剂的给药方法并不特别限制，可以按照特定的剂型、患者的年龄、性别及其它因素、病情的严重程度等确定合适的给药方式。
药物制剂中活性成分的量及剂量并不特别限制，可以从一个很广泛的范围内依照预期的治疗效果、给药方法、治疗持续的时间、包括年龄、性别在内的患者背景及其它可变的因素来进行自由选择。
一般来说，作为一种药物制剂，携有正义寡聚核苷酸的逆转录病毒载体的剂量以每天每公斤体重的逆转录病毒滴度来衡量，可在大约1×103pfu至1×1015pfu之间。
携有用于转导的正义寡聚核苷酸的细胞，其剂量可以从下列范围进行恰当选择1×104细胞/个体至1×1015细胞/个体。
上述制剂的给药可以每天一次或者几次，或者以一周或几周为间隔进行间歇式给药。优选将有助于提高基因转移效率的物质例如精蛋白或者其制剂联合给药。
当本发明的基因治疗用于治疗神经变性疾病时，其可以与其他的基因治疗(结合基因治疗)，或与使用乙酰胆碱酯酶抑制剂等药物疗法和/或复原治疗一起联合进行。本发明的基因治疗可以参照NIH指南，其中包括安全性方面[Recombinant DNA Advisory Committee,HumanGene Therapy,4,365-389(1993)]。
此外，按照本发明，为了检测LY6H基因是否存在，可准备一个生物样品，例如血液或血清、核酸的选择性提取物，并对其进行LY6H基因的分析。
检测基因的方法可包括制备本发明基因的一个DNA片断，对其进行设计以使其可被用于筛选LY6H基因和/或其扩增。更为具体的是，有可能构建一个DNA片断，其具有探针的特性，可用于具有噬斑杂交、克隆杂交、DNA印迹法或RNA印迹法等等；或者具有探针特性，可用于制备本发明基因全长或部分DNA，其可为一个利用聚合酶扩增核苷酸序列的聚合酶链式反应(PCR)所扩增。对于这个目的，首先制备一个具有与LY6H基因相同序列的引物。然后，该引物作为筛选用探针与生物样品(核酸样品)进行反应，以检查特定的LY6H基因序列存在与否。核酸样品可以通过不同的利于目标序列检测的技术进行制备，例如变性、限制性酶切、电穿孔或印迹法等等。
至于所述筛选的方法，PCR技术的使用从灵敏性的角度来看是特别适用的。因为本发明基因的一个片断被用作引物，所以该技术并不特别限制。这样可以使用迄今已知的技术[Science,230,1350-1354(1985)]及改进的PCR，其近来正在发展中或者将进一步发展[Sakaki,Yoshiyuki等(ed.),Jikken Igaku(Experimental Medicine)，增补版8(9)(1990),Yodosha；Protein,Mucleic Acid,Enzyme:Special Supplement,Kyoritsu Shuppan,35(7)(1990)]。
用作引物的DNA片断是化学合成的寡-DNA，且该寡-DNA可使用自动DNA合成仪等进行合成，例如Pharmacia LKB Gene Assembler Plus(Pharmacia)。待合成的引物(正义引物或反义引物)的优选长度大约为10-30个核苷酸。所述筛选中所使用的探针经常为一个标记的探针，但也可以是没有标记的，或者根据与经直接或间接标记的配体的特异性结合而进行检测。适宜的标记及标记探针或者配基的方法是现有技术。在现有技术中，标记包括放射性同位素、生物素、荧光基团、化学发光基团、酶、抗体等等。其可以通过已知程序来得以使用，例如切口移位、随机引导及激酶处理。
用于检测的PCR技术例如有RT-PCR，也可以使用本领域常用的各种改进技术。
此外，通过使用一个试剂盒来从样品中检测LY6H基因将使上述实验方法更加便利。
因此，本发明提供了一个LY6H基因检测试剂盒，其包括本发明基因的一个DNA片断。
该试剂盒至少包括一个与全部或一部分如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补核苷酸序列进行杂交的DNA片断作为其基本成分，且还可以选择性含有其他成分，例如标记试剂及PCR试剂(例如，TaqDNA多聚酶、脱氧核苷三磷酸、引物等等)。
标记试剂可以是放射性同位素或化学修饰剂如荧光物质，DNA片断可以与标记试剂进行偶联。该试剂盒可进一步包括适宜的反应溶剂或稀释液、标准抗体、缓冲液、洗涤液、反应终止溶液等等，其可以使得试验较容易进行。
本发明进一步提供了一个诊断神经变性疾病的方法其包括使用上述试验方法并使用诊断试剂或诊断试剂盒以实施所述方法。
使用上述方法直接或间接地对获自试样的LY6H基因进行测序，由此可能发现与野生型LY6H基因有高同源性的新的LY6H基因相关基因。
因此，本发明进一步提供了一种方法，其可以在试样中筛选人类与LY6H基因相关的基因，其包括进行上述试验并对试样中含有的LY6H基因进行测序。
通过使用由本发明的人类LY6H基因编码的蛋白(一个具有如SEQID NO:1所示的氨基酸序列的多肽)、一个多肽(其氨基酸序列由如SEQID NO:1所示序列删除、替代或增加一个或多个氨基酸残基后形成)、它们的片断或其抗体等，可测定野生型LY6H和/或突变LY6H。
因此，本发明提供了一种测定抗野生型LY6H和/或突变LY6H抗体的方法，或者提供了一种测定其抗原的方法。通过这些方法，脑神经的损伤程度可以通过野生型LY6H(多肽)的变化来检测。通过利用上述现有技术对LY6H进行测序，可以检测这些变化。最好是通过用所述抗体(单抗或多抗)检测LY6H多肽的差异或其存在与否来进行检则。
下面是一个测定所述野生型和/或突变LY6H的具体实施例。抗LY6H抗体可被用于从一个人体的生物样品(例如血或血清)中免疫沉淀该LY6H多肽，或者能够与蛋白质印迹或免疫印迹聚丙烯酰胺凝胶上的LY6H多肽发生反应。利用免疫组织化学技术，使用抗LY6H抗体可检测石蜡切片或者冷冻组织样本中的LY6H多肽。抗体的诱导和纯化技术为本领域所熟知，且可选择性使用适宜的技术。
有关野生型或突变型LY6H的优选检测技术包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射性免疫试验(RIA)、免疫放射分析(IRMA)及免疫酶试验(IEMA)及一个使用单抗和/或多抗的夹心技术。
本发明进一步提供了一个LY6H配体或LY6H受体，其存在于细胞膜碎片上或细胞表面且具有与LY6H多肽结合的亲和力。使在含有细胞膜碎片的生物样品中的标记的LY6H多肽发生偶联，提取、分离且纯化该偶联产物，鉴别分离产物的氨基酸序列，从而可获得LY6H受体。对该LY6H受体多肽进行测序的方法及制备程序为本领域所熟知。
更进一步，通过应用LY6H受体或其片断来筛选不同的药物，本发明可以用于挑选不同的化合物(其与LY6H受体反应，包括低分子量的化合物、高分子量的化合物、蛋白质、蛋白质片断、抗原、抗体等等)。最好是LY6H受体作为一个整体被使用。在该筛选中所使用的LY6H受体多肽或其片断可被固定在固体基质上或者作为溶液中的游离物质被运输到细胞表面。
上述药物筛选的一个实施例是一个筛选系统，其中用编码LY6H多肽的重组DNA或其片断稳定转化真核或原核寄主细胞，优选其用于竞争性结合试验。作为一种替代，所述寄主细胞，不管是游离态或固定态，都被用于标准结合试验。更为特殊的是，上述药物筛选试验可以包括使LY6H受体多肽或其片断与LY6H多肽或其片断在候选药剂的存在下发生反应并形成复合物，检测上述候选药物对复合物形成的抑制程度。
因此，本发明可以提供一个药物筛选的方法，其包括用LY6H受体多肽或其片断接触候选药剂，然后，使用一个配基采用已知技术检测所产生的复合物或LY6H受体多肽或其片断的复合物。此外，通过测试LY6H受体活性，有可能估计候选药物拮抗LY6H受体的活性并由此对上述LY6H活性进行修饰，也就是说，有可能调控神经元的生长，或者调控蛋白-蛋白偶联或复合物形成的活性。在这样一个竞争性结合试验中，LY6H受体多肽或其片断是经过标记的。当从蛋白-蛋白复合物中分离游离的LY6H受体多肽或其片段并且测量游离物质(非复合型)的标记量时，该测量值作为衡量测试元素与LY6H受体结合的标准。该测量值同样可以作为LY6H受体与LY6H多肽结合受抑制的尺度。通过以这种方式分析LY6H多肽中的一小肽(假肽)，候选药物可以被鉴定为具有LY6H受体拮抗活性的物质。
本发明的另一种药物筛选的方案用于筛选一个与LY6H受体多肽有足够结合亲和力的化合物。简单的来说，该程序包括在塑料栓或其他材料表面等固相载体上合成大量不同的测试肽化合物，用LY6H受体多肽作用测试肽化合物，洗涤后，使用已知技术检测LY6H受体多肽的结合反应产物[例如，PCT专利公开号WO84-03564]。纯化的LY6H受体可被直接包被在板上以用于所述药物筛选程序。将LY6H受体多肽固定于固相载体，用未中和的抗多肽的抗体可收集其抗体。
本发明进一步被导向竞争性药物筛选试验的使用。能够特异性结合LY6H受体多肽的中和抗体被用于与候选化合物进行竞争以结合LY6H受体多肽或其片断。通过这样一个与中和抗体的竞争反应，可以检测具有一个或多个LY6H受体多肽抗原决定镍的任何多肽的存在。
作为药物筛选的进一步的方法，本发明的LY6H多肽或者LY6H基因产物可被用于筛选可激活(激动剂)或者抑制(拮抗剂或者抑制剂)LY6H多肽或LY6H基因产物活性的化合物。
通过使用本发明的LY6H多肽或LY6H基因产物，可以从细胞、无细胞制剂、化学库及天然产生的组合物中鉴别出激动剂或抑制剂。这些激动剂或者抑制剂可以是天然的或者修饰过的本发明LY6H多肽的底物、配体、酶或者受体，或者是本发明多肽的结构或功能性复制体[Coligan等，当代免疫学技术(current Protocols in Immunology),1(2),Chapter 5(1991)]。
原位杂交研究显示本发明LY6H基因在人类正常脑的不同组织中表达，尤其在海马及内嗅皮质有较高水平的表达，而这些位置正是早老性痴呆症患者体内受损最为严重的部位，而其表达水平在早老性痴呆症患者的颞叶包括海马及内嗅皮质中，却有显著的降低。因此，该基因非常有可能与所述疾病的发生及发展紧密联系。
因此，预期该LY6H蛋白或LY6H基因产物的激动剂或拮抗剂可作为神经变性疾病，例如早老性痴呆症、阿尔茨海默类型痴呆、脑缺血及帕金森病的治疗或预防药物使用。
通过筛选用于治疗LY6H基因相关疾病的候选药剂获得的化合物具有本发明蛋白质(本发明基因的表达产物)的功能，例如在中枢或其他神经系统中的神经元生存支持活性、神经延长活性、神经再生活性、神经胶质激活活性等等，以及脑部记忆(记忆形成)活性等生理活性，因此其可以被用作不同类型神经变性疾病例如早老性痴呆症、阿尔茨海默类型痴呆、脑缺血及帕金森病的治疗或预防药物。这样，本发明的蛋白(包括基因表达产物、其部分肽或盐)可被用作筛选能提高本发明蛋白功能的化合物的试剂。
本发明提供了一种筛选可以提高本发明蛋白功能(下文有时表示为本发明蛋白的功能性增强剂)的化合物的方法。更为具体的是，本发明提供了(a)一种筛选本发明蛋白的功能性增强剂的方法，其包括一方面使神经细胞或神经组织与本发明的蛋白相接触(1)，另一方面将该蛋白及测试化合物与所述神经细胞或神经组织相接触(2)，并比较结果。还提供了(b)一种筛选本发明蛋白的功能性增强剂的方法，其包括一方面(1)将本发明蛋白给药至一个脊椎动物，另一方面(2)将本发明蛋白及测试化合物给药至该脊椎动物，并比较结果。
更为具体的是，在上述筛选方法(a)中，在上述(1)和(2)的条件下测量中枢或其他神经系统中的生理活性，例如神经元生存支持活性、神经延长活性、神经再生活性或者神经胶质激活活性，且比较其结果。在筛选方法(b)中，在上述(1)和(2)的条件下测量脑中的记忆(记忆形成)活性，且比较其结果。
用于上述筛选的神经细胞(神经元和神经胶质)包括成神经细胞瘤细胞、神经胶质瘤细胞及他们的杂交瘤细胞(例如，N18TG-2、IMR-32、GOTO(例如、GOTO-P3)、NBl、C6BU-1、U251、KNS42、KNS81及NG108-15细胞及与神经细胞具有潜在区别的PC12细胞)。可被用到的神经组织包括小鼠神经上皮细胞、大鼠海马初次培养细胞、鼠肽培养Prukinje细胞及小鼠背根神经中枢。测试化合物包括多肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取物、植物提取物、动物组织提取物及血浆。这些化合物可以是新型化合物或者已知化合物。
在进行所述的筛选方法(a)时，本发明的蛋白(包括其部分肽或盐)被溶解或悬浮在筛选缓冲液中以制备本发明蛋白的样品。缓冲液可以是任一缓冲溶液，只要其不干扰本发明蛋白与神经细胞或组织之间的接触。(例如磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液等等，其pH大约为4-10，优选pH大约为6-8)。接触的持续时间一般大约是1-10天，优选7-10天。接触的温度一般大约为37℃。本发明蛋白在中枢或其他神经系统中的活性，例如，神经元生存支持活性、神经延长活性、神经再生活性、或者神经胶质激活活性可以通过惯用方法来确定，例如轴突延长的视觉估计、胞内Ca2+浓度的测量等等。
经过在上述条件(1)和条件(2)下进行比较，当测试化合物的所述生理活性，例如，神经元生存支持活性、神经延长活性、神经再生活性、或者神经胶质激活活性，提高至少大约20％，较好不少于大约30％，更好是不低于大约50％，最好是不低于大约70％时，其可被选择作为本发明蛋白的功能性增强剂。
在进行上述的筛选方法(b)时，本发明的蛋白，单独或者与测试化合物联合，通过静脉、皮下、肌肉注射或者口服给药至测试动物体内。用于口服的本发明蛋白的剂量一般大约是每个动物(基于50kg体重)0.1-100mg/天，较好是大约1.0-50mg/天，更好是大约1.0-20mg/天。注射用药物剂量应按照接受者及给药方法进行选择，但较好是每一个哺乳动物(50kg体重)静脉内注射大约0.01-30mg/天，更好是大约0.1-20mg/天，最好是大约0.1-10mg/天。
测试动物包括哺乳动物，如人、猴子、猩猩、小鼠、大鼠、兔子、羊、猪、牛、马、猫、狗和鱼(例如鲤鱼、鲑鱼、青鱼、虹鳟鱼、金鱼等等)。
本发明蛋白在脑中的记忆(记忆形成)活性可按照water maze testprotocol[Morris,R.G.M.,J.Neurosci.Meth.,11,47-60(1984)]来进行测试。经过在所述条件(2)与条件(1)下进行比较，当测试化合物的记忆活性提高不少于约20％，较好不少于50％，最好不要低于70％时，其可作为本发明蛋白的一个功能性增强剂。
作为本发明的进一步的实施方式，筛选试剂盒中本发明的蛋白(包括基因的表达产物、其部分肽或他们的盐)为其主要成分。含有下述组分1-4的试剂盒是本发明的筛选试剂盒实例。
组份1作为试验缓冲液的Hanks溶液；组份2蛋白标准品(本发明蛋白或其盐)；组份3神经细胞或神经组织(所述神经细胞或组织在一个24孔平板上的培养物，104个细胞/孔，使用Eagle's MEM,Hanks溶液在5％CO237℃下培养)；组份4一个用于观察的倒置显微镜；应用上述筛选试剂盒的筛选可以按照下述方式进行[方法]清点含有测试化合物的孔中的轴突延长阳性细胞在每一个视野范围内的数目，且与不含有测试化合物的对照孔中的轴突延长阳性细胞数量进行比较，然后统计性检验其差别。
由筛选方法或本发明的筛选试剂盒获得的化合物或盐选自多肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取物、植物提取物、动物组织提取物等等，并且是一个能够提高本发明蛋白的功能的化合物。该化合物可具有生理活性，例如神经元生存支持活性、神经延长活性、神经再生活性或者神经胶质激活活性等，并因此增加性或协同性地提高本发明的蛋白等的功能，或者，尽管其本身并未显示出该生理活性的组合物，但最终还是提高了本发明蛋白的功能。化合物的盐包括具有生理学上可以接受的的碱(例如碱金属)或酸(例如有机酸，无机酸)的盐。特别优选生理学上可接受的酸加成盐类，例如，无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)的盐或有机酸(例如乙酸、蚁酸、丙炔酸、反丁烯二酸、顺丁烯二酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)的盐。
可以提高本发明蛋白功能的化合物或盐从使用价值上来说是一种安全、低毒性的治疗-预防不同类型神经变性疾病的药物。例如，早老性痴呆症、阿尔茨海默类型痴呆、脑缺血及帕金森病。
上述筛选程序涉及到可以在其细胞表面表达LY6H多肽或者对本发明蛋白反应的细胞的使用。这些细胞例如获自哺乳动物、酵母、果蝇属及大肠杆菌的细胞。将那些表达LY6H多肽的细胞(或者表达多肽的细胞膜)或者对LY6H多肽反应的细胞与测试化合物接触，以观察对结合反应或功能反应的促进或抑制。然后，将与候选化合物接触的细胞的LY6H活性与未接触的类似细胞的该活性进行比较。
上述试验方式可通过以下程序完成。用经直接或间接地标记的候选化合物检测携有LY6H多肽的细胞的结合力，或者在一个测试系统中与标记竞争物质进行竞争。在这种方式中，候选化合物的结合可以很容易被检测到。此外，在此测试中使用一个适用于携有LY6H多肽的细胞的检测系统，可检测候选化合物是否因LY6H多肽的激活而产生信号。该活性的抑制剂在一个已知激动剂的存在下进行测试，且可观察到候选化合物由于激动剂的作用而对活性产生影响。该测试方法包括一个简单的程序，首先将候选化合物与含有LY6H多肽的溶液进行混合以形成混合物，确定LY6H多肽在混合物中的活性，然后将该混合物的LY6H多肽活性与标准品进行比较。
与LY6H蛋白结合的低分子量化合物(促进剂或拮抗剂)可通过BIACORE 2000筛选获得，例如，(Markgren,P.O.,等等，AnalyticalBiochemistry,265,340-350(1998)]。
按照本发明，为了开发一种更具活性或稳定的LY6H多肽衍生物或一种可以增强或阻断LY6H多肽在体内的功能的药物，可构建一个生物活性多肽或其结构类似物以进行相互作用，例如LY6H激动剂、LY6H拮抗剂、LY6H抑制剂等。通过X射线结晶衍射、计算机模拟或者这些技术的联合来确定另一种蛋白与LY6H多肽形成的复合物的三维结构，从而获得上述结构类似物。有关结构类似体的结构信息可以基于同源蛋白的结构通过多肽模拟获得。
为了获得所述更具活性或稳定的LY6H多肽衍生物，可以使用丙氨酸扫描分析。该方法包括将每一氨基酸残基替换为Ala以估计替换对多肽活性的影响。当对多肽的每一个氨基酸残基进行如此分析时，可确定对于该多肽活性或稳定性具有重要性的区域。通过这种方式，有可能设计出一个更具活性或稳定性的LY6H多肽衍生物。
同样有可能分离通过功能性测试及选择出的目标特异性抗体，并分析其晶体结构。通过这种途径，通常可以获得一个药物核心，可以以其为基础进行后继药物的设计。通过诱导功能性药物活性抗体的抗独特型抗体，有可能从化学或生物法产生的多肽库中鉴别及分离该多肽。因此，可以预期选择出的多肽也可以作为一种药物核心。
利用这种方法，有可能设计并开发出具有更高或更稳定的LY6H活性的药物或用作LY6H活性抑制剂、激动剂或拮抗剂的药物。
使用次海马神经元初级培养物，通过滴定法测量该药物对于神经元生存活性的影响[Japan.J.Pharmacol,53,221-227(1990)]，或者检测其对早老性痴呆模型动物(如突变的β-淀粉状前体蛋白基因或突变的早老1型基因的转基因鼠)的神经变性损伤的影响[Nature,373,523-527(1995):Nature Med.,5,560-564(1999)]，从而可评价该药物。
这样获得的化合物不仅可作为药物用于早老性痴呆，而且可以作为治疗性药物用于脑梗塞及其它神经变性疾病。
此外，按照本发明，通过构建LY6H基因携带失效小鼠(具有LY6H基因失效背景的转基因小鼠)，有可能确定LY6H基因核苷酸序列的哪个或哪些位点对于所述LY6H在体内的多种活性产生影响，也可以说，LY6H基因及修饰的LY6H基因的表达产物在体内具有哪些功能。
该方法是这样的一种技术，其可以通过使用同源重组基因对一活体的遗传信息进行有意修饰，且包括这样的一种方法，其使用鼠胚干细胞(ES细胞)作为样本[Capeccchi,M.R.,Science,244,1288-1292(1989)]。
构建所述突变鼠的方法此刻已是本领域技术人员使用的常规技术。通过把一个人类野生型LY6H基因或一个突变的LY6H基因应用于上述技术的改进方法，可以很容易构建突变鼠[Noda,Testuo(ed.):Jikken Igaku(Expenimental Medicine)，增补版，14(20)(1996),Yodosha]。因此，通过使用该技术，有可能设计并开发具有更高或更稳定的LY6H活性的药物或用作LY6H活性抑制剂、激动剂或拮抗剂的药物。
图例的简要说明
图1是一个RNA印迹的图解说明，其显示了LY6H基因在早老性痴呆症患者脑部不同位点的表达模式。
然后每一个注入的克隆在1.5ml的LB培养基中过夜培养，提取DNA且使用一个自动的质粒提取器PI-100(Kurabo)对其进行纯化。污染的E.coli RNA使用RNase降解除去。最后，准备30μl的DNA溶液且使用其中的2μl，近似的DNA尺寸和数量通过微型凝胶法来检查。一个7μl部分被用于测序，剩余的21μl当作质粒DNA在4℃下储藏。通过这种方法，一个可被用于作为FISH(原位荧光杂交，下文将详细描述)探针的装配型质粒通过该程序的简单修改就可以提取到。
然后，实施使用T3,T7或一个合成的寡聚核苷酸引物[Sanger,F.,等.，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,74,5463-5467(1977)]的Sanger等使用的双脱氧中止反应，或联合双脱氧中止反应及PCR的循环序列反应[Carothers,A.M.,et al.,Bio.Techniques,7,494-499(1989)]。这些均是链延长技术，其中链末端为专一的4种碱基且以小量(大约为0.1-0.5μg)的质粒DNA作为模板。
使用一个FITC(异硫氰酸荧光素)-标记的引物作为序列引物，使用Taq多聚酶进行25个循环的反应。对于荧光标记的DNA片断，使用自动DNA序列仪ALFTMDNA序列仪(Pharmacia)确定cDNA的5′端大约有400个核苷酸序列。
3′-端非翻译区在基因中有很高的异源性，适于区别不同的基因。因此，3′-末端区域的测序在某些情况下也在进行。
DNA序列仪所产生的大量的核苷酸序列信息被传输进64-位的计算机DEC3400用于同源性分析。该同源性分析使用一数据库(GenBank,EMBL)按照UWGCGls FASTA程序进行搜索[Pearson,W.R.andLipman,D.J.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,85,2444-2448(1988)]。
Fujiwara等详细描述了上述分析人胎儿脑cDNA库的方法[Fujiwara,T.,等，DNA Res.,2,107-111(1991)]。
ESTs(表达的序列标记表达基因片断的部分DNA序列)任意选自如上构建的人类胎儿脑cDNA库，然后对其测序。
按照FASTA程序在GenBank/EMBL数据库中进行序列搜索中的标为GEN-425D01的克隆被发现与编码鼠Ly6家族蛋白的基因有很高的同源性。
将一个双链DNA插入到一个载体上(pBluescript载体；Stratagene)，以其为模板且以一个合成的寡聚核苷酸作为引物，含有上述克隆的整个编码区的cDNA的核苷酸序列由Sanger's双脱氧链中止法进行确定。
使用ABIPRISMTM377自动DNA序列仪进行测序，其揭示了上述获得的克隆的cDNA序列含有一个420个碱基的氨基酸编码区，并由此编码的氨基酸序列具有140个氨基酸残基。全长cDNA克隆的核酸序列由854个核苷酸组成。全长序列显示于SEQ ID NO:3，可读框的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:2，且为所述核苷酸序列所编码的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:1。
将人类LY6H蛋白的氨基酸序列与其他的Ly6家族蛋白的序列进行比较，且将氨基酸编译起始区保存的核苷酸序列[Kozak,M.,J.Biol.Chem.,266,19867-19870(1991)]与人类LY6H基因的5′-区进行比较。由此确定起始密码子位于位置99-101，其为显示于SEQ ID NO:3的核苷酸序列的第二个ATG三联体。而且，聚腺苷酸信号(AATAAA)位于同一核苷酸序列的位置832-837。(2)RNA印迹分析为了确定LY6H在组织中的表达形状，使用不同的人类组织进行RNA印迹试验分析。
在RNA印迹试验分析中，使用到人类MTN(Multiple-TissueNorthern)BlotⅠ及Ⅱ(CLONTECH)。
使用一个T3及T7启动子序列构成的引物通过PCR扩增cDNA片断。
所述GEN一425D01cDNA克隆的PCR扩增产物使用[32p]-dCTP(随意引物DNA标记试剂盒，Boehringer Mannheim GmbH)进行标记以用作一个探针。
预杂交含有扩增产物的印迹(在制备方案确定的条件下)，然后按照制备方案进行杂交。
在含有1M NaCl/50mM Tris-HCl(pH7.5)/2×Denhardt's溶液/10％右旋糖苷硫酸盐/1％SDS溶液(含有100μg/ml的变性的鲑鱼精液DNA)中，在65℃下过夜，以进行杂交。产物用2×SSC/0.1％SDS在室温下洗涤两次后，再使用0.1SSC/0.1％SDS在65℃下洗涤40分钟。在-70℃下将该滤膜暴露于X光片(kodak)18个小时。
上述测试通过使用下述成人组织进行脑、胰腺、睾丸、小肠、结肠、胸腺、前列腺及卵巢、心脏、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾、脾、睾丸及外周血液白细胞。结果是，在脑、胰腺、睾丸、小肠、结肠、胸腺、前列腺及卵巢中大约有1kb的转录物与LY6H显示出同源性，尤其在脑中同源性最高。(3)使用装配型质粒克隆通过FISH在染色体上定位基因按照已知的方法使用每一种装配型质粒DNA0.5μg作为探针，以进行用于染色体定位的FISH[Takahashi,E.et al.,Hum.Genet.,86,14-16(1990)]。其通过Provia 100胶片(Fuji,ISO 100)或者CCD照相机系统(Applied Imaging Cyto Vision)捕获FISH信号。
结果是，发现人类LY6H基因位于第8条染色体的q24.3上。这样，GEN-425D01被绘制在染色体带8q24.3上。
属于Ly6家族的蛋白的抗体作为基因治疗的一个目的已被用于纯化血液干细胞[van de Rijn,M.,等.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,86,4634-4638(1989)]、血液细胞分化的研究[van de Rijn.M.,et al.,Proc.Natl,Acad.Sci.,USA.,86,4634-4638(1989)；Classon,B.J.及Coverdale,L.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,91,5296-5300(1994)]、免疫细胞的激活[Malek,T.R,et al.,J.Exp.Med.,164,709-722(1986)]、活化免疫细胞产生的抑制[Haque,A.,et al.,Immunology,69,558-563(1990)]等，并且也发现其具有抗肿瘤的活性[Lu,L.,et al.,J.Immunol.,142,719-725(1989)]。本发明样品中所提供的人类LY6H基因使得检测基因在不同组织中的表达、通过基因工程技术制备人类LY6H蛋白及使用该基因构建抗体成为可能，由此使得所述的血液干细胞的纯化、血液细胞分化的研究、免疫细胞的激活、免疫细胞激活的抑制及肿瘤的治疗成为可能。
此外，以高水平在大脑中表达的LY6H基因使得研究神经细胞的分化、神经元的激活及神经及精神疾病的治疗成为可能。
使用人类LY6H蛋白为目标筛选化合物同样也是可能的，且由此获得的化合物对于作为抗人类LY6H蛋白抗体使用也是有用的。
为了调查LY6H基因在早老性痴呆症患者的脑组织中的表达，使用早老性痴呆症患者的脑组织及正常人类脑组织进行RNA印迹分析。
使用人类正常脑blotⅡ及人类早老性痴呆症患者脑blotⅡ(都为Invitrogen)进行RNA印迹分析，且用正常及早老性痴呆症脑比较LY6H基因在不同脑组织中的表达，其分别为额叶、颞叶、顶叶、枕叶、桥、丘脑及脑胼胝体。
结果如图1所示。
正如实施例1所指出的那样，LY6H基因在大脑中有很高水平的表达。上述分析揭示了，当证实该基因在人类正常脑的不同组织中的表达时，该基因在枕脑叶(包括海马及内嗅皮质)有特别高水平的表达，这些区域也已知为早老性痴呆症患者受损最为严重的区域，而当患该病以后，发现这些区域基因的表达显著降低，这些都表明该基因对于早老性痴呆症的发生及发展都有着密切的关系。
因此，期望LY6H基因的正义链、LY6H基因表达产物及LY6H蛋白能用作治疗早老性痴呆症、阿尔茨海默类型痴呆、脑缺血及帕金森病的药物。
此外，也期望LY6H蛋白的激动剂及拮抗剂可用作治疗早老性痴呆症或其他疾病的药物。
作为对照，本发明蛋白活性成分在沸水浴中热处理5分钟后加入到该培养基中(煮沸蛋白组)。(5)海马神经元生存活性的评价如(4)制备的每一组细胞(培养物)培养72小时。然后，本发明蛋白活性成分的海马神经元生存支持活性可通过MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)实验进行评价。例如，本MTT实验可以使用Promega's＂CellTiter 96＂测试系统来进行。(6)中脑神经元的分离及培养在胚胎形成第14天从鼠胎SD中无菌分离出其全脑并将腹侧中脑切除。使用手术刀将切除的组织切成细薄片，并在含有0.25％胰岛素及0.002％DNaseⅠ的PBS中，在37℃酶处理培养20分钟。通过加入牛胎血清使酶反应中止后，使用一个具有塑料顶端的吸液管吹吸细胞消化液，重复三次以分散细胞。使细胞分散物经过一个由两层叠层式镜头纸组成的滤膜以除去未消化的组织，并在1000rpm下离心5分钟。细胞用DMEM/F12(Gibco)洗涤且移入含有10％FCS-DMEM/F12的聚L赖氨酸(Sigma)包被的96-孔板，其最终浓度为3×105cells/cm2。(7)本发明蛋白活性成分的处理如(6)制备的细胞培养24小时后，将培养基换为1％N2补充(Gibco)-DMEM/F12，本发明蛋白活性成分如(2)进行制备后，将其加入到该培养基中(发明组)。
作为对照，本发明蛋白活性成分在沸水浴中热处理5分钟后加入到该培养基中(煮沸蛋白组)。(8)中脑神经元生存支持活性的评价如(7)准备的每一组细胞(培养物)培养72小时。然后，本发明蛋白活性成分的中脑神经元生存支持活性可通过MTT[3-(4,5-dinetyhlthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)实验进行评价。例如，本MTT实验可以使用Promega′s＂CellTiter 96＂测试系统来进行。(9)多巴胺能神经元生存支持活性的评价如(7)准备的每一组细胞(培养物)培养72小时。然后，在室温下置于4％多聚甲醛-PBS中15分钟，然后用1％Triton X100/PBS使其经过一个膜。
为了避免抗体的非特异性结合，细胞在10％羊血清一PBS中培育一个小时，然后利用一个抗酪氨酸羟化酶多克隆抗体(Chemicon；使用PBS稀释1000倍)使细胞在4℃下温育16个小时。移去抗体溶液后，细胞用PBS洗涤。然后加入过氧化物酶标记的右旋糖苷聚合物偶联的羊抗兔免疫球蛋白(Dako)，细胞在室温下温育一个小时。
酪氨酸羟化酶阳性细胞通过以二氨基联苯胺作为底物的颜色反应来检测。利用作为标记的酪氨酸羟化酶阳性细胞的数量，可以评价多巴胺能神经元生存支持活性。
工业实用性本发明提供了一个新型脑特异性基因及其编码的蛋白，并且通过它们的使用，本发明也同时提供了有用的技术，用于血液干细胞纯化、血细胞分化的研究、免疫细胞的激活、活化免疫细胞产生的抑制及肿瘤的治疗。同时，本发明也提供了新型基因，其具有下列生理活性，如大脑神经元生存支持活性、神经延长活性、神经再生活性、神经胶质激活活性及脑记忆形成活性。
考虑到在早老性痴呆症患者的脑颞叶中其表达水平的显著降低，本发明基因被认为可以抑制组织的神经变性，由此其可被用作一种基因治疗药物。而且，本发明基因的表达产物可应用于治疗或预防这些神经变性疾病的药物。
序列表<110>Ostuka Pharmaceutical Co.,ltd.<120>LY6H基因<130>P99-45<160>3<170>Patentln Ver.2.0<210>1<211>140<212>PRT<213>人类胚胎大脑<400>1Met Leu Pro Ala Ala Met Lys Gly Leu Gly Leu Ala Leu Leu Ala Val1 5 10 15Leu Leu Cys Ser Ala Pro Ala His Gly Leu Trp Cys Gln Asp Cys Thr20 25 30Leu Thr Thr Asn Ser Ser His Cys Thr Pro Lys Gln Cys Gln Pro Ser35 40 45Asp Thr Val Cys Ala Ser Val Arg lle Thr Asp Pro Ser Ser Ser Arg50 55 60Lys Asp His Ser Val Asn Lys Met Cys Ala Ser Ser Cys Asp Phe Val65 70 75 80Lys Arg His Phe Phe Ser Asp Tyr Leu Met Gly Phe Ile Asn Ser Gly85 90 95Ile Leu Lys Val Asp Val Asp Cys Cys Glu Lys Asp Lcu Cys Asn Gly100 105 110Ala Ala Gly Ala Gly His Ser Pro Trp Ala Leu Ala Gly Gly Leu Leu115 120 125Leu Ser Leu Gly Pro Ala Leu Leu Trp Ala Gly Pro130 135 140<210>2<211>420<212>DNA<213>人类胚胎大脑<400>2atgctgcctg cagccatgaa gggcctcggc ctggcgctgc tggccgtcct gctgtgctcg 60gcgcccgctc atggcctgtg gtgccaggac tgcaccctga ccaccaactc cagccattgc 120accccaaagc agtgccagcc gtccgacacg gtgtgtgcca gtgtccgaat caccgatccc 180agcagcagca ggaaggatca ctcggtgaac aagatgtgtg cctcctcctg tgacttcgtt 240aagcgacact ttttctcaga ctatctgatg gggtttatta actctgggat cttaaaggtc 300gacgtggact gctgcgagaa ggatttgtgc aatggggcgg caggggcagg gcacagcccc 360tgggccctgg ccggggggct cctgctcagc ctggggcctg ccctcctctg ggctgggccc 420<210>3<211>854<212>DNA<213>人类胚胎大脑<220><221>CDS<222>(99)..(518)<400>3acgccgcccg agcccggagt gcggacaccc ccgggatgct tgcgccccag aggacccgcg 60ccccaagccc ccgcgccgcc cccaggccca cccggagc atg ctg cct gca gcc atg 116Met Leu Pro Ala Ala Met1 5aag ggc ctc ggc ctg gcg ctg ctg gcc gtc ctg ctg tgc tcg gcg ccc 164Lys Gly Leu Gly Leu Ala Leu Leu Ala Val Leu Leu Cys Ser Ala Pro10 15 20gct cat ggc ctg tgg tgc cag gac tgc acc ctg acc acc aac tcc agc 212Ala His Gly Leu Trp Cys Gln Asp Cys Thr Leu Thr Thr Asn Ser Ser25 30 35cat tgc acc cca aag cag tgc cag ccg tcc gac acg gtg tgt gcc agt 260His Cys Thr Pro Lys Gln Cys Gln Pro Ser Asp Thr Val Cys Ala Ser40 45 50gtc cga atc acc gat ccc agc agc agc agg aag gat cac tcg gtg aac 308Val Arg Ile Thr Asp Pro Ser Ser Ser Arg Lys Asp His Ser Val Asn55 60 65 70aag atg tgt gcc tcc tcc tgt gac ttc gtt aag cga cac ttt ttc tca 356Lys Met Cys Ala Ser Ser Cys Asp Phe Val Lys Arg His Phe Phe Ser75 80 85gac tat ctg atg ggg ttt att aac tct ggg atc tta aag gtc gac gtg 404Asp Tyr Leu Met Gly Phe Ile Asn Ser Gly Ile Leu Lys Val Asp Val90 95 100gac tgc tgc gag aag gat ttg tgc aat ggg gcg gca ggg gca ggg cac 452Asp Cys Cys Glu Lys Asp Leu Cys Asn Gly Ala Ala Gly Ala Gly His105 110 115agc ccc tgg gcc ctg gcc ggg ggg ctc ctg ctc agc ctg ggg cct gcc 500Ser Pro Trp Ala Leu Ala Gly Gly Leu Leu Leu Ser Leu Gly Pro Ala120 125 130ctc ctc tgg gct ggg ccc tgatgtctcc tccttcccac ggggcttctg 548Leu Leu Trp Ala Gly Pro135 140agcttgctcc cctgagcctg tggctgccct ctccccagcc tggcgtggct ggggctgggg 608gcagccttgg cccagctccg tggctgtggc ctgtggctct cactcctccc ccgacgtgaa 668gcctccctgt ctctccgcca gctctgagtc ccaggcagct ggacatctcc aggaaaccag 728gccatctggg caggaggcct ggggatgagg gtgggggggg acccccaggt cccggagggg 788aagtgaagca acagcccagc tggaagggcg tcttctgcgg agaaataaag tcacttttga 848gtcctg85权利要求
1．一种基因，其包括编码下述蛋白(a)或(b)的一个核苷酸序列。(a)具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白(b)具有由如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列删除、替代或增加一个或多个氨基酸后形成的氨基酸序列的蛋白，其生理学活性选自神经元生存支持活性、神经延长活性、神经再生活性、神经胶质激活活性及脑记忆形成活性组中的至少一种。
2．如权利要求1所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3．一种基因，其包括下述多聚核苷酸(a)或(b)(a)一个含有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的多聚核苷酸(b)一个多聚核苷酸，其在严格条件下与具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的DNA进行杂交。
4．如权利要求1-3之一所述的基因，其特征在于该基因是一个人类基因。
5．一种基因表达载体，其含有如权利要求2或3所述的基因。
6．一种寄主细胞，其含有如权利要求5所述的基因表达载体。
7．一种表达产物，其由如权利要求6所述的寄主细胞表达。
8．一种蛋白，其由如权利要求1所述基因编码。
9．一种抗体，其具有与如权利要求7所述的表达产物或权利要求8所述的蛋白的结合亲和力。
10．一种表达产物，其含有由如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列形成的基因的全部或一部分，且其生理活性选白神经元生存支持活性、神经延长活性、神经再生活性、神经胶质激活活性及记忆(脑记忆形成)活性中的至少一种。
11．一种治疗或预防神经变性疾病的组合物，其包括有如权利要求8所述蛋白、具有其部分氨基酸序列的等价蛋白，或如权利要求10所述作为一种活性成分与药物载体结合的表达产物。
12．如权利要求11所述的用于治疗或预防神经变性疾病的组合物，其特征在于所述神经变性疾病选自早老性痴呆症、阿尔茨海默类型痴呆、脑缺血及帕金森病。
13．一条含有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中的至少20个连续组成核苷酸的有义寡聚核苷酸。
14．一种基因治疗组合物，其含有如权利要求13所述的作为活性成分与药物载体结合的有义寡聚核苷酸。
15．一种基因特异性探针，其含有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中的至少10个连续组成核苷酸的寡聚核苷酸序列。
16．一种用于筛选候选组合物的方法，其包括使用如权利要求8所述的蛋白、具有其部分氨基酸序列的等价蛋白、或者如权利要求10所述的表达产物，所述候选化合物结合或影响该蛋白、等价蛋白或基因产物。
17．用于治疗或预防神经变性疾病的方法，其包括给予患者有效量的如权利要求8所述的蛋白、具有其部分氨基酸序列的等价蛋白或者如权利要求10所述的表达产物。
18．如权利要求17所述的用于治疗或预防神经变性疾病的方法，其特征在于所述神经变性疾病选自早老性痴呆症，阿尔茨海默类型痴呆、脑缺血及帕金森病。
19．一种基因治疗的方法，其包括给予患者有效量的如权利要求13所述的有义寡聚核苷酸。
全文摘要
本发明提供了一种脑特异性基因，其对于治疗早老性痴呆症是非常有用的，例如，其包括一个编码如SQ ID NO:1所示氨基酸序列的核苷酸序列及其片断的核苷酸序列；一个含有该基因的表达载体；一个含有该表达载体的寄主细胞；该基因的一个表达产物；该产物的一个抗体；一种用于治疗或预防神经变性疾病的药物组合物等。
文档编号C07K14/705GK1318099SQ99811019
公开日2001年10月17日 申请日期1999年9月16日 优先权日1998年9月17日
发明者堀江正人, 奥富圭一, 谷口吉弘, 铃木干生, 大渊丰 申请人:大塚制药株式会社