专利名称：采用双－(三氯甲基)碳酸酯偶合氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及采用双-(三氯甲基)碳酸酯原地生成氨基酸酰氯的方法，并涉及将这种方法用于固相肽的合成和固体载体的衍生作用的方法。
本发明背景在肽合成领域中，某些偶合被认为是难以偶合的，尤其那些涉及偶合大体积(bulky)的或空间位阻的氨基酸残基，如N-烷基化、C-烷基化和Cα支链氨基酸。在实施这些偶合的过程中，为了获得可接受的收率，人们已经开发出许多特别的偶合试剂。在已知的一些其它方法中，采用预制的氨基酸酰氯以改进偶合反应的结果。
在固相肽合成(SPPS)中大量使用保护的氨基酸酰氯受到限制，主要是因为具有用酸不稳定的保护基团(包括但不局限于叔丁基(t-Bu)、叔丁氧碳基(Boc)或三苯甲基(Trt))保护的具有侧链的芴基甲氧羰基(Fmoc)氨基酸的氯化物，具有有限的结构(shelf)稳定性。例如，Fmoc-氨基酸(AAs)的氯化物与叔丁基保护的侧链通常不相容。在一些情况下(天门冬氨酸和谷氨酸)，不能获得所述氯化物，在另一些情况下(酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸)，它们的结构稳定性在实际用途中显得不足。另外，由于副反应和需要特别的反应条件和纯化，制备源于Fmoc-赖氨酸(Boc)、Fmoc-色氨酸(Boc)、Fmoc-半胱氨酸(Trt)、Fmoc-谷氨酸(Trt)和Fmoc-精氨酸-2,2,5,7,8-五甲基-苯丙二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)存在问题(Carpino等，Acc.Chem.Res.29:268,1996)。这个问题也阻碍大量使用预制的Fmoc氨基酸酰氯来自动(automatic)合成肽。尽管存在这些限制，但酰氯仍用于SPPS，尤其用于连接受阻的仲氨基酸(参见Carpino等1996，出处同上和其中的参考)。
将保护的氨基酸与Nα-烷基化的氨基酸偶合以前被认为是一种在溶液和固相中难以进行的偶合。这种偶合用于模型肽中以说明新的、更有效的偶合方法的有效性。在这些模型中，N-甲基化的氨基酸被用作亲核试剂，因为偶合至在Cα(如N-甲基缬氨酸和N-甲基氨基异丁酸)上具有空间位阻的N-甲基化氨基酸被发现比偶合至脯氨酸要慢许多。
尤其推荐某些偶合剂和活化方法如溴-三-吡咯烷基-六氟磷酸鏻(PyBroP)(Coste等，Tetrahetron Lett.31 669,1990),1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)/O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸脲鎓(uronium)(HATU)(Carpino等，J.Chem.Soc.,Chem.Commun.201,1994)，尿烷保护的N-羧酸酐(UNCA)(Spencer等，Int.J.Pep.Prot.Res.40:282,1992)和酰卤(Carpino等，1996，出处同上)以偶合至N-烷基氨基酸上。
发现酰氯法为偶合保护的氨基酸成空间位阻的氨基酸衍生物，如在主链环肽的SPPS中的N-烷基氨基酸的优良方法。为了克服预制酰氯法的限制并且可以将其广泛用于SPPS，该方法将有利地高效和广泛用于原地生成Fmoc-AAs氯化物。
也称为六氯二甲基碳酸酯或“三光气”的双-(三氯甲基)碳酸酯试剂(BTC)(Councler,C.Ber.Dtsch.Chem.Ges.13:1697,1880)为等价于三摩尔碳酰氯的稳定的固体碳酰氯替代物。三光气已经被用作含有氮杂丙氨酸、氮杂天门冬氮酸和氮杂天冬酰胺残基的肽的各种氮杂类似物的液相和固相合成中的有效羰基化试剂(Andre等，J.Pep.Sci.3:429,1997)。
将三光气用作形成异氰酸酯或肽化学中的其它反应性物质的试剂也已经被公开(Eckert DE3440141,Nippon Kayaku,JP10007623)。将三光气用于制备各种药物的中间体也已经被公开(Hoffmann等，DD292452)。
在本领域中没有提到或建议的是三光气试剂适于原地生成保护的氨基酸酰氯，即用作SPPS中的偶合剂(综述参见Cotarca等，Synthesis 553,1996)。
光气长期以来被认为是一种实验室和工厂规模操作的有用物品，尽管使用时存在危险(尤其是对呼吸道危害)也被广泛报导。已经用作光气替代物的、通常称为“二光气”的液体氯代甲酸三氯甲酯(Fridgen,L.N和Prol,J.J.,J.Org Chem 54:3231,1989)已被证实可以用于所有常规光气反应，但是作为一种液体，它在运输和贮存时仍然存在相当大的危险。作为一种结晶固体(熔点81-83℃),BTC更安全并且易于处理，并因此可以用作所有需要光气化学的用途的试剂(Cotarca等，出处同上)。总而言之，一摩尔BTC生成三摩尔当量的光气，后者分别与羟基、胺或形成氯代甲酸酯的羧酸亲核试剂、异氰酸酯或酰氯反应。考虑到所有这些特点以及BTC便宜并且与光气相比不易水解，使人难以理解的是以前没有人考虑采用BTC作为通用的偶合剂。主链环肽类似物主链环化是一个概念，它是指可以将肽转化为具有所需药学性质如代谢稳定性、选择性和改进的生物利用度的构象受限的模拟肽(peptidomimetics)(Gilon等，Biopolymers 31:745,1 991；Byk等，J.Med.Chem.39:3174,1996；Gilon等，J.Med.Chem.41:919,1998)。
在主链环化中通过各种间隔基将肽主链上的Nα和/或Cα原子连接起来。为了合成N-主链环肽，制备大量正交保护的官能化Nα烷基氨基酸(N-结构单元)(Bitan等，J.Chem.Soc.,Perkintrans,I 1501,1997a；Muller等，J.Org.Chem.62:411,1997)。通过SPPS或溶液法将这些单元掺入肽并在从Nα-烷基上的ω-官能中正交脱除保护基团后使它们环化。合成N-主链环肽的关键步骤为将保护的氨基酸偶合至位于肽基树脂上的Nα(ω-官能化烷基)氨基酸残基的空间位阻的仲胺上。
以前有人报导过掺入Nα(ω-官能化烷基)甘氨酸结构单元的N-主链环肽的合成。在这些情况下，通过用苯并三唑-1-基-氧-三(二甲氨基)-六氟磷酸鳞BOP或PyBroP作为偶合剂进行多级偶合(multiplecouplings)从而将保护的氨基酸偶合至连接肽基树脂的甘氨酸结构单元的仲胺上(Bitan等，J.Pept.Res.49:421,1997b；Byk等，1996，出处同上)。通常将保护的AAs偶合至非甘氨酸的结构单元(非-Gly主链环状结构单元)上被认为是很困难的和甚至是不可能的。
人们已经证实采用酰氯法而不是酰氟(Carpino等，1996出处同上)或其它偶合剂如PyBrOP(Coste等，出处同上)、HOAt/HATU(Carpino 1994出处同上)、2-(2-氧代-1(2H)-吡啶基)-1,1,3,3，-双五-亚甲基四氟硼酸脲鎓(TOPPipU)(Henklein等.在""Peptides 1990"Proc.ofthe 21th European Peptide Symposium",E.Giralt和D.Andreu，编，67页，ESCOM Leiden,1990)、UNCA(Spencer等，1992)和Mukaiyama试剂(Mukaiyama,T.Angew.Chem.Int.Ed.Ingl.18:7078,1979)，可以中等至高收率地将许多Fmoc AAs偶合至空间位阻的仲胺(包括许多连接至肽基树脂上的非甘氨酸结构单元)上。
本发明概述本发明的一个目标为提供对SPPS中的困难偶合的一种改进的方法。本发明的另一个目标为提供一种提高固相肽合成中所需立体异构体收率的方法。另一个目标为提供促进多级平行合成(multipleparallel synthesis,MPS)的方法。再一个目标为在SPPS中提供一些方法从而将保护的氨基酸连接至官能化固体载体上或将生物医学重要的配体连接至肽或肽基树脂上。另一个目标是提供将环肽连接于固体载体的方法。另一个目标为提供依次或在环肽的桥上形成脲键的方法。
提供本发明的方法，通过采用一种试剂如光气，二光气或更优选的三光气从而原地生成保护的氨基酸酰氯。这样生成的保护的氨基酸酰氯尤其适用于将氨基酸残基偶合至肽链上。它们也可以用于将碳水化合物部分偶合至肽链上。
采用本发明方法原地生成酰氯，由此进一步提供一种方法，所述方法为通过胺主链或通过氨基酸侧链官能度，可以将其它生物学上重要的酸(包括但并不局限于谷氨酸、DTPA和DOTA)连接至肽链上。人们已经发现根据本发明的原理，双-(三氯甲基)碳酸酯(普通化学也称为三光气)可以用于原地生成保护的氨基酸酰氯。采用这种方法可以克服许多在SPPS的困难偶合步骤中遇到的问题，尤其所述偶合步骤涉及空间位阻的氨基酸残基或大体积的氨基酸类似物。
在提供的方法中，采用BTC作为方便和高效的偶合剂以用于SPPS中的困难的偶合。这些方法使SPPS中的具有构型保留的所需产物的收率显著提高，而没有不需要的副反应，并且还可以促进多级平行肽合成的实施。这些方法还促进采用多级环化的复杂的肽类似物如二环肽和三环肽的合成。
本发明的一个方法提供将氨基酸残基偶合至肽链上的方洗其包括(ⅰ)提供具有游离羧基和封闭氨基的氨基酸残基，任选具有其它的封闭官能侧链；(ⅱ)在对这个反应呈惰性的溶剂中，使封闭氨基酸与双(三氯甲基)碳酸酯反应从而获得氨基酸酰氯；(ⅲ)通过加入有机碱中和游离酸；(ⅳ)将含有氨基酸酰氯的所得悬浮液加入选自以下的化合物中含有封闭羧基端和游离端氨基的肽、具有至少一个游离氨基端的肽基树脂；(ⅴ)提供反应条件，使氨基酸酰氯偶合至肽上从而得到通过一个氨基酸残基延伸的肽。
本发明方法提供将氨基酸残基偶合至固体载体上的方法，其包括(ⅰ)提供具有游离羧基和封闭氨基的氨基酸残基，任选具有其它封闭官能侧链；(ⅱ)在对这个反应呈惰性的溶剂中，使封闭氨基酸与双(三氯甲基)碳酸酯反应从而获得氨基酸酰氯；(ⅲ)通过加入有机碱中和游离酸；(ⅳ)将含有氨基酸酰氯的所得悬浮液加入选自以下的化合物中具有至少一个游离氨基端的树脂和具有一个能够结合氯化物的官能团的固体载体；(ⅴ)提供反应条件，使氨基酸酰氯偶合至固体载体上。
根据本发明，目前最优选的实施方案可以概述于方案1中方案1在对这个反应呈隋性的溶剂中采用BTC的困难偶合 BTC=双-(三氯甲基)碳酸酯(三光气)Fmoc-AA=芴基甲氧羰基-蛋白原-α-氨基酸R=所有蛋白原α-氨基酸的侧链R’=CH3,(CH2)n=2-4-NH-Alloc,(CH2)n=2-3-COO烯丙基R3”N=叔胺或芳香胺附图简述
图1实施例38所得产物的HPLC色谱图。
图2实施例38所得产物的质谱分析。
图3实施例49所得产物的HPLC色谱图。
图4实施例55所得产物的HPLC色谱图。
图5实施例63所得PTR3227的HPLC色谱图。
图6实施例64所得PTR3229的质谱分析。
图7实施例65A所得PTR3237的质谱分析。
图8实施例65B所得PTR3241的HPLC色谱图和质谱分析。
图9实施例66所得MPS肽数20的HPLC色谱图和质谱分析。
图10在实施例67中合成的环孢菌素类似物的HPLC色谱图和质谱分析。
本发明详述根据本发明，提供采用试剂如光气、二光气或三光气原地生成保护的氨基酸酰氯的方法。在此处所有的具体优选实施方案中，采用固相肽合成对本发明方法进行举例说明，尽管这些方法也非常适于如现有技术所示在的溶液中合成肽。另外，上述方法可以潜在地用于将其它部分偶合至肽链，包括但不限于将碳水化合物部分偶合至肽链上，以及用于多级平行肽合成的方法中。本发明方法也非常适于合成复杂肽类似物如二环肽和三环肽，以及合成包括七种空间位阻的N-甲基氨基酸的环孢菌素类似物。这些方法也适于形成序列中或环化肽的桥上的脲键。缩写此处所用的某些缩写用来描述本发明以及制备和使用它的方法。
例如，AA指氨基酸；ACN指乙腈；Alloc指烯丙氧羰基；Boc指叔丁氧基羰基；BOP指苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)-六氟磷酸鏻；BTC指双-(三氯甲基)碳酸酯；DCM指二氯甲烷；DIEA指二异丙基乙胺；DOTA指四氮杂环癸烷四乙酸；DTPA-二亚乙基三胺五乙酸；eq指当量；Fmoc指芴基甲氧羰基；Gln-谷氨酸盐；HATU指O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3,-四甲基六氟磷酸脲鎓；HOAt指l-羟基-7-氮杂苯并三唑；HPPA指对羟基苯基丙酸；MBHA指甲基苯并hydrilamine；Me指甲基；MPS指多级平行合成；NMP指N-甲基吡咯烷酮；Pmc指2,2,5,7,8-五甲基苯丙二氢吡喃-6-磺酰基；PyBrOP指溴-三-吡咯烷酮基-六氟磷酸鳞；SPPS指固相肽合成；t-Bu指叔丁基；TFA指三氟乙酸；THF指四氢呋喃；TIS指三异丙基硅烷；TOPPipU指2-(2-氧代-1(2H)-吡啶基)-1,1,3,3-双戊亚甲基四氟硼酸脲鎓；Trt指三苯甲基；UNCA指尿烷保护的N-羧酸酐。氨基酸用于本发明的氨基酸为商品氮基酸或可通过常规合成法来获得。根据IUPAC规定，天然编码氮基酸和它们的衍生物用三个字母代码来代表。当没有指明时，采用L-异构体。D异构体用残基缩写前面的“D”代表。
非代码的氨基酸表Abu指2-氨基丁酸，Aib指2-氨基-异丁酸，β-Ala指β-丙氨酸，Amb指3氨基甲基苯甲酸；ChxGly指环己基甘氨酸，Dab指二氨基丁酸，GABA指γ氨基丁酸，Hcys指高半胱氨酸，1Nal指1-萘丙氨酸，2Nal指2-萘丙氨酸，Nva指正缬氨酸，(p-Cl)Phe指对氯苯丙氨酸，(p-NH2)Phe指对氨基苯丙氨酸，(p-F)Phe指对氟苯丙氨酸，(p-NO2)Phe指对硝基苯丙氨酸，Sar指肌氨酸，Thi指噻吩基丙氨酸。
此处所用和权利要求中的“封闭氨基酸”是指其中反应性基团被特定封端或被保护基团(可以选择性除去)保护的氨基酸，并且还可以用本领域熟知的术语“保护的氨基酸”来表示。
此处所用的“主链环肽”指线性肽的类似物，其含有至少一个结构单元，所述结构单元通过肽主链上的α氮原子与另一结构单元或与该序列中的另一个氨基酸相连从而形成桥。“结构单元”指氨基酸的Nα-ω-官能化衍生物。用于合成主链环肽的结构单元“结构单元”指具通有式1的氨基酸的Nα-ω-官能化衍生物， 式1其中X为选自以下的间隔基亚烷基、取代亚烷基、亚芳基、亚环烷基和取代的亚环烷基；R’为氨基酸侧链，任选与特定的保护基相连；B为保护基，选自烷氧基、取代的烷氧基或芳基羰基；G为选自以下的官能团胺、硫醇、醇、羧酸和酯、醛、醇和烷基卤；A为G的特定的保护基团。
掺入肽序列中的结构单元具有下面结构， 其中X为选自以下的间隔基亚烷基、取代亚烷基、亚芳基、亚环烷基和取代的亚环烷基；R’为氨基酸侧链，任选与特定的保护基相连；G为选自以下的官能团胺、硫醇、醇、羧酸和酯和烷基卤；将其掺入肽序列中，随后通过官能团G与所述肽序列中的氨基酸的一个侧链或与另一个ω-官能化氨基酸衍生物进行选择性环化。
所述结构单元由相应修饰的氨基酸的三个字母代码缩写表示，随后为反应基团的类型(N为胺，C为羧基)，以及显示间隔的亚甲基数。例如，GlyC2描述具有一个羧基反应基团和两个碳的亚甲基间隔基修饰的Gly残基，PheN3代表具有一个氨基反应基团和三个碳的亚甲基间隔基的修饰的苯丙氨酸基团。
以下的国际专利申请描述了生产所述结构单元的方法WO95/33765和WO 98/04583和美国专利第5723575、5811392、5883293、5874529和5770687号，其全部通过参考结合到本文中。通用方法针对以下实施例的主体部分，为了简便，将贯穿始终的某些方法以通用方法开头的形式进行概述。通用方法A模型肽的SPPS在配有多孔玻璃底的反应容器中，将1克Rink Amide甲基二苯甲胺(benzhydrilamine)(MBHA)树脂(0.55毫摩尔/克)在N-甲基吡咯烷酮(NMP)中溶胀1.5小时并置于摇床中。用NMP中的20％哌啶脱除Fmoc保护(两次15分钟，每次8毫升)。用NMP洗涤后(5次，8毫升2分钟)。通过Kaiser测试监测Fmoc的脱除。
在室温下采用NMP(8毫升)中的Fmoc AA或Fmoc N-Me AA或Fmoc-结构单元(3当量)PyBrOP(3当量)二异丙基乙胺(DIEA)(6当量)实施偶合循环1小时。通过Kaiser测试监测反应的完成，并经过滤脱除溶剂。用NMP(5次，8毫升2分钟)洗涤所述树脂。如上脱除Fmoc保护基团。如上所述采用PyBrOP作为偶合剂，将Fmoc AA或FmocN-Me AA或Fmoc结构单元偶合至AA-树脂上。如通用方法B所述将Fmoc AA或Fmoc N-Me AA或Fmoc结构单元偶合至N-Me或结构单元树脂。通过重复如上所述的脱除Fmoc保护基团和偶合循环来延长肽。最终的Fmoc去保护后进行洗涤(NMP5次，8毫升2分钟和二氯甲烷(DCM)3次，8毫升2分钟)。在真空下干燥所述肽基树脂。快速裂解用含有1％三异丙基硅烷(TIS)和4％水的95％的三氟乙酸(TFA)处理少量的肽基树脂。通过氮气流脱除溶剂并将所述残余物溶于水乙腈(含0.1％TFA的ACN)中进行后处理。经过滤将所述溶液注入HPLC和/或质谱仪中。通用方法B采用BTC将Fmoc-AA’s偶合至AA肽基树脂和偶合至N-烷基化AA肽基树脂中将Fmoc AA或Fmoc N-Me AA或Fmoc-结构单元(5当量，0.275毫摩尔)和BTC(1.65当量，0.09毫摩尔)溶于四氢呋喃(THF)、二噁烷、二甘醇二甲醚或1,3-二氯丙烷中，得到0.15M溶液，往其中加入2,4,6-三甲吡啶(14当量，0.75毫摩尔)，得到白色悬浮液。将这种悬浮液倒入用合适溶剂预洗过的N-Me AA-或结构单元-肽基树脂中。将所述混合物在50℃下摇动1小时并过滤。用DCM洗涤肽基树脂，用合适的反应溶剂溶胀并再次重复所述偶合。在将Fmoc-AA's偶合至AA肽基树脂的情况下，只在室温下使用二噁烷中的3当量Fmoc-AA’s、1当量BTC和8当量2,4,6-三甲吡啶1小时。通用方法C将Fmoc-AA或N-Me AA或结构单元偶合至官能化固体载体上如方法B所述，原地制备Fmoc AA或Fmoc NMe AA或Fmoc-结构单元氯化物。将二噁烷中的悬浮液倒入预活化的玻璃或羟甲基化的聚苯乙烯中。在50℃下摇动所述混合物1小时并过滤。用DCM洗涤衍生载体。通过Fmoc哌啶法测量衍生度。通用方法D氨基或羟基肽基树脂的衍生化如方法B所述，采用BTC将一些酸如1,2,3,4-四-O-乙酰基谷氨酸、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、四氮杂环癸烷四乙酸(DOTA)或对羟基苯丙酸(HPPA)转化为其相应的酰氯。将所述悬浮液倒入氨基或羟基肽基树脂中并在50℃下加热1小时。如方法A、G和H所述，在过滤和洗涤后，裂解衍生的肽基树脂并进行特征鉴定。
通用方法E主链环肽的SPPS-环化和裂解根据通用方法A和B合成含有两个结构单元的肽基树脂。在氩气下，通过与DCM中的四/三苯基膦-钯、乙酸(5％)和N-甲基吗啉(2.5％)在室温下反应1.5小时脱除烯丙基/Alloc保护基团。用氯仿洗涤所述肽树脂，随后用NMP洗涤。在室温下，在NMP中采用PyBOP(3当量)和DIEA(6当量)环化1小时。用NMP洗涤后重复所述环化。通过在0℃及氩气下采用10毫升的TFA(94％)、水(2.5％)、TIS(1％)和乙二硫醇(2.5％)处理0.5小时和在室温下处理1-3小时使主链环肽去保护并从所述树脂裂解出来。通过过滤除去树脂并用另外量的TFA进行洗涤，在氮气流中对合并的溶液进行蒸发从而得到一种油，其在用冷乙醚(40毫升)进行处理时发生固化。离心后除去乙醚并将所述固体在高真空下干燥过夜从而得到粗肽。通用方法F采用BTC环化含有两个N-结构单元的肽根据通用方法A、B和E合成含有两个N-结构单元的肽基树脂。在室温下，在二噁烷中采用BTC(0.33当量)实施所述环化1小时。如通用方法E、G和H中所述实施化学方法和特征鉴定。通用方法G粗肽的HPLC分析将粗肽样品溶于溶剂A(水+0.1％TFA)并注入HPLC仪(柱C18250×4mm，流速1毫升/分钟)中。洗脱溶剂A和B(ACN,0.1％TFA)。在35分钟内采用从90％至10％的A的线性梯度液，对疏水肽进行洗脱。在35分钟内采用从100％至10％的A的线性梯度液对亲水肽进行洗脱。通过在线(online)UV检测器(设定214nm)对肽进行检测。通用方法H肽的质谱分析采用四极(quadrupole)或离子捕集器质谱对粗肽和从HPLC收集的部分进行分析。
通过具体的肽和模拟肽化合物对本发明进行举例说明。这些实施例采用非限制性的方式，并且应当理解的是本发明不受限于实施例的范围，而受限于附于说明书后的权利要求的范围。
需要记在的事实是通过在NMP中的加热可以获得预制Fmoc-AA’氯化物的最好转化率，我们对BTC的初步研究在以下条件下实施Fmoc-AA’s(3当量)和BTC(1.2当量)在NMP中进行反应，随后加入DIEA(12当量)。在室温下经半小时后，将活化的AA’s倒入在65℃下溶胀1小时的肽树脂中。在这些条件下经双偶合法获得所需的肽，但不幸的是立体化学上受到损失。如表1所示的那样，将碱改为空间位阻较弱的2,4,6-三甲吡啶没有显著改进偶合的立体完整性(stereomtegrity)。
结论是如本领域所熟知的那样，在固相肽合成的通用方法中十分有效的溶剂NMP是BTC介导的偶合的不合适试剂。
表1在65℃下采用BTC/NMP的困难偶合的概述
在第1-2项中，采用DIEA作为碱。底物对Fmoc-保护的衍生物的反应时间。第3-10项以MPS方式以5.5mM规模实施，采用三甲吡啶作为碱。c．基于由HPLC分析所得曲线下的面积之和。b．根据用于疏水肽的通用方法G进行分析。c．具有相同的质量但具有不同的保留时间。方案2在NMP中对BTC偶合提出的机理 为了解释说明在NMP中，Fmoc AA’s在有效BTC介导的偶合至结构单元-肽基-树脂的过程中Fmoc AA的外消旋作用，我们提出一种机理(方案2)，其中过量的NMP与BTC反应形成式1，其通过脱去光气和二氧化碳成为Vilsmayer-型中间体2。将光学纯Fmoc AA加入chloroiminium离子2，并脱除氯化物得到偶合至肽树脂上的活性酯3。另一方面，众所周知的是在碱催化下N-烷氧羰基保护的氨基活性酯3转变为易外消旋的噁唑酮4。如表2所示，采用带保护侧链的空间位阻的极性氨基酸的其它实验得到不充分的结果。
表2采用含有极性氨基酸的BTC/NMP的实验概述
a．75℃下1小时后；b．65℃下三个偶合循环后；c．65℃下两个偶合循环后；d．根据用于疏水肽的通用方法G进行分析；这些氨基酸和许多其它极性和芳族Fmoc AA’s偶合至空间位阻更大的结构单元-肽基-树脂的全部失败，以及还有采用Fmoc-Asn(Trt)和Fmoc-His(Trt)不能反应(甚至采用NMP中的Ala-结构单元-肽基-树脂)的事实表明，需要换为对反应呈惰性的溶剂。事实上，50℃下采用THF中的BTC，将Fmoc-Val和Fmoc-Ile双偶合至Nα-(ω-carballyloxypropyl)-Ala(表示为AlaC3)和Nα-(ω-carballyloxypropyl)-Leu(表示为LeuC3)-肽基-树脂仅仅1小时，即获得100％转化率的所需肽并且没有检测到的外消旋。这些结果提示我们进行更广泛的合成尝试，其包括将所有蛋白原(proteinogenic)的Fmoc-AA’s(Gly除外)偶合到许多结构单元-肽基-树脂和N-Me-Ala以及N-Me-Phe-肽基-树脂上，其中肽基部分的大小和序列都有改变。结果列于表3和表4。
表3采用BTC/THF、二噁烷、二甘醇二甲醚或DCP的困难偶合
产物质量数据编号17、18、19、20、22、31、37、44、45、46、57数据对应环肽。
编号42、51、52、56数据对应烯丙基/Alloc保护的肽。
编号22、41、48、51、52数据对应线性肽。
编号43、47数据对应Ac-N三肽。肽序列17A)PheC2-NMeAla-Ala-AlaN3-NH2,17B)GlyCl-Ala-Lys-(D)Ala-Ala-AlaN3-NH2；18)Ala-Ala-Lys-(D)Ala-Ala-AlaC2-NH2；19A)(D)Ala-AlaN2-Ala-Lys-(D)Ala-Ala-AlaC3-NH219B)AlaN2-Ala-Lys-(D)Ala-Ala-AlaC3-NH2；20A)GlyCl-Ala-Lys-(D)Ala-Ala-AlaN2-NH2,20B)PheC2-N-MeAla-Ala-AlaN2-NH2；22)(D)Ala-AlaN2-Ala-Lys-(D)Ala-Ala-AlaC3-NH2；31)TrpC3-Ser-Glu-Tyr-Leu-PheN2-Gln-NH2；37)PheCl-Phe-Phe-(D)Trp-(L)Lys-PheN2-NH238)PheCl-Phe-Phe-(D)Trp-(D)Lys-PheN2-NH239)PheCl-Phe-Leu-(D)Trp-(D)Lys-PhcN2-NH2；41)生物素-Trp-Arg-Lys-(D)Arg-Phe-AlaC3-Leu-Arg-(D)Tyr-AlaN3-NH2；42)PheCl-Ala-Phe-AlaN2-NH2；47)Phe-NMePhe-NMePhe-NH2；48)NMePhe-NMePhe-NMePhe-NH2；51)Thr-AlaC2-Ser-Glu-Asn-His-Leu-Arg-His-Ala-LeuN3-Ser-NH2；52)Thr-AlaC3-Ser-Glu-Asn-His-Leu-Arg-His-Ala-LeuN3-Ser-NH2；56)TrpC3-Ser-Glu-Tyr-LeuN3-Amb-Ala-Arg-NH2,57)Biotin-Trp-Arg-Lys-(D)Arg-Phe-AlaC3-Leu-Arg-(D)Tyr-AlaN3-NH2；HPLC分析法根据用于疏水肽的通用方法G的X分析。
根据用于亲水肽的通用方法G的Y分析。
如表3所示，不管Fmoc-AAs的来源(incoming)、结构单元的结构、肽部分的序列和大小，大多数偶合的转化率是定量的。在下面的描述中，括号中的粗体数字代表与表3一致的实施例的数字。
三种肽(26、36和53)获得低于70％的转化率。应当注意到这些偶合没有进行优化。
与预制酰氯法(其主要问题是侧链保护基团的易变性)相反，采用偶合下面Fmoc-AAs的本发明方法获得基本完全的转化率Arg(Pmc)(23),Asp(叔丁基)(24),Cys(Trt)(25),Lys(Boc)(34,35),Ser(叔丁基)(50),Thr(叔丁基)(51,52),Trp(Boc)(54)和Tyr(叔丁基)(56,57)。由于侧链保护基团容易被酸脱除，我们在BTC介导的Fmoc-Lys(Boc)(34,39)偶合中，通过Keiser测试来监测其稳定性。在所有这些偶合中Keiser测试为阴性并且所需的主链环肽获得优异的收率，在粗产物中没有副产物。由这些结果可以得出以下结论在上述条件下采用BTC的偶合不除去敏感的侧链保护基团(通常用于采用Fmoc化学的固相肽合成)。
我们已经证实在各种溶剂中采用或不采用三甲吡啶作为碱的条件下，大多数Fmoc-AA氯化物在偶合至结构单元-肽基-树脂的过程中不会外消旋化。在对这个反应呈惰性的溶剂中，通过BTC的介导偶合中对外消旋程度的评估是基于以下结果(a)如表1所示，当出现外消旋时，由HPLC发现相同质量的两个峰。在表3所示的所有肽(包括获得较低收率的那些肽(21,23,26,28,33,36,53,58,59))中，只有主峰获得所需的质量；(b)偶合Fmoc-Lys(Boc)和Fmoc-D-Lys(Boc)至PheN2结构单元树脂，肽的进一步装备、烯丙基/Alloc的去保护、环化和从所述树脂脱除从而以定量转化率得到两种非对映体的主链环肽(37,38)。各种独立的粗非对映体的HPLC谱图显示了具有相同质量但相互之间保留时间不同的一个明显的单峰。另外，将两个非对映体37和38共同注入毛细管电泳获得两个单独的峰。在将Fmoc-AAs氯化物偶合至结构单元-肽基-树脂中没有外消旋是由于酰氯对亲核性酰基取代基具有较高的反应活性(与较慢的噁唑酮形成比较)。由于在对这个反应呈惰性的溶剂中，BTC介导的偶合通过原地形成酰氯来进行，因而对于通常这种偶合过程没有外消旋作用不应感到奇怪。
为了找到BTC对改进困难的偶合的限制，我们合成肽44-46，其中将各种Phe结构单元偶合至N-Me-Ala-肽基-树脂上。另外，在肽43中，Fmoc-Phe被偶合至N-Me-Phe-N-Me-Phe-树脂，在肽48中，Fmoc-N-Me-Phe被偶合至N-Me-Phe-N-Me-Phe-树脂。所有这些重复偶合以定量转化率在短时间内进行，所得结论是对于改进SPPS中的困难偶合而言，BTC是可选择的试剂。
在表3所示的大多数肽中，在二肽基结构单元树脂上实施所述偶合。为了测试BTC影响偶合至沿肽链的其它位置上相连的结构单元的能力，在4-6和11位置(分别为肽56、41、22、51和52)上实施偶合。
表4概述通过BTC偶合和具有沿肽链偶合位置的新加结构单元的相关类型合成的肽。在正常条件下实施4-6位偶合时，偶合至11位需要六个环以获得定量转化率。
表4采用BTC法的困难偶合反应的概述
续表4
表4脚注表中数据标明结构单元的位置(由C-末端起)，AA偶合至该位置的转化率大于80％(基于HPLC)并由MS得到证实。
*于500℃下，在惰性溶剂(0.14M)中，采用5当量AA、1.5当量BTC(0.33当量/AA)、14当量三甲吡啶双偶合1小时**由于差向异构化，只有20％转化率nr=没有反应()=偶合循环数#=5-10％***=50％a采用BTSA进行预活化b采用BTSA、4-7个偶合循环和加入AgCN对结构单元-肽基树脂进行预活化采用BTC偶合Fmoc-His(Trt)和FmocAsn(Trt)没有成功。
由于全部外消旋，Fmoc-His(Trt)的偶合只获得20％的转化率并且没有与Fmoc-Asn(Trt)偶合。实施例62双环肽PTR3205的合成在配有多孔玻璃底、连接摇动器的反应器中，使2克RinkAmide(MBHA树脂，NOVA,0.46毫摩尔/克)在NMP中溶胀过夜。采用NMP(16毫升)中的25％哌啶从树脂中脱除Fmoc两次(15分钟)。仔细洗涤后(七次采用NMP(10-15毫升)，每次2分钟)，采用溶于NMP(16ml)的Fmoc-Phe-N3-OH(3当量，2.76毫摩尔，1.46克)完成Phe-N3偶合，并在室温下用PyBroP(2.76毫摩尔，1.28g)和DIEA(6当量，5.52毫摩尔，0.95毫升)活化4分钟，随后转移至反应器，在室温下偶合1小时。肽树脂偶合后用NMP(10-15毫升)洗涤肽树脂七次，每次2分钟。通过定性Kaiser测试监测反应的完成。按上述方法脱除Fmoc并洗涤，随后用四氢呋喃(10-15毫升)洗涤三次，每次2分钟，并在50℃下采用双-(三氯甲基)碳酸酯(1.65当量，1.518毫摩尔，0.45克)和三甲吡啶(14当量，12.88毫摩尔，1.7毫升)在四氢呋喃(30-35毫升，得到0.14M的混合物)中用1小时将Fmoc-Cys(Acm)-OH(5当量，4.6毫摩尔，1.9克)偶合至结构单元-肽基树脂上。重复这个偶合步骤。分别采用Fmoc-Thr(叔丁基)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-(D)Trp(Boc)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Cys(Acm)-OH和Fmoc-PheC3-OH经偶合循环完成Thr,Lys,(D)Trp,Phe,Cys和PheC3的装配，在各个偶合循环中将氨基酸溶于NMP并用PyBroP和DIEA进行活化，偶合后洗涤肽树脂，随后脱除Fmoc，然后用NMP进行充分洗涤(如上面对第一次偶合中所述)。在装配的后期，在下面的条件下对肽基树脂进行烯丙基/alloc去保护用DCM(10-15毫升)洗涤肽基树脂三次，每次2分钟，采用DCM-AcOH-NMM(分别为92.5％,5％,2.5％)洗涤三次，每次2分钟。将3克Pd(P(Ph)3)4溶于上面的混合物(80毫升)并将所得黄色悬浮液转移至反应器中并对含有肽基树脂的混合物进行脱气(通过鼓入氩气到反应器的多孔玻璃底)并随后在黑暗中剧烈摇动2小时。用DCM,CHCl3和NMP洗涤肽基树脂(总量15，每次2分钟)。在室温下采用NMP(20毫升)中的PyBOP(3当量，2.76毫摩尔，1.436克)和DIEA(6当量，5.52毫摩尔，0.95毫升)环化1小时，随后进行第二次环化过夜(在相同的条件下)。用NMP洗涤肽基树脂，随后采用DMF-水(15毫升，4∶1)洗涤3次，每次2分钟。将DMF-水(23毫升，4∶1)中的I2溶液(5当量，4.6毫摩尔，1.16克)加入肽基树脂，将其在室温下摇动40分钟从而提供Cys-Cys环化。过滤肽基树脂并用DMF/水、DMF、NMP、DCM、CHCl3以及还有DMF中的2％抗坏血酸进行充分洗涤。经过最后Fmoc去保护和进行如上的洗涤和用MeOH进行洗涤后，在真空下干燥肽基树脂20分钟后，在0℃及氩气中，采用总量30毫升95％TFA、2.5％TIS和2.5％水的合剂(cocktail)混合物处理30分钟，随后室温处理1.5小时将所述肽从树脂上裂解出来。使溶液通过过滤器过滤到聚丙烯试管中，用5-6毫升所述合剂和4-5毫升TFA洗涤树脂，由N2流蒸发所述溶液从而得到油状残余物，用冷的乙醚进行处理时固化。离心并倾析乙醚层并用额外份的冷乙醚进行处理，随后离心和倾析以及在真空下干燥白色固体过夜从而得到具有下面结构的粗PTR3205(0.388克)。 实施例63三环肽PTR 3227的合成PTR3227是具有下面结构的三环主链环肽。 在这个化合物中，一个桥将结构单元(Gly-C2)连接至Lys残基的侧链上，第二个桥连接两个结构单元(Phe-N2和Phe-C2)，第三个桥为两个Cys残基之间形成的二硫桥。这个类似物的合成方法描述如下在配有多孔玻璃底、连接摇动器的反应器中，使1克RinkAmide(MBHA树脂，(Novabiochem),0.46毫摩尔/克)在NMP中溶胀过夜。采用NMP(16毫升)中的25％哌啶从树脂中脱除Fmoc两次(15分钟)。仔细洗涤后(七次采用NMP(10-15毫升)，每次2分钟)，采用溶于NMP(8毫升)的Fmoc-Lys(Dde)-OH(3当量，1.38毫摩尔，0.735克)完成Lys(Dde)偶合，并在室温下用PyBroP(1.38毫摩尔，0.64g)和DIEA(6当量，2.76毫摩尔，0.47毫升)活化4分钟，随后转移至反应器中，在室温下偶合1小时。肽树脂偶合后用NMP(10-15毫升)洗涤七次，每次2分钟。通过定性Kaiser测试监测反应的完成。按上述方法脱除Fmoc并洗涤，然后实施Fmoc-PheN2-OH(3当量，1.38毫摩尔，0.71克)的偶合。偶合后脱除Fmoc，用NMP洗涤，并用四氢呋喃(10-15毫升)洗涤肽-树脂三次，每次2分钟，并在50℃下采用BTC(1.65当量，0.759毫摩尔，0.225克)和三甲吡啶(14当量，6.44毫摩尔，0.85毫升)在四氢呋喃(16毫升，得到0.14M的混合物)中用1小时将Fmoc-Cys(Acm)-OH(5当量，2.3毫摩尔，0.95克)偶合至BU-肽基树脂上。再次重复这个困难的偶合过程。分别采用Fmoc-Thr(叔丁基)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-(D)Trp(Boc)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Cys(Acm)-OH和Fmoc-PheC2-OH经偶合循环完成Thr,Lys,(D)Trp,Phe,Cys和PheC2的装配(通过定性Kaiser测试监测)，在各个偶合循环中，将氨基酸溶于NMP中并用PyBroP和DIEA进行活化，偶合后洗涤肽-树脂，随后脱除Fmoc，然后用NMP进行大量洗涤(如第一次偶合时那样)。装配PheC2后，在下面的条件下对肽基树脂进行烯丙基/alloc去保护用DCM(10-15毫升)洗涤肽基树脂三次，每次2分钟，采用DCM-AcOH-NMM混合物(分别为92.5％,5％,2.5％)洗涤三次，每次2分钟。将1.5克Pd(P(Ph)3)4溶于上面的混合物(40毫升)并将所得黄色悬浮液转移至反应器中，对含有肽基树脂的混合物进行脱气(通过鼓入到氩气反应器的多孔玻璃底)并随后在黑暗中剧烈摇动2小时。用DCM,CHCl3和NMP(总量15，每次2分钟)洗涤肽基树脂。在室温下采用NMP(10毫升)中的PyBOP(3当量，1.38毫摩尔，0.72克)和DIEA(6当量，2.76毫摩尔，0.475毫升)环化1小时，随后第二次环化过夜(在相同的条件下)。随后如上所述实施Fmoc去保护，然后NMP洗涤，接着在50℃下采用5当量BU(2.3毫摩尔，0.94克)、BTC(1.65当量，0.759毫摩尔，0.225克)和三甲吡啶(14当量，6.44毫摩尔，0.85毫升)在四氢呋喃(16毫升，获得0.14M混合物)中，将Fmoc-GlyC2-OH偶合至环肽1小时。再次重复这个困难的偶合方法。再次采用DMF/DCM(1∶1,8毫升)中的偶合剂Boc-(D)-Phe-OH(4当量，1.84毫摩尔，0.488克)和PyBrop(1.84毫摩尔，O.857克)以及碱DIEA(8当量，3.68毫摩尔，0.63克)，将(D)-Phe偶合至十肽树脂1.5小时。在室温下的相同条件下实施第二次偶合循环2小时。洗涤后，在室温下采用DMF(25毫升×3min×3)中的2％肼从Lys的Nε侧链(距C末端的位置1)选择性地脱除Dde。用DMF和NMP洗涤后，如上所述，采用0.75克Pd(P(Pd)3)4对肽基树脂进行烯丙基去保护。用CHCl3、DCM和NMP洗涤肽基树脂，随后如上所述采用PyBOP进行环化(Kaiser测试呈阴性)。随后采用DMF-水(12.5毫升，4∶1)洗涤3次，每次2分钟。将DMF-水(12.5毫升，4∶1)中的I2溶液(5当量，2.3毫摩尔，0.583克)加入肽基树脂中，将其在室温下摇动40分钟从而提供Cys-Cys环化。过滤肽基树脂并用DMF/水、DMF、NMP、DCM、CHCl3以及还有DMF中的2％抗坏血酸和随后的DMF进行充分洗涤。DCM和MeOH洗涤后，在真空下干燥肽基树脂20分钟，在0℃的氩气中，采用总量15毫升的95％TFA、2.5％TIS和2.5％水的合剂混合物处理30分钟，随后室温下处理1.5小时将所述肽从树脂上裂解出来。将通过萃取过滤器溶液过滤到聚丙烯试管，用5-6毫升所述合剂和4-5毫升TFA洗涤树脂，由N2流蒸发所述溶液从而得到油状残余物，用冷的乙醚进行处理时固化。离心并倾析乙醚层并用额外的冷乙醚进行处理，随后离心和倾析以及在真空下干燥固体过夜从而得到粗PTR 3227(72毫克，10％)。图5为该粗肽的HPLC色谱图。实施例64偶合半乳糖衍生物至主链环肽以获得PTR3229主链环肽经Fmoc去保护后，用NMP和THF洗涤。在室温下采用THF(15毫升)中的0.33当量的BTC(0.379毫摩尔，0.112克，作为偶合剂)和14当量的三甲吡啶(3.22毫摩尔，0.425毫升，作为碱)，实施1,2∶3,4-二-O-亚异丙基D-吡喃半乳糖(5当量，1.15毫摩尔，0.3克)的偶合循环1小时。DCM和MeOH洗涤后，在室温下采用总体积15毫升的TFA(95％)、TIS(2.5％)和水(2.5％)的合剂混合物从所述树脂裂解出肽1.5小时。对粗PTR-3229(0.176克)进行处理后，得到以下序列半乳糖-Dab-Phe-Trp-(D)Trp-Lys-Thr-Phe-Gly(C3)-NH2。这种肽似物包括一个连接GlyC3结构单元和Dab残基的桥。图6为粗肽的质谱分析。实施例65采用BTC形成脲键A．通过将Ile(由BTC衍生而成的异氰酸酯衍生物)偶合至Lys-肽基树脂上，形成具有以下结构的肽类似物PTR3237。 图7为粗肽的质谱分析。B．以下面的方法采用二胺形成序列中的脲键往二氯甲烷(0.15M)中的5当量的单Fmoc-二胺盐酸盐中加入1当量DIEA(用来中和盐酸)。1分钟后加入1.65当量的BTC，将所述悬浮液搅拌2分钟，随后加入14当量的DIEA。1分钟后，将所得溶液加入肽基树脂中，并在室温下搅拌所述混合物1小时，随后用二氯甲烷和NMP进行洗涤。所得主链环肽类似物PTR3241具有以下结构式
图8为所述粗肽的HPLC谱图和质谱分析。实施例66采用BTC的多级平行合成采用BTC作为偶合剂在MPS格式(format)中合成约500个分离肽。24肽的合成实施例概述于表5。
表5注释困难的偶合方法在自动肽合成仪(来自Advanced ChemTech的ACT 396 with Labtech4)外预活化AA。
混合150μl二噁烷中的5当量AA和150μl二氯丙烷中的1.65当量的BTC,1分钟后加入二氯丙烷中的14当量三甲吡啶。
手工操作将预活化的氨基酸转移至板。
在60℃下反应3次1小时。
图9为所述粗MPS肽(表5中的20号)的HPLC色谱图和质谱分析实例。实施例67采用BTC合成环孢菌素类似物将BTC试剂用于具有以下序列的环孢菌素类似物合成中的困难偶合Ala-NMeLeu-NMeLeu-NMeVal-NMeLeu-Abu-Sar-NMeLeu-Val-NMeLeu-Ala-NH2。这种肽模拟物物为描述于J.Org.Chem.63∶5734,1998(Raman等)中的环孢菌素类似物的线性衍生物。图10为所述粗肽的HPLC色谱图和质谱分析。
权利要求
1．将氨基酸残基偶合至肽链的一种方法，其包括(ⅰ)提供具有游离羧基和封闭氨基的氨基酸残基，任选具有其它封闭官能侧链；(ⅱ)在对这个反应呈惰性的溶剂中，使封闭氨基酸与双(三氯甲基)碳酸酯反应以获得氨基酸酰氯；(ⅲ)用有机碱中和游离酸；(ⅳ)将含有氨基酸酰氯的所得悬浮液加入选自以下的化合物中含有封闭羧基端和游离氨基端的肽，及具有至少一个游离氨基端的肽基树脂；(ⅴ)提供反应条件，使氨基酸酰氯偶合至肽上，得到延伸了一个氨基酸残基的肽。
2．权利要求1的方法，其中所述肽链包含一个在N末端位置上的空间位阻残基。
3．权利要求2的方法，该方法进一步包括在将氨基酸酰氯偶合至肽的过程中加热所述反应混合物。
4．权利要求1的方法，该方法进一步包括将催化剂加入氨基酸酰氯和肽的反应混合物。
5．权利要求2的方法，其中肽链的N末端位置上的空间位阻残基包含一个空间位阻的仲胺。
6．权利要求2的方法，其中肽链的N末端位置上的空间位阻残基包含N-α(ω-官能化)烷基氨基酸残基。
7．权利要求1的方法，其中惰性溶剂选自二噁烷、四氢呋喃、二甘醇二甲醚和1,3-二氯丙烷。
8．权利要求1的方法，其中所述肽偶合进一步包括多级平行肽合成(multiple parallel peptide synthesis)。
9．权利要求1的方法，其中偶合剂以至少约三分之一摩尔当量的氨基酸残基的化学计量比提供。
10．权利要求1的方法，其中所述碱选自三甲吡啶、二异丙基乙胺、吡啶、二甲基吡啶和2-甲基喹啉。
11．权利要求1的方法，其中氨基酸的氨基通过选自以下的保护基团封端芴基甲氧羰基和叔丁氧羰基。
12．偶合氨基酸残基至固体载体的方法，其包括(ⅰ)提供具有游离羧基和封闭氨基的氨基酸残基，任选具有其它封闭官能侧链；(ⅱ)在对这个反应呈惰性的溶剂中，使封闭氨基酸与双(三氯甲基)碳酸酯反应以获得氨基酸酰氯；(ⅲ)通过加入有机碱中和游离酸；(ⅳ)将含有氨基酸酰氯的所得悬浮液加入选自以下的化合物中具有至少一个游离氨基端的树脂和具有一个能够结合氯化物的官能团的固体载体；(ⅴ)提供反应条件，使氨基酸酰氯偶合至所述固体载体上。
13．化合物双-(三氯甲基)碳酸酯在肽合成中原地合成氨基酸酰氯的用途。
14．光气化合物在肽合成中原地合成氨基酸酰氯的用途。
15．二光气化合物在肽合成中原地合成氨基酸酰氯的用途。
16．双(三氯甲基)碳酸酯化合物在肽和碳水化合物之间形成酰胺键的用途。
17．根据权利要求1的方法合成的肽。
18．根据权利要求17的肽选自PheC2-NMeAla-Ala-AlaN3-NH2；GlyCl-Ala-Lys-(D)Ala-Ala-AlaN3-NH2；Ala-Ala-Lys-(D)Ala-Ala-AlaC2-NH2；(D)Ala-AlaN2-Ala-Lys-(D)Ala-Ala-AlaC3-NH2；AlaN2-Ala-Lys-(D)Ala-Ala-AlaC3-NH2；GlyCl-Ala-Lys-(D)Ala-Ala-AlaN2-NH2；PheC2-N-MeAla-Ala-AlaN2-NH2；(D)Ala-AlaN2-Ala-Lys-(D)Ala-Ala-AlaC3-NH2；TrpC3-Ser-Glu-Tyr-Leu-PheN2-Gln-NH2；PheCl-Phe-Phe-(D)Trp-Lys-PheN2-NH2；PheCl-Phe-Phe-(D)Trp-(D)Lys-PheN2-NH2；PheCl-Phe-Leu-(D)Trp-(D)Lys-PheN2-NH2；生物素-Trp-Arg-Lys-(D)Arg-Phe-AlaC3-Leu-Arg-(D)Tyr-AlaN3-NH2；PheCl-Ala-Phe-AlaN2-NH2；Thr-AlaC2-Ser-Glu-Asn-His-Leu-Arg-His-Ala-LeuN3-Ser-NH2；Thr-AlaC3-Ser-Glu-Asn-His-Leu-Arg-His-Ala-LeuN3-Ser-NH2；TrpC3-Ser-Glu-Tyr-LeuN3-Amb-Ala-Arg-NH2。
全文摘要
公开了在肽合成中通过从保护的氨基酸原地生成氨基酸酰氯，采用三光气作为有效和高效的偶合剂的方法。本方法尤其适用于偶合空间位阻的氨基酸残基或用于其它困难的偶合。另外，该试剂可以通过肽上的游离胺和羧酸之间形成酰胺键用于肽的衍生化作用，或用于将氨基酸偶合至固体载体上。
文档编号C07K5/11GK1317011SQ99810807
公开日2001年10月10日 申请日期1999年7月11日 优先权日1998年7月12日
发明者E·法尔布, T·叶切兹克尔, Y·萨利特拉 申请人:佩普特有限公司