专利名称：结合膜联蛋白的苯并二氮杂类和苯并硫杂吖庚因衍生物和hbsag肽,其组合物和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及发现衍生有肽链的1,4-苯并二氮杂类和1,4-苯并硫杂吖庚因类抑制HbsAg对膜联蛋白V的结合。因此本发明涉及这样的分子及其治疗乙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒感染或者其中涉及蛋白质与膜联蛋白家族成员相互作用的任何其它疾病的用途。
背景技术：
乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝DNA病毒，其特征在于显著的趋肝性和物种特异性。丁型肝炎病毒(HDV)代表HBV的天然存在的亚病毒随伴体(Rizetto等，1986)。HBV引起主要的医学问题，例如慢性肝病和肝细胞癌症(Schroder和Zentgraf,1990)。与单独的HBV感染相比HDV超感染通常更加严重。估计全球有300百万人携带该病毒，同时在美国就有7万携带者共同感染HDV。
在HBV基因组中，更具体地说在S基因中(也参见下面自然段)，存在天然序列变异。以该序列差异百分率为基础设计了HBV的A至F基因型(有关综述参见Magnius和Norder,1995)。
被膜HBV由三种相关的糖蛋白组成，将它们称作乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，其是S基因的产物1)“小”跨膜蛋白，也称之为主要蛋白或小S-蛋白，由226个氨基酸(aa)组成，2)“中”蛋白质，其包括小S-蛋白和在N-末端的相应于S基因的前-S2区的55个另外的氨基酸，和3)“大”蛋白质由相应于下面区的389或400个氨基酸组成S+前-S2+前-S1(108-119N-末端aa)(Heerman等，1984；Robinson等，1987)。HDV的被膜也完全由HBV衍生并且主要由小HBsAg,5-10％中HBsAg组成，没有大HBsAg或者大HBsAg少于1％(Bonino等，1986)。
流感病毒引起复发性流行病，甚至是全球性传染病。这些传染病爆发期间的缺勤导致巨大经济损失并且伴随住院率增加，甚至导致源于呼吸病的死亡(有关综述参见Cox和Fukuda,1998)。
巨细胞病毒(cytomegalovirus)是疱疹病毒家族的一个成员并且是无免疫应答个体例如艾滋病患者的重要的病原体。在疱疹病毒的包膜内存在称之为糖蛋白B的蛋白质。证明该蛋白质对于感染是必需的，所述感染包括进入宿主细胞和细胞至细胞的传播(Cai等，1988)。
膜联蛋白Ⅴ(也称之为内联蛋白Ⅱ，胎盘抗凝蛋白，PP4或脂皮质蛋白Ⅴ)是结构上相关的Ca2+-依赖性磷脂-结合蛋白家族的一个成员，已知为分子量在32-67kDa之间的膜联蛋白(Klee,1988；Zaks和Creutz,1990)。在各种组织中发现膜联蛋白Ⅴ，例如肝，脾，肺，肠和胎盘(Walker等，1990)。曾经描述过该蛋白质以Ca2+-依赖性方式结合胎盘膜(Haigler等，1987)并且体外抑制血液凝固(Grundmann等，1988)和磷脂酶A2活性(Pepinsky等，1988)。其它研究人员证明膜联蛋白Ⅴ行为象整合膜蛋白并且形成钙-选择性阳离子通道(Rojas等，1990；Bianchi等，1992)。
最近证明1,4-苯并二氮杂类(Hofmann等，1998)和1,4-苯并硫杂吖庚因类(Kaneko等，1997a,b)能结合膜联蛋白Ⅴ。膜联蛋白Ⅱ与膜联蛋白Ⅴ相关并且也结合1,4-苯并二氮杂类(Hofmann等，1998)。膜联蛋白也起着大量的与非病毒蛋白质结合的作用，所述非病毒蛋白质例如胶原蛋白，腱生蛋白，肌动蛋白，突触蛋白，钙影蛋白，胰岛素受体，纤溶酶原等等(有关综述参见Sheldon和Chen,1996)。
我们最近证明人肝质膜上存在的膜联蛋白Ⅴ，以Ca2+-依赖性方式特异性结合“小”HBsAg(Hertogs等，1993；WO94/01554)。用天然人肝膜联蛋白Ⅴ或重组膜联蛋白Ⅴ免疫的兔，或者用兔抗膜联蛋白VIgG的F(ab’)2-片段免疫的鸡自发性产生特异性识别HBsAg的抗-特应抗体(Ab2)的发现进一步支持HBsAg和膜联蛋白Ⅴ之间的受体-配体关系(Hertogs等，1994)。我们还证明HDV颗粒通过包含HBV包膜的HBsAg结合膜联蛋白Ⅴ(de Bruin等，1994)。WO97/07268中描述了膜联蛋白Ⅴ结合中涉及的HBsAg上的位点位置。该区域中这些位点由“小”HBsAg的100-160个氨基酸组成，估计其位于该病毒的外表面(有关综述参见Berting等，1995)。
也证明了流感病毒与膜联蛋白Ⅴ的结合(Huang等，1996)和巨细胞病毒与膜联蛋白Ⅱ的结合(Pietropaolo和Compton,1997)。
从上述文献清楚得知HBV和/或HDV感染以及其它病毒感染例如流感和巨细胞病毒感染依然是一个主要的健康问题。因此开发出干扰HBV和/或HDV或这些其它病毒的生活周期的新的药物依然是一个主要的需求。以HBV和/或HDV或这些其它病毒与膜联蛋白的结合被抑制这样一种方式结合膜联蛋白的化合物可能是干扰这些病毒的生活周期的好的候选者，因此可能是用作治疗病毒感染的药物的好的候选者。因此，迫切需要提供与膜联蛋白特异性作用，同时抑制HBV和/或HDV或这些其它病毒与膜联蛋白的相互作用的分子。
本发明的目的本发明的目的是抑制膜联蛋白与膜联蛋白结合蛋白的相互作用。
本发明更具体的目的是抑制膜联蛋白与能结合膜联蛋白的病毒蛋白的相互作用。
本发明另一个更具体的目的是抑制膜联蛋白Ⅴ与HBV的表面抗原的相互作用。
本发明另一个更具体的目的是抑制膜联蛋白Ⅱ与巨细胞病毒的糖蛋白B的相互作用。
本发明另一个更具体的目的是抑制膜联蛋白Ⅴ与衍生自结合膜联蛋白Ⅴ的任何流感病毒株的蛋白质的相互作用。
本发明另一个目的是预防或治疗其中涉及膜联蛋白家族成员与膜联蛋白结合蛋白之间的相互作用的任何疾病。
本发明更具体的目的是预防或治疗其中涉及膜联蛋白家族成员与病毒蛋白之间的相互作用的任何病毒疾病。
本发明另一个更具体的目的是预防或治疗HBV和/或HDV感染。
本发明另一个更具体的目的是预防或治疗巨细胞病毒感染。
本发明另一个更具体的目的是预防或治疗流感病毒感染。
认为通过下面的实施方案实现本发明的所有这些目的。
本发明的详细描述本文描述的本发明引用先前公开的工作和未结案专利申请。举例来说，这样的工作由科技文献，专利或未结案专利申请组成。上文或下文中引用的所有这些公开物和申请在这里引作参考。
本发明涉及衍生有一个或多个肽的1,4-苯并二氮杂类和1,4-苯并硫杂吖庚因类。
具体地说，本发明涉及衍生有一个或多个肽使得该衍生物抑制膜联蛋白和一些膜联蛋白结合蛋白之间的相互作用的1,4-苯并二氮杂类和1,4-苯并硫杂吖庚因类。
结合HBV病毒进入中涉及的分子--膜联蛋白Ⅴ的1,4-苯并二氮杂类和1,4-苯并硫杂吖庚因类不抑制HBV对膜联蛋白Ⅴ的结合。本申请以这些化合物衍生肽配体时膜联蛋白Ⅴ和HBV的HBsAg之间的相互作用可以被抑制的惊人发现为基础。这些新的1,4-苯并二氮杂类和1,4-苯并硫杂吖庚因类的衍生物因此是干扰HBV和/或HDV和结合一般来说膜联蛋白或者更具体地说膜联蛋白Ⅴ的其它病毒的生活周期的药物发现中的新的前导。这些分子一般可以干扰膜联蛋白与另一种蛋白质的任何相互作用。通过将1,4-苯并二氮杂类或1,4-苯并硫杂吖庚因类选择性衍生化，可以以特定途径导向这些相互作用的任一种。
术语“膜联蛋白”(也称之为内联蛋白Ⅱ、胎盘抗凝蛋白、PP4或脂皮质蛋白Ⅴ)指结构上相关的Ca2+-依赖性磷脂-结合蛋白家族的任何成员，已知为分子量在32-67kDa之间的膜联蛋白(Klee,1988；Zaks和Creutz,1990)。更具体地说，所述膜联蛋白可以是表现出结合HBV的HBsAg和结合流感病毒的膜联蛋白Ⅴ，或者已知结合巨细胞病毒的糖蛋白B的膜联蛋白Ⅱ。但是本发明中指定的膜联蛋白不局限于这些膜联蛋白，而且也可以是与膜联蛋白结合蛋白结合的所有其它膜联蛋白。
所述1,4-苯并二氮杂或1,4-苯并硫杂吖庚因可以带有本领域公知的任何修饰，例如W094/11360和W092/12148中提到的那些。优选地，1,4-苯并二氮杂或1,4-苯并硫杂吖庚因具有式Ⅰ(
图1)所示结构，其中*在1位-苯并硫杂吖庚因类具有一个硫原子(X代表S)；X也可以是SOn，其中n=0,1,2；-苯并二氮杂类具有一个氮原子(X代表N)，其在1位另外修饰有羧甲基(-CH2COOH)之后，允许通过肽的C-末端连接的或者通过肽的N-末端连接的另外修饰有一个权利要求书中定义为“含有一个膜联蛋白结合蛋白的膜联蛋白结合表位的肽”的肽或者其部分。在N不修饰有一个肽的情况下，修饰可以是H，烷基，苯基，-COZ，其中Z代表H，烷基，苯基或取代的苯基；*1,2,3,4,5位可以以邻接位置形成双键；如果是这种情况，则侧链R2,R4,R5或R7不存在；*2和/或2’位上的R1和/或R2可以代表H，胺，烷基或者2位可以被氧化(=O)。在R1和/或R2是胺的情况下，其可以进一步地或者直接通过肽的C-末端连接或者通过象戊二醛或琥珀酐这样的连接基团连接于肽的N-末端而被一个权利要求书中定义为“含有一个膜联蛋白结合蛋白的膜联蛋白结合表位的肽”的肽或者其部分取代；*3和/或3’位上的R3和/或R4可以代表H，胺或烷基。在R3和/或R4是胺的情况下，其可以进一步地或者直接通过肽的C-末端连接或者通过象戊二醛或琥珀酐这样的连接基团连接于肽的N-末端而被一个权利要求书中定义为“含有一个膜联蛋白结合蛋白的膜联蛋白结合表位的肽”的肽或者其部分取代；*4位上的R5可以代表4位另外修饰有羧甲基(-CH2COOH)后或者直接通过肽的C-末端连接的或者通过肽的N-末端连接的权利要求书中定义为“含有一个膜联蛋白结合蛋白的膜联蛋白结合表位的肽”的肽或者其部分的支链。在R5不是权利要求书中定义的肽的情况下，R5可以代表H，烷基，-CO-R12或者3-(1-(4-苄基)哌啶基)丙酰基)；*R6和/或R7代表H或烷基或苯基，可能进一步取代有烷基，氰基，卤素，硝基，烷基烷氧基，烷酰基，羧基，烷酰基烷氧基，氨基甲酰基；*R8,R9,R10和/或R11代表H，烷基，氰基，卤素，硝基，烷基烷氧基，烷酰基，羧基，烷酰基烷氧基，氨基甲酰基；*R12代表H或烷基或可能进一步取代有烷基，氰基，卤素，硝基，烷基烷氧基，烷酰基，羧基，烷酰基烷氧基，氨基甲酰基的苯基。
用于制备本发明的分子的1,4-苯并二氮杂或1,4-苯并硫杂吖庚因还可以是该结构式的任何药学可接受盐。用于制备本发明的分子的1,4-苯并二氮杂可以是所有本领域公知的衍生物，例如但不限于阿普唑仑，溴西泮，chloordiazepoxide，氯巴占，氯硝西泮，氯氮卓，地西泮，氟地西泮，氟硝西泮，氟西泮，劳拉西泮，硝西泮，奥沙西泮，替马西泮，三唑仑，BDA250,BDA452,BDA753(也参见图6和Hoffman等，1998)。但是，本发明的化合物不是BDA753，一种根据式Ⅱ的化合物(FR2479818；图2)或者一种根据式Ⅲ的化合物(Nachman等，1998；图3)。1,4-苯并硫杂吖庚因也可以是本领域任何公知的衍生物，例如但不限于K-201(Kaneko等，1997a)。
根据本发明，这些1,4-苯并二氮杂或1,4-苯并硫杂吖庚因在2,2’,3和/或3’位(在式Ⅰ中)修饰有胺后衍生有一种多肽，其可以在2,2’,3和/或3’位(在式Ⅰ中)连接(两个肽可以在相同的位置连接)。该肽可以或者直接通过该肽的C-末端连接胺，或者该肽可以通过使用一个连接基团通过该肽的N-末端连接。
所述连接基团可以是使两个胺残基连接的任何连接基团。优选所述连接基团是二醛，例如戊二醛或者酸酐，例如琥珀酐。其它可能的连接基团也可以由Pierce(Rockford,IL,USA)提供。图9和图10给出了通过利用一个连接基团使肽与1,4-苯并二氮杂连接的基础反应的实施例。
所述多肽也可以连接到1和/或4位(在式Ⅰ中)。在这种情况下，所述肽或者通过肽的C-末端连接或者在1和/或4位分别另外修饰有羧甲基(-CH2COOH)之后该肽通过N-末端连接。
在一个优选的实施方案中，肽与在5位处被苯基取代的1,4-苯并二氮杂的1和/或3位连接。一个肽，R，可以通过其C-末端与所述的3位修饰有胺之后的1,4-苯并二氮杂的3位连接，或者，一个肽，R’，可以通过其N-末端与所述1位修饰有羧甲基之后的1,4-苯并二氮杂的1位连接，或者，两个肽，R和R’，分别与所述的1,4-苯并二氮杂的3和1位连接。因此，本发明涉及所述衍生有一个或两个肽，R和/或R’，的1,4-苯并二氮杂，R,R’和/或R+R’代表包含膜联蛋白结合蛋白的膜联蛋白结合表位的肽或者其部分。所述1,4-苯并二氮杂然后具有式Ⅳ所示的结构(图4)，其中*R,R’和/或R+R’构成包含膜联蛋白结合蛋白的膜联蛋白结合表位的肽或者其部分。在只有R是一个肽的情况下，1位是甲基化的或羧甲基化的。在只有R’是一个肽的情况下，3位含有胺；*X代表可以被-COCH3修饰的肽的N-末端；*Y代表可以被-NH2或-赖氨酸-生物素修饰的肽的C-末端。
用于通过Fmoc为基础的肽合成的所述1,4-苯并二氮杂衍生物的合成的结构单元可以从Neosystem(Strasbourg，法国)获得。
在本发明另一个实施方案中，通过使用如上所述的连接基团，肽，R，通过其N-末端与所述1,4-苯并二氮杂(在5位被苯基取代)的3位连接。在这种情况下，1位的氮原子(式Ⅰ)被甲基化或羧甲基化。因此本发明涉及衍生有包含膜联蛋白结合蛋白的膜联蛋白结合表位的肽，R，或者其部分的根据式Ⅴ的化合物。
与1,4-苯并二氮杂或1,4-苯并硫杂吖庚因连接的多肽可以是所有的包括从已知结合膜联蛋白的蛋白质衍生的膜联蛋白结合表位的多肽。
术语“膜联蛋白结合蛋白”指能与膜联蛋白形成复合物的所有蛋白质。
术语“膜联蛋白结合表位”指与膜联蛋白特异性相互作用形成膜联蛋白结合蛋白-膜联蛋白复合物的膜联蛋白结合蛋白的区。“膜联蛋白结合表位”包括至少2，优选3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,20,25,30,35或更多个氨基酸的膜联蛋白结合蛋白。通过本领域公知的任何技术可以确定表位或者通过本领域公知的各种计算机属性模型预示。
术语“多肽”或“肽”可以互换使用，指与其从中衍生的蛋白质的部分相同或相近的氨基酸的聚合物。所述多肽可以由多种氨基酸组成，优选地，多肽由少于13个氨基酸，优选12,11,10,9,8,7,6,5,4,3或2个氨基酸组成，这样一个膜联蛋白结合表位包含在该多肽中。在本发明化合物具有根据式Ⅳ的结构的情况下，肽R或R’只由1个氨基酸组成和/或膜联蛋白结合表位包含在代表R+R’的多肽中也是可能的。应该注意从膜联蛋白结合蛋白衍生的并且形成与膜联蛋白的结合区的多肽可能是构象结合区的一部分，因此不能由膜联蛋白结合蛋白的接近的氨基酸序列组成。
通过任何本领域公知的方法，例如，如Houbenweyl(1974)和Atherton和Shepard(1989)描述的经典化学合成，或者利用如Maniatis等(1982)描述的重组DNA技术，可以制备多肽。术语“多肽”不指也不排除多肽的翻译后修饰，例如糖基化，酰基化，磷酸化，用脂肪酸修饰等等。该定义中包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括非天然氨基酸或D-异构形式)的多肽，具有被取代的键的多肽，该多肽的突变版本或天然序列变体(例如，如上所述相应于HBV的A至F基因型的HBV的HBsAg蛋白质的肽变体)，半胱氨酸残基中间有二硫键的多肽，反向-反转(reverso-inverso)多肽(例如Guichard等所述的，1994)，以及本领域公知的其他修饰。
在一个具体实施方案中，从已知结合膜联蛋白的病毒蛋白衍生与1,4-苯并二氮杂或1,4-苯并硫杂吖庚因连接的多肽。术语“从病毒蛋白衍生的多肽”指氨基酸的聚合物，其与从中衍生的病毒蛋白的部分相同或相近并且包含该病毒蛋白的膜联蛋白结合表位。
在另一个具体的实施方案中，从已知抗原(Heerman等，1984；Robinson等，1987)HBV的HBsAg蛋白质衍生与1,4-苯并二氮杂或1,4-苯并硫杂吖庚因连接的多肽。这里所使用的术语“从HBV的HBsAg蛋白质衍生的多肽”指一种具有氨基酸序列的多肽，其与“小”HBsAg的氨基酸序列的部分相同或相近并且包含HBsAg的膜联蛋白结合表位。应该清楚“从HBV的HBsAg蛋白质衍生的多肽”可以从HBV的任何基因型衍生(基因型A至F,Magnius和Norder1995)。
在本发明另一个具体的实施方案中，从巨细胞病毒的糖蛋白B衍生与1,4-苯并二氮杂或1,4-苯并硫杂吖庚因连接的多肽。术语“从糖蛋白B衍生的多肽”指一种氨基酸的聚合物，其与巨细胞病毒的糖蛋白B的部分相同或相近并且包含糖蛋白B的膜联蛋白结合表位。
在本发明另一个具体的实施方案中，从来自任何流感病毒株的蛋白质衍生与1,4-苯并二氮杂或1,4-苯并硫杂吖庚因连接的多肽，条件是该流感蛋白质结合膜联蛋白Ⅴ。术语“从来自流感病毒株的蛋白质衍生的多肽”指一种氨基酸的聚合物，其与来自流感病毒株的蛋白质的部分相同或相近并且包含流感蛋白的膜联蛋白结合表位。
此外，本发明目的在于提供具有肽衍生化作用的1,4-苯并二氮杂或1,4-苯并硫杂吖庚因，所述肽衍生化包括如上定义的或从HBV和/或HDV、巨细胞病毒或流感病毒的所有突变株产生的肽的任何组合。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了衍生有一个肽的1,4-苯并二氮杂或1,4-苯并硫杂吖庚因分子，其中所述肽包括包含下面HBV表面抗原的区域之一的膜联蛋白结合表位的少于13个氨基酸
KTCTTPAQGN(SEQ ID NO1)FAKYLWEWASVR(SEQ ID NO2)曾经描述过这在HBsAg与膜联蛋白Ⅴ的相互作用中涉及过(W097/07268和本发明)。
更具体地说，本发明的与1,4-苯并二氮杂或1,4-苯并硫杂吖庚因衍生物连接的多肽涉及包括从HBV的HBsAg的122-131位氨基酸序列衍生的2-10个氨基酸的多肽，如SEQ ID NO1所示。更具体地说，涉及包括或者由下面氨基酸(aa)序列组成的肽aa122-123,aa123-124,aa124-125,aa125-126,aa126-127,aa127-128,aa128-129,aa129-130,aa130-131,aa122-124,aa123-125,aa124-126,aa125-127,aa126-128,aa127-129,aa128-130,aa129-131,aa122-125,aa123-126,aa124-127,aa125-128,aa126-129,aa127-130,aa128-131,aa122-126,aa123-127,aa124-128,aa125-129,aa126-130,aa127-131,aa122-127,aa123-128,aa124-129,aa125-130,aa126-131,aa122-128,aa123-129,aa124-130,aa125-131,aa122-129,aa123-130,aa124-131,aa122-130,aa123-131,aa122-131.类似地，本发明的与1,4-苯并二氮杂或1,4-苯并硫杂吖庚因衍生物连接的多肽特别涉及包括从HBV的HBsAg的158-169位氨基酸序列衍生的2-12个氨基酸的多肽，如上SEQ ID NO2所示。更具体地说，涉及包括或者由下面氨基酸(aa)序列组成的肽aa158-159,aa159-160,aa160-161,aa161-162,aa162-163,aa163-164,aa164-165,aa165-166,aa166-167,aa167-168,aa168-169,aa158-160,aa159-161,aa160-162,aa161-163,aa162-164,aa163-165,aa164-166,aa165-167,aa166-168,aa167-169,aa158-161,aa159-162,aa160-163,aa161-164,aa162-165,aa163-166,aa164-167,aa165-168,aa166-169,aa158-162,aa159-163,aa160-164,aa161-165,aa162-166,aa163-167,aa164-168,aa165-169,aa158-163,aa159-164,aa160-165,aa161-166,aa162-167,aa163-168,aa164-169,aa158-164,aa159-165,aa160-166,aa161-167,aa162-168,aa163-169,aa158-165,aa159-166,aa160-167,aa161-168,aa162-169,aa158-166,aa159-167,aa160-168,aa161-169,aa158-167,aa159-168,aa160-169,aa158-168,aa159-169,aa158-169.更具体地说，本发明涉及衍生有下面肽或者其部分之一的1,4-苯并二氮杂(FAKYLWEWASVR)2-KKGK(bio)GA(SEQ ID NO4)FAKYLW-K(bio)(SEQ ID NO5)FAKYLWEW-K(bio)(SEQ ID NO6)FAKYLWEWAS-K(bio)(SEQ ID NO7)FAKYLWEWASVR-K(bio)(SEQ ID NO8)FAKYLW(SEQ ID NO9)FAKYLWEW(SEQ ID NO10)FAKYLWEWAS(SEQ ID NO11)FAKYLWEWASVR(SEQ ID NO2)IGP1362或者其部分与BDA250或BDA452或者其任何衍生物连接得到具有在阻断膜联蛋白Ⅴ与HBsAg的相互作用中的提高的特异性的化合物。应该注意并不是所有的序列得到相同的结果。例如，也从HBsAg(aa115-125)衍生的IGP1363肽代表的序列就不抑制膜联蛋白Ⅴ与HBsAg的结合。
在本发明另一个具体的实施方案中，1,4-苯并二氮杂或1,4-苯并硫杂吖庚因衍生有由下面氨基酸序列组成的多肽或者其部分
FARFLWEWASVR-K(bio)(SEQ ID NO12)FGKFLWEWASAR-K(bio)(SEQ ID NO13)LGKYLWEWASAR-K(bio)(SEQ ID NO14)FAKFLWEWASVR-K(bio)(SEQ ID NO15)KYGW-K(bio)(SEQ ID NO16)KFGW-K(bio)(SEQ ID NO17)RFGW-K(bio)(SEQ ID NO18)AYLW-K(bio)(SEQ ID NO19)AFLW-K(bio)(SEQ ID NO20)KYLW-K(bio)(SEQ ID NO21)RFLW-K(bio)(SEQ ID NO22)KFLW-K(bio)(SEQ ID NO23)FARFLWEWASVR(SEQ ID NO24)FGKFLWEWASAR(SEQ ID NO25)LGKYLWEWASAR(SEQ ID NO26)FAKFLWEWASVR(SEQ ID NO27)KYGW(SEQ ID NO28)KFGW(SEQ ID NO29)RFGW(SEQ ID NO30)AYLW(SEQ ID NO31)AFLW(SEQ ID NO32)KYLW(SEQ ID NO33)RFLW(SEQ ID NO34)KFLW(SEQ ID NO35)上述肽或者其部分可以例如如上所述在1,2,2’,3,3’和/或4位与1,4-苯并二氮杂或1,4-苯并硫杂吖庚因连接。
在一个优选的实施方案中，在根据式Ⅳ的1,4-苯并二氮杂的1(R′)和/或3(R)位连接所述的肽。然后两个肽的加和(R+R’)代表如上所述的肽或者其部分。因此，1,4-苯并二氮杂可以在上述肽的任何位置。例如，当R+R’=FAKYLWEWASVR(SEQ ID NO2)时，R和/或R’可以以各种方式连接1,4-苯并二氮杂(Bdz)
Bdz-FAKYLWEWASVR: R’=FAKYLWEWASVR(SEQ ID NO2)；或F-Bdz-AKYLWEWASVR:R=F,R’=AKYLWEWASVR(SEQ ID NO36)；或FA-Bdz-KYLWEWASVR:R=FA(SEQ ID NO37),R’=KYLWEWASVR(SEQ ID NO38)；或FAK-Bdz-YLWEWASVR:R=FAK(SEQ ID NO39),R’=YLWEWASVR(SEQ ID NO40)；或FAKY-Bdz-LWEWASVR:R=FAKY(SEQ ID NO41),R’=LWEWASVR(SEQ ID NO42)；或FAKYL-Bdz-WEWASVR:R=FAKYL(SEQ ID NO43)；R’=WEWASVR(SEQ ID NO44)；或FAKYLW-Bdz-EWASVR:R=FAKYLW(SEQ ID NO9),R’=EWASVR(SEQ ID NO45)；或FAKYLWE-Bdz-WASVR:R=FAKYLWE(SEQ ID NO46),R’=WASVR(SEQ ID NO47)；或FAKYLWEW-Bdz-ASVR:R=FAKYLWEW(SEQ ID NO10),R’=ASVR(SEQ ID NO48)；或FAKYLWEWA-Bdz-SVR:R=FAKYLWEWA(SEQ ID NO49),R’=SVR(SEQ ID NO50)；或FAKYLWEWAS-Bdz-VR:R=FAKYLWEWAS(SEQ ID NO11),R’=VR(SEQ ID NO51)；或FAKYLWEWASV-Bdz-R:R=FAKYLWEWASV(SEQ ID NO52),R’=R；或FAKYLWEWASVR-Bdz:R=FAKYLWEWASVR(SEQ ID NO2)；其中通过3位修饰有胺之后的肽的C-末端在3位连接R和/或通过1位修饰有羧甲基之后的肽的N-末端在1位连接R’。在只有R是一个肽的情况下，1位被甲基化或羧甲基化。在只有R’是一个肽的情况下，3位包含胺。图8给出了这些化合物的实施例。
1,4-苯并二氮杂也可以连接上述肽的仅仅一部分。例如，可以在缺失一个或多个氨基酸的上述肽中的任何位置连接1,4-苯并二氮杂。
当R+R’=FAKYLWEWASVR(SEQ ID NO2)时，其部分可以以任何方式与1,4-苯并二氮杂(Bdz)连接，例如Bdz-AKYLWEWASVR；或 Bdz-KYLWEWASVR；或F-Bdz-KYLWEWASVR；或F-Bdz-YLWEWASVR；或FA-Bdz-YLWEWASVR；或FA-Bdz-LWEWASVR；或FAK-Bdz-LWEWASVR；或FAK-Bdz-WEWASVR；或FAKY-Bdz-WEWASVR；或FAKY-Bdz-EWASVR；或FAKYL-Bdz-EWASVR；或FAKYL-Bdz-WASVR；或
FAKYLW-Bdz-WASVR或；FAKYLW-Bdz-ASVR；或FAKYLWE-Bdz-ASVR；或FAKYLWE-Bdz-SVR；或FAKYLWEW-Bdz-SVR；或FAKYLWEW-Bdz-VR；或FAKYLWEWA-Bdz-VR；或FAKYLWEWA-Bdz-R；或FAKYLWEWAS-Bdz-R；或FAKYLWEWAS-Bdz；或FAKYLWEWASV-Bdz；其中如上所述，肽通过其C-末端和/或N-末端连接。
如上所述的肽或者其部分也可以利用如上所述的连接基团通过它们的N-末端与3位连接。图11给出了这样的化合物的实施例。
本发明进一步涉及由下面氨基酸序列或者其部分之一组成的多肽FAKYLW-K(bio)(SEQ ID NO5)FAKYLWEW-K(bio)(SEQ ID NO6)FAKYLWEWAS-K(bio)(SEQ ID NO7)FAKYLWEWASVR-K(bio)(SEQ ID NO8)FARFLWEWASVR-K(bio)(SEQ ID NO12)FGKFLWEWASAR-K(bio)(SEQ ID NO13)LGKYLWEWASAR-K(bio)(SEQ ID NO14)FAKFLWEWASVR-K(bio)(SEQ ID NO15)KYGW-K(bio)(SEQ ID NO16)KFGW-K(bio)(SEQ ID NO17)RFGW-K(bio)(SEQ ID NO18)AYLW-K(bio)(SEQ ID NO19)AFLW-K(bio)(SEQ ID NO20)KYLW-K(bio)(SEQ ID NO21)RFLW-K(bio)(SEQ ID NO22)KFLW-K(bio)(SEQ ID NO23)FAKYLW(SEQ ID NO9)
FAKYLWEW(SEQ ID NO10)FAKYLWEWAS(SEQ ID NO11)FARFLWEWASVR(SEQ ID NO24)FGKFLWEWASAR(SEQ ID NO25)LGKYLWEWASAR(SEQ ID NO26)FAKFLWEWASVR(SEQ ID NO27)KYGW(SEQ ID NO28)KFGW(SEQ ID NO29)RFGW(SEQ ID NO30)AYLW(SEQ ID NO31)AFLW(SEQ ID NO32)KYLW(SEQ ID NO33)RFLW(SEQ ID NO34)KFLW(SEQ ID NO35)这些肽是天然的或者是HBV基因型A/B的HBsAg的膜联蛋白结合表位的同源变体。还出人意料地发现它们抑制膜联蛋白Ⅴ和HBV的HBsAg之间的相互作用。
在根据本发明的化合物中使用的多肽可以由L形式或D形式或者其混合形式的氨基酸组成。在优选的实施方案中，本发明的化合物特征在于所有的氨基酸都是L形式。在另一个优选的实施方案中，本发明的化合物特征在于所有的氨基酸都是D形式。
本发明还包括包含或者由如上所述多肽的反向-反转多肽(例如Guichard等，1994描述的)组成的化合物。
应该注意提到的所有的化合物可能是前导化合物，其上可以进一步改善1,4-苯并二氮杂/1,4-苯并硫杂吖庚因核心或肽配体的另外的衍生化作用。
本发明还涉及如上定义的多肽与带负电荷的磷脂例如磷脂酰丝氨酸的组合物。WO97/07268中已经证实了磷脂酰丝氨酸和膜联蛋白之间的相互作用。所述多肽与带负电荷的磷脂成分的组合物可以是本领域公知的任何可能的方式，例如共价或非共价偶联分子的形式或脂质体形式等。
本发明进一步涉及制备上述1,4-苯并二氮杂类或1,4-苯并硫杂吖庚因类衍生物的方法。用于制备1,4-苯并二氮杂类或1,4-苯并硫杂吖庚因的方法是本领域公知的。这些方法包括但不限于Sternbach等(1963),US3109843,US3116203,US3121114,US3123529和US3203990描述的方法。1,4-苯并二氮杂类和1,4-苯并硫杂吖庚因类也可以以商业途径从Sigma(Dreisenhofen，德国)或Neosystem(Strasbourg，法国)购得。从膜联蛋白结合蛋白衍生的多肽，更具体地说，从结合膜联蛋白的病毒蛋白衍生的多肽，更具体地说从HBV和/或HDV的HBsAg衍生的多肽，从巨细胞病毒的糖蛋白B或者从任何流感病毒的膜联蛋白结合蛋白衍生的多肽通过本领域公知的任何方法与1,4-苯并二氮杂类或1,4-苯并硫杂吖庚因类连接。例如，通过使用(R,S)-Fmoc-3-氨基-N-1-羧甲基-2-氧代-5-环己基-1,4-苯并二氮杂(FB03601；N eosystem,Strasbourg，法国，图7)作为结构单元通过以Fmoc为基础的肽合成可以连接肽。图8给出了得到的分子的例子。通过利用Pierce产品目录(Pierce,Rockford,IL,USA)中描述的同型双功能连接基团通过肽的N-末端使肽与1,4-苯并二氮杂的3位连接可以合成其它的1,4-苯并二氮杂类衍生物。图9或10给出了这样的反应。图11给出了得到的分子的例子。
本发明还涉及本发明的化合物制备预防或治疗其中涉及膜联蛋白家族成员和膜联蛋白结合蛋白之间的相互作用的任何疾病的药物的用途。
更特别地，本发明涉及本发明的化合物制备预防或治疗其中涉及病毒蛋白和膜联蛋白家族成员之间的相互作用的任何病毒疾病的药物的用途。
更特别地，本发明涉及本发明的化合物制备通过抑制HBV和/或HDV与膜联蛋白Ⅴ的相互作用来干扰HBV和/或HDV的生活周期从而预防或治疗HBV和/或HDV感染的药物的用途。关于这一点，术语“HBV和/或HDV”的应用指HBV感染可以单独发生或者伴随HDV超感染这一点是清楚的。另一方面，HDV感染不单独发生。换句话说，本发明的分子可以用于制备预防或治疗单独的HBV感染或混合的HBV/HDV感染的药物。
本发明进一步涉及本发明的化合物制备通过抑制巨细胞病毒与膜联蛋白Ⅱ的相互作用来干扰巨细胞病毒的生活周期从而预防或治疗巨细胞病毒感染的药物的用途。
本发明进一步涉及本发明的化合物制备通过抑制流感病毒与膜联蛋白Ⅴ的相互作用来干扰流感病毒的生活周期从而预防或治疗流感病毒感染的药物的用途。
因此，本发明涉及本发明的化合物制备预防或治疗其中涉及膜联蛋白家族成员与蛋白质相互作用的任何疾病，更特别地涉及预防或治疗其中涉及病毒蛋白和宿主膜联蛋白家族成员之间的相互作用的任何病毒疾病，更特别地涉及预防或治疗HBV和/或HDV感染、巨细胞病毒感染或流感病毒感染的药物的用途。
本发明进一步涉及DBA753、根据式Ⅱ的化合物或者根据式Ⅲ的化合物制备预防或治疗其中涉及膜联蛋白家族成员与蛋白质相互作用的任何疾病，更特别地预防或治疗其中涉及病毒蛋白和宿主膜联蛋白家族成员之间的相互作用的任何病毒疾病，更特别地预防或治疗HBV和/或HDV感染、巨细胞病毒感染或流感病毒感染的药物的用途。
在本发明中，BDA753特别用来抑制HBV与膜联蛋白Ⅴ的相互作用。尽管证实了膜联蛋白Ⅴ与衍生有AYGW的1,4-苯并二氮杂类和1,4-苯并硫杂吖庚因的结合(Hoffman等，1998)，但是没有肽衍生化作用或者在3位只衍生有一个氨基酸的1,4-苯并二氮杂类不能抑制HBV的HBsAg与膜联蛋白Ⅴ的相互作用。出我们意料的是用肽AYGW将1,4-苯并二氮杂衍生化得到能抑制HBV的HBsAg与膜联蛋白Ⅴ的相互作用的化合物。
因此，本发明还涉及包含下面氨基酸序列或者其部分的肽的用途AYGW(SEQ ID NO3)用于制备预防或治疗其中涉及蛋白质与膜联蛋白家族成员相互作用的任何疾病，更特别地预防或治疗其中涉及病毒蛋白和宿主膜联蛋白家族成员之间的相互作用的任何病毒疾病，更特别地预防或治疗HBV和/或HDV感染、巨细胞病毒感染或流感病毒感染的药物的用途。
本发明进一步涉及一种预防或治疗其中涉及蛋白质与膜联蛋白家族成员相互作用的任何疾病，更特别地预防或治疗其中涉及病毒蛋白和膜联蛋白家族成员之间的相互作用的任何病毒疾病，更特别地预防或治疗HBV和/或HDV感染、巨细胞病毒感染或流感病毒感染或者它们的任何突变病毒株感染的药物组合物或药物(两个术语可以互换使用)，它们包括至少一种本发明的化合物、至少BDA753，至少一种根据式Ⅱ的化合物、至少一种根据式Ⅲ的化合物或者至少肽AYGW(SEQ ID N03)和可能地，一种药学可接受载体或赋形剂(两个术语可以互换使用)。任选地，所述组合物可以含有用于抗上述感染的其它治疗剂。这些治疗剂包括但不限于用于HBV的adefovir,BMS200475,famciclovir，膦甲酸，fiacitabine,fialuridine,(-)-FTC，更昔洛韦，GEM132，干扰素，lamivuding,L-FMAU,lobucavir，正-二十二烷醇，利巴韦林，索利夫定，阿糖腺苷或者WO98/18818中提到的化合物；用于巨细胞病毒的阿昔洛韦，adefovir,cidofovir，环HPMPC,fiacitabine,fomivirsen，更昔洛韦，I263W94,lobucavir，利巴韦林，valaciclovir或阿糖腺苷；用于流感的金刚烷胺，GG167,GS4104，利巴韦林或金刚乙胺。“药物”可以通过技术人员知识内任何合适的方法施用。优选地，施用方式可以是经肠或非经肠给药。本发明的组合物可以是适合这样的给药方法的任何已知的药物组合物形式。所述组合物可以以本领域技术人员公知的方法配制，使得活性化合物控制释放的，例如快速释放或缓释。这些药物组合物的活性物质也可以单独给药，没有载体赋形剂。但是，它们也可以与药学可接受无毒载体或稀释剂一起施用，其中比例由具体载体的适配性和化学性质确定。技术人员公知的合适的载体或赋形剂是盐水，Ringer’s溶液，葡萄糖溶液，Hank’s溶液，固定油，油酸乙酯，5％葡萄糖盐水溶液，提高等渗性和化学稳定性的物质，缓冲液和防腐剂。
在非经肠给药中，本发明的药物以与如上定义的药学可接受的赋形剂结合的溶液，悬浮液或乳状液的单位剂量可注射形式配制。但是给药的剂量和方法将取决于个体。一般情况下，施用药物，使得以1微克/千克至100毫克/千克，更优选地以10微克/千克至20毫克/千克，最优选地以0.1至2毫克/千克给与本发明的化合物。优选地，以大丸剂剂量给药。也可以使用连续灌注。如果使用连续灌注，可以以1至100微克/千克/分钟，更优选地5至20微克/千克/分钟的剂量灌注药物。
适合口服的剂量形式包括但不限于片剂，丸剂，胶囊剂，caplets，颗粒剂，粉末剂，酏剂，糖浆，溶液和含水或油悬浮液。用于对人给药的合适的活性化合物的日剂量一般是大约1毫克至大约5000毫克，更通常大约5毫克至大约1000毫克，单独一次剂量给药或者每天一次或多次分剂量给药。
本发明最后涉及如上所述的化合物在筛选阻断膜联蛋白和与膜联蛋白相互作用的任何蛋白质，更特别地，与膜联蛋白相互作用的任何病毒蛋白，更特别地，HBV的HBsAg蛋白质、巨细胞病毒的糖蛋白B或任何流感病毒的膜联蛋白结合蛋白之间的结合的分子的方法中的用途。如这里所使用的，术语“筛选分子的方法”指适合分子筛选的本领域公知的任何方法。特别地，该术语指本发明的实施例1描述的方法。
本发明现在通过参考给出的特别有利的实施方案的实施例详细说明。但是应该注意这些实施例是说明性的不以任何方式限制本发明。说明书和权利要求书中除非另有说明，术语“包含”，及其变化表示例如“包含”和“含有”理解为指包括所述的整体部分或所述的整体部分或步骤的步骤或组，但是不排除任何其它整体部分或整体部分或步骤的步骤或组。
表和附图的简要说明表1提供了涉及确定HBsAg的6个基因型(A,B,C,D,E,F)的“小”HBsAg的99-169位氨基酸的区和认定检查的多肽结合膜联蛋白Ⅴ的序列信息。
图1给出了1,4-苯并二氮杂类和1,4-苯并硫杂吖庚因类的基础结构式(式Ⅰ)，其中*在1位-苯并硫杂吖庚因类具有一个硫原子(X代表S)；X也可以是SOn，其中n=0,1,2；-苯并二氮杂类具有一个氮原子(X代表N)，其在1位另外修饰有羧甲基(-CH2COOH)之后，允许通过肽的C-末端连接的或者通过肽的N-末端连接的另外修饰有一个权利要求书中定义为“含有一个膜联蛋白结合蛋白的膜联蛋白结合表位的肽”的肽或者其部分。在N不修饰有一个肽的情况下，修饰可以是H，烷基，苯基，-COZ，其中Z代表H，烷基，苯基或取代的苯基；*1,2,3,4,5位可以以邻接位置形成双键；如果是这种情况，则支链R2,R4,R5或R7不存在；*2和/或2’位上的R1和/或R2可以代表H，胺，烷基或者位置2可以被氧化(=O)。在R1和/或R2是胺的情况下，其可以进一步地或者直接通过肽的C-末端连接或者通过象戊二醛或琥珀酐这样的连接基团连接于肽的N-末端而被一个权利要求书中定义为“含有一个膜联蛋白结合蛋白的膜联蛋白结合表位的肽”的肽或者其部分取代；*3和/或3’位上的R3和/或R4可以代表H，胺或烷基。在R3和/或R4是胺的情况下，其可以进一步地或者直接通过肽的C-末端连接或者通过象戊二醛或琥珀酐这样的连接基团连接于肽的N-末端而被一个权利要求书中定义为“含有一个膜联蛋白结合蛋白的膜联蛋白结合表位的肽”的肽或者其部分取代；*4位上的R5可以代表4位另外修饰有羧甲基(-CH2COOH)后或者直接通过肽的C-末端连接的或者通过肽的N-末端连接的权利要求书中定义为“含有一个膜联蛋白结合蛋白的膜联蛋白结合表位的肽”的肽或者其部分的支链。在R5不是权利要求书中定义的肽的情况下，R5可以代表H，烷基，-CO-R12或者3-(1-(4-苄基)哌啶基)丙酰基)；*R6和/或R7代表H或烷基或苯基，可能进一步取代有烷基，氰基，卤素，硝基，烷基烷氧基，烷酰基，羧基，烷酰基烷氧基，氨基甲酰基；*R8,R9,R10和/或R11代表H，烷基，氰基，卤素，硝基，烷基烷氧基，烷酰基，羧基，烷酰基烷氧基，氨基甲酰基；*R12代表H或烷基或可能进一步取代有烷基，氰基，卤素，硝基，烷基烷氧基，烷酰基，羧基，烷酰基烷氧基，氨基甲酰基的苯基。
图2给出了式Ⅱ的结构(FR2479818)，其中*在2位，R代表一个氨基酸或者由两个或三个氨基酸组成的肽；*X代表氯或氟。
图3给出了式Ⅲ的结构，其中1,4-苯并二氮杂的3位被肽ARPYN取代并且1位被L残基取代(Nachman等，1998)。
图4给出了式Ⅳ的结构，其中
*R,R’和/或R+R’构成包含膜联蛋白结合蛋白膜联蛋白结合表位的肽或者其部分。在只有R是一个肽的情况下，位置1是甲基化的。在只有R’是一个肽的情况下，位置3含有胺；*X代表可以被-COCH3修饰的肽的N-末端；*Y代表可以被-NH2或-赖氨酸-生物素修饰的肽的C-末端。
图5给出了式Ⅴ的结构，其中肽R通过其N-末端通过连接基团(SPC)连接。
图6给出了实施例1中描述的1,4-苯并二氮杂类衍生物的结构BDA250:1,3-二氢-1-甲基-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮；BDA452:3-(R,S)-(L-色氨酰基)-1,3-氢-1-甲基-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮；BDA753:3-(R,S)-全-L-(NH-Trp-G1y-Tyr-Ala-H)-1,3-二氢-1-甲基-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮。
图7给出了用于1,4-苯并二氮杂类衍生物合成的Fmoc保护的(R,S)-Fmoc-3-氨基-N-1-羧甲基-2-氧代-5-环己基-1,4-苯并二氮杂(FB03601；Neosystem,Strasbourg，法国)。
图8给出了一些根据式Ⅳ的1,4-苯并二氮杂类衍生物的例子。
图9给出了通过使用戊二醛作为连接基团合成根据式Ⅴ的1,4-苯并二氮杂衍生物的基础反应。
图10给出了通过使用琥珀酸酐作为连接基团合成根据式Ⅴ的1,4-苯并二氮杂衍生物的基础反应。
图11给出了一些根据式Ⅴ的1,4-苯并二氮杂类衍生物的例子。
图12证明不同的化合物对膜联蛋白Ⅴ和HBsAg之间的相互作用的不同抑制在图6中描述了BDA250,BDA452和BDA753；IGP1362和IGP1363是分别从HBV的HBsAg的158-169位氨基酸和115-125位氨基酸衍生的肽并且在表1中给出。BDA753能抑制膜联蛋白Ⅴ和HBsAg之间的相互作用，而只包含该分子(BDA250)的苯并二氮杂部分的化合物则不能。
图13证明代表HBsAg的158-169位氨基酸的天然变体或代表C-末端没有另外修饰生物素化赖氨酸的肽(IGP1632)的不同肽对膜联蛋白Ⅴ和HBsAg之间的相互作用的不同抑制(表1)。这些结果归一化为IGP1481的抑制效力。
图14证明代表IGP1481的C-末端截短的变体的不同肽对膜联蛋白Ⅴ和HBsAg之间的相互作用的不同抑制(表1)。这些结果归一化为IGP1481的抑制效力。
图15证明代表IGP1481的非天然突变体的不同肽对膜联蛋白Ⅴ和HBsAg之间的相互作用的不同抑制(表1)。这些结果归一化为IGP1481的抑制效力。带星号的肽在试验的最高浓度表现出没有抑制作用，在这些情况下条匡代表试验的最高相对浓度。
实施例实施例1:1,4-苯并二氮杂和衍生物对膜联蛋白Ⅴ对HBsAg的结合的影响为了证明膜联蛋白Ⅴ结合分子对HBsAg与膜联蛋白Ⅴ的相互作用的影响进行了竞争试验。使膜联蛋白Ⅴ结合化合物(图6和表1)在结合膜联蛋白Ⅴ中与HBsAg竞争。最后测定与HBsAg结合的标记的膜联蛋白Ⅴ。简要地说，将重组HBsAg包被在微量滴定板(2微克/毫升，4℃下在补充有1mM氯化钙和1mM氯化镁的TBS中过夜)上。用3％冷的鱼明胶封闭平板后(室温下在补充有1mM氯化钙和1mM氯化镁的TBS中培养2小时)，在过量肽或化合物存在下加入125I-标记的膜联蛋白Ⅴ(50ng)，并且使相互作用(37℃下在补充有1mM氯化钙和1mM氯化镁和0.3％冷的鱼明胶的TBS中培养2小时)。温育之后用补充有1mM氯化钙和1mM氯化镁和0.05％Tween-20的TBS冲洗平板三次。该项试验重复进行6次，表达的结果是平均值(平均值顶点上的线代表标准偏差)。使用的各种化合物或肽对HBsAg的摩尔过量如下BDA25025000BDA45213750BDA7531600IGP1362 400IGP1363 560从图12可以判断，BDA753和IGP1362分子破坏膜联蛋白Ⅴ与HBsAg的结合。BDA753由衍生有4个氨基酸的肽链的1,4-苯并二氮杂组成。其苯并二氮杂部分与BDA250相同，其结合膜联蛋白但是不能抑制HBsAg对膜联蛋白Ⅴ的结合。相反，BDA250却增强了结合。具有和BDA250类似核心结构但是带有胺化的色氨酸的分子BDA452根本不影响HBsAg对膜联蛋白Ⅴ的结合，而分子BDA753确实抑制HBsAg对膜联蛋白Ⅴ的结合。从这些结果可以得出结论，BDA753上存在的而BDA452上不存在的三个另外的氨基酸是观察到的竞争作用的原因。最可能的是这些氨基酸和HBsAg一样对膜联蛋白Ⅴ在相同位点结合。已经存在于BDA452中的胺化的色氨酸残基也可能部分干扰HBsAg结合，因为该附加的色氨酸残基确实破坏BDA250引起的结合增强。这表明也可以进一步修饰BDA452获得更好的抑制膜联蛋白Ⅴ对HBsAg结合的特异性。包含HBsAg的aa158-169的肽IGP1362也能抑制HBsAg对膜联蛋白Ⅴ的结合(图12)并且最可能结合和BDA753结合时的相同位点。应该注意并不是所有的肽序列都得到和肽IGP1363代表的序列相同的结果，所述IGP1363也由HBsAg(氨基酸115-125)衍生，但是不抑制膜联蛋白Ⅴ对HBsAg的结合。可以得出结论该肽中存在的序列不结合膜联蛋白Ⅴ的HBsAg结合区。
因此，IGP1362或者其部分连接1,4-苯并二氮杂类，BDA250或BDA452或者其任何衍生物。这样的分子可以使用(R,S)-Fmoc-3-氨基-N-1-羧甲基-2-氧代-5-环己基-1,4-苯并二氮杂(FB03601；Neosystem,Strasbourg，法国，图7)作为结构单元通过以Fmoc为基础的肽合成来制备。图8给出了得到的分子的实施例。通过在如图9和10所示的反应中利用连接基团分子通过肽的N-末端使肽与3胺-1,4-苯并二氮杂连接来合成其它1,4-苯并二氮杂类衍生物。图11给出了得到的分子的实施例。在竞争实验中测试得到的1,4-苯并二氮杂类衍生物来证明在阻断膜联蛋白Ⅴ与HBsAg的相互作用中的提高的特异性。
实施例2与膜联蛋白Ⅴ结合的HBsAg序列的进一步鉴定为了更详细地研究肽序列对HBsAg-膜联蛋白Ⅴ结合的抑制作用，进一步优化了结合测定。这导致下面的测定设置·将微量滴定板包被HBsAg:500ng/100微升，1小时，37℃；·封闭TBS3％(v/v)冷鱼明胶，1小时，室温；
·结合50ng放射标记膜联蛋白Ⅴ/100微升(在TBS,10mM氯化钙，0.3％(v/v)冷鱼明胶中在37℃下与竞争化合物预培养1小时)，1小时，37℃；·冲洗用200微升TBS,10mM氯化钙，0.05％(v/v)Tween-20，室温下冲洗三次；·用SDS(60微升，1小时，37℃)洗脱结合的标记物，接着在γ计数器中计数。
肽IGP1362是有支链的肽，在生物素化的赖氨酸核心上存在小HBsAg的氨基酸158-169两个支链(表1)。该序列也从带有在ε胺官能团上带有生物素的C-末端赖氨酸或者带有酰胺化的C-末端的单体形式(IGP1481和1623，见表1)来合成。另外，制备代表HBsAg的相同区(氨基酸158-169)但是从HBV的其它基因型衍生的肽代表C基因型中发现的主要序列的IGP1624和1625，代表D/E基因型中发现的主要序列的IGP1618和代表基因型F中发现的主要序列的IGP1619，而IGP1481代表A/B基因型中发现的主要序列(表1)。肽IGP1481,1624,1625,1618和1619的总序列代表1998年10月公共序列数据库中可获得的460条HBsAg序列的90％。所有的肽都经反相色谱纯化并且为了证实期望的肽的存在对含有肽的级分用质谱进行分析。在膜联蛋白Ⅴ/HBsAg结合测定中测定纯化的肽并且以对包被的重组HBsAg的摩尔过量计算导致50％竞争作用的浓度。对达到50％竞争水平的摩尔过量对于IGP1481是17.5,IGP1481是与包被的HBsAg同源的序列。其它肽的结果在图13中给出并且归一化为用IGP1481获得的值(将达到50％竞争水平的IGP1481的摩尔过量设定为1)。从该图可以判断从其它基因型衍生的所有的肽表现出相同等级大小的竞争水平(最大差异是对于IGP1625低5倍)。从该结果可以预言存在的HBsAg的所有天然变体表现出相同的效力。出人意料的是除了生物素化赖氨酸外与1481相同的肽1623活性小7倍。因此对肽加上一个生物素化赖氨酸以这样一种方式改变其性质使得效力被提高。IGP1481,1618,1619,1624或1625或者其部分连接1,4-苯并二氮杂，BDA250,BDA452或者其任何衍生物。在竞争实验中测定得到的1,4-苯并二氮杂类衍生物来证明它们在阻断膜联蛋白Ⅴ与HBsAg的相互作用中提高的特异性。
实施例3与膜联蛋白Ⅴ结合的HBsAg序列的进一步描述为了测定序列158-169的哪一部分对于观察到的竞争作用重要，合成了C-末端截短的肽，通过反相色谱纯化并且通过质谱证实其结构。制备与IGP1481相比分别缺失2,4和6个氨基酸的三个这样的肽，IGP1556,1557和1558(见表1)并且测定竞争作用。只缺失2个C-末端氨基酸的肽IGP1556效力只小10倍，缺失4个氨基酸的IGP1557也是如此，而缺失6个氨基酸的IGP1558活性小100倍(图14)。
IGP1556,1557或1558或者其部分连接1,4-苯并二氮杂类，BDA250,BDA452或者其任何衍生物。在竞争实验中测定得到的1,4-苯并二氮杂类衍生物来证明它们在阻断膜联蛋白Ⅴ与HBsAg的相互作用中提高的特异性。
实施例4在阻断膜联蛋白Ⅴ与HBsAg的相互作用具有提高的特异性的化合物的鉴定两种肽IGP1623和BDA753确实抑制膜联蛋白Ⅴ与HBsAg的相互作用。而且这些化合物表现出一定程度的序列同源性FAKYLWEWASVRAYGW-Bdz通过提高BDA753和IGP1623或者其天然变体例如IGP1618,1619,1624和1625之间的同源性，产生具有提高的阻断膜联蛋白Ⅴ与HBsAg之间的相互作用中的特异性的新的化合物。这样的化合物是KYGW-BdzKFGW-BdzRFGW-BdzAYLW-BdzAFLW-BdzKYLW-BdzRFLW-BdzKFLW-BdzBdz代表其中3位修饰有肽通过其C-末端与其连接的胺并且1位可以修饰为羧甲基的化合物BDA250(图6)。
实施例5对于在阻断膜联蛋白Ⅴ与HBsAg之间的相互作用中的高特异性重要的HBV的HBsAg的158-169区中的氨基酸的鉴定为了鉴定对于肽IGP1481抑制HBsAg和膜联蛋白Ⅴ之间的相互作用的效力重要的HBV的HBsAg的氨基酸序列158-169中的残基，几个氨基酸突变为丙氨酸或谷氨酰胺(IGP1482,1483,1484,1485,1486,1487,1488,1489,1493和1622，见表1)。所有的肽再次通过反相色谱纯化并且通过质谱证实存在期望的结构。图15说明这些肽对于IGP1481的相对竞争。这些结果证明，160位的氨基酸是重要的并且该赖氨酸突变为丙氨酸(IGP1484)诱导至少20倍的活性(最高试验浓度仍然不导致竞争)。如实施例4具体说明的，该些实验支持化合物BDA753中氨基酸丙氨酸至赖氨酸(或精氨酸)的突变的影响。对于通常是亮氨酸的162位氨基酸发现了相同的结果。该亮氨酸突变为谷氨酰胺(IGP1486)几乎破坏了活性，而该亮氨酸突变为丙氨酸(IGP1622)导致活性降低至少25倍(最高试验浓度仍然不导致竞争)。如实施例4具体说明的，该些实验支持化合物BDA753中氨基酸甘氨酸至亮氨酸的突变的影响。表1:HBV基因型和检测了与膜联蛋白Ⅴ结合的多肽的最常见的序列100 110 120 130 140 150 160170geno * * * * * * * *HBsAg A DYQGMLPVCPLIPGSTTTSTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVR (SEQ ID NO53)HBsAg B DYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVR (SEQ ID NO54)HBsAg C DYQGMLPVCPLLPGTSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVR (SEQ ID NO55)HBsAg CK (SEQ ID NO56)HBsAg D DYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASAR (SEQ ID NO57)HBsAg E DYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCTTLAQGTSMYPSCCCSKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASAR (SEQ ID NO58)HBsAg F DYQGMLPVCPLIPGSTTTSTGPCKTCTTLAQGTSMYPSCCCSFPSDGNCTCIPIPSSWALGKYLWEWASAR (SEQ ID NO59)IGP1363 (TTSTGPCKTCT)2-KKGK(bio)GA (SEQ ID NO60)IGP1362(FAKYLWEWASVR)2-KKGK(bio)GA (SEQ ID NO4)IGP1481 FAKYLWEWASVR-K(bio) (SEQ ID NO8)IGP1623 FAKYLWEWASVR (SEQ ID NO2)IGP1624 FARFLWEWASVR-K(bio) (SEQ ID NO12)IGP1618 FGKFLWEWASAR-K(bio) (SEQ ID NO13)IGP1619 LGKYLWEWASAR-K(bio) (SEQ ID NO14)IGP1625 FAKFLWEWASVR-K(bio) (SEQ ID NO15)IGP1556 FAKYLWEWAS-K(bio) (SEQ ID NO7)IGP1557 FAKYLWEW-K(bio) (SEQ ID NO6)IGP1558 FAKYLW-K(bio) (SEQ ID NO5)IGP1482 AAKYLWEWASVR-K(bio) (SEO ID NO61)IGP1483 FNKYLWEWASVR-K(bio) (SEQ ID NO62)IGP1484 FAAYLWEWASVR-K(bio) (SEQ ID NO63)IGP1485 FAKALWEWASVR-K(bio) (SEQ ID NO64)IGP1486 FAKYNWEWASVR-K(bio) (SEQ ID NO65)IGP1487 FAKYLAEWASVR-K(bio) (SEQ ID NO66)IGP1488 FAKYLWAWASVR-K(bio) (SEQ ID NO67)IGP1489 FAKYLWEAASVR-K(bio) (SEQ ID NO68)IGP1493 FAKYLWEWASVA-K(bio) (SEQ ID NO69)IGP1622 FAKYAWEWASVR-K(bio) (SEQ ID NO70)
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权利要求
1．根据式Ⅰ的衍生有一个或多个包含膜联蛋白结合蛋白的膜联蛋白结合表位的肽或者其部分的化合物，前提是所述化合物不是BDA753，根据式Ⅱ的化合物或根据式Ⅲ的化合物。
2．根据式Ⅳ的衍生有一个或两个肽R和/或R’的化合物，使得R,R’和/或R+R’代表包含膜联蛋白结合蛋白的膜联蛋白结合表位的肽或者其部分，前提是所述化合物不是BDA753或根据式Ⅲ的化合物。
3．根据式Ⅴ的衍生有包含膜联蛋白结合蛋白的膜联蛋白结合表位的肽或者其部分，R，的化合物。
4．根据权利要求1-3任一项的化合物，其中所述膜联蛋白结合蛋白是病毒蛋白。
5．根据权利要求4的化合物，其中所述病毒蛋白是HBV的表面抗原。
6．根据权利要求4的化合物，其中所述病毒蛋白是巨细胞病毒的糖蛋白B。
7．根据权利要求4的化合物，其中所述病毒蛋白是从任何流感病毒株衍生的蛋白，条件是该流感蛋白结合膜联蛋白Ⅴ。
8．根据权利要求4的衍生有一个或多个下面的肽或者其部分的化合物KTCTTPAQGN(SEQ ID NO1)(FAKYLWEWASVR)2-KKGK(bio)GA(SEQ ID NO4)FAKYLW-K(bio)(SEQ ID NO5)FAKYLWEW-K(bio)(SEQ ID NO6)FAKYLWEWAS-K(bio)(SEQ ID NO7)FAKYLWEWASVR-K(bio)(SEQ ID NO8)FAKYLW(SEQ ID NO9)FAKYLWEW(SEQ ID NO10)FAKYLWEWAS(SEQ ID NO11)FAKYLWEWASVR(SEQ ID NO2)FARFLWEWASVR-K(bio)(SEQ ID NO12)FGKFLWEWASAR-K(bio)(SEQ ID NO13)LGKYLWEWASAR-K(bio)(SEQ ID NO14)FAKFLWEWASVR-K(bio)(SEQ ID NO15)KYGW-K(bio)(SEQ ID NO16)KFGW-K(bio)(SEQ ID NO17)RFGW-K(bio)(SEQ ID NO18)AYLW-K(bio)(SEQ ID NO19)AFLW-K(bio)(SEQ ID NO20)KYLW-K(bio)(SEQ ID NO21)RFLW-K(bio)(SEQ ID NO22)KFLW-K(bio)(SEQ ID NO23)FARFLWEWASVR(SEQ ID NO24)FGKFLWEWASAR(SEQ ID NO25)LGKYLWEWASAR(SEQ ID NO26)FAKFLWEWASVR(SEQ ID NO27)KYGW(SEQ ID NO28)KFGW(SEQ ID NO29)RFGW(SEQ ID NO30)AYLW(SEQ ID NO31)AFLW(SEQ ID NO32)KYLW(SEQ ID NO33)RFLW(SEQ ID NO34)KFLW(SEQ ID NO35)
9．具有下面氨基酸序列之一的多肽或者其部分FAKYLW-K(bio)(SEQ ID NO5)FAKYLWEW-K(bio)(SEQ ID NO6)FAKYLWEWAS-K(bio)(SEQ ID NO7)FAKYLWEWASVR-K(bio)(SEQ ID NO8)FARFLWEWASVR-K(bio)(SEQ ID NO12)FGKFLWEWASAR-K(bio)(SEQ ID NO13)LGKYLWEWASAR-K(bio)(SEQ ID NO14)FAKFLWEWASVR-K(bio)(SEQ ID NO15)KYGW-K(bio)(SEQ ID NO16)KFGW-K(bio)(SEQ ID NO17)RFGW-K(bio)(SEQ ID NO18)AYLW-K(bio)(SEQ ID NO19)AFLW-K(bio)(SEQ ID NO20)KYLW-K(bio)(SEQ ID NO21)RFLW-K(bio)(SEQ ID NO22)KFLW-K(bio)(SEQ ID NO23)FAKYLW(SEQ ID NO9)FAKYLWEW(SEQ ID NO10)FAKYLWEWAS(SEQ ID NO11)FARFLWEWASVR(SEQ ID NO24)FGKFLWEWASAR(SEQ ID NO25)LGKYLWEWASAR(SEQ ID NO26)FAKFLWEWASVR(SEQ ID NO27)KYGW(SEQ ID NO28)KFGW(SEQ ID NO29)RFGW(SEQ ID NO30)AYLW(SEQ ID NO31)AFLW(SEQ ID NO32)KYLW(SEQ ID NO33)RFLW(SEQ ID NO34)KFLW(SEQ ID NO35)
10．根据权利要求1-9任一项的化合物，它包含或者由其中所有氨基酸是L形式或者其中所有氨基酸是D形式的多肽组成。
11．根据权利要求1-10任一项的化合物，它包括或者由反向-反转多肽组成。
12．制备根据权利要求1-11任一项的具体分子的方法。
13．根据权利要求1-11任一项的分子制备预防或治疗其中涉及蛋白质与膜联蛋白家族成员相互作用的任何疾病，更具体地预防或治疗其中涉及病毒蛋白和宿主膜联蛋白家族成员之间的相互作用的任何病毒疾病，更特别地预防或治疗HBV和/或HDV感染，巨细胞病毒感染或流感病毒感染的药物的用途。
14．根据BDA753、式Ⅱ的化合物或者根据式Ⅲ的化合物制备预防或治疗其中涉及蛋白质与膜联蛋白家族成员相互作用的任何疾病，更特别地预防或治疗其中涉及病毒蛋白和宿主膜联蛋白家族成员之间的相互作用的任何病毒疾病，更特别地预防或治疗HBV和/或HDV感染、巨细胞病毒感染或流感病毒感染的药物的用途。
15．包含下面氨基酸序列的肽或者其部分AYGW(SEQ ID NO3)用于制备预防或治疗其中涉及蛋白质与膜联蛋白家族成员相互作用的任何疾病，更特别地预防或治疗其中涉及病毒蛋白和宿主膜联蛋白家族成员之间的相互作用的任何病毒疾病，更特别地预防或治疗HBV和/或HDV感染、巨细胞病毒感染或流感病毒感染的药物的用途。
16．一种药物组合物，它含有至少一种根据权利要求1-11或13-15的分子，用于预防或治疗其中涉及蛋白质与膜联蛋白家族成员相互作用的任何疾病，更特别地预防或治疗其中涉及病毒蛋白和宿主膜联蛋白家族成员之间的相互作用的任何病毒疾病，更特别地预防或治疗HBV和/或HDV感染、巨细胞病毒感染或流感病毒感染。
17．根据权利要求1-11或13-15的化合物在筛选阻断膜联蛋白和与膜联蛋白相互作用的蛋白质，更特别地，与膜联蛋白相互作用的病毒蛋白，更特别地，HBV的HBsAg蛋白、巨细胞病毒的糖蛋白B或任何流感病毒的膜联蛋白结合蛋白之间的结合的分子的方法中的用途。
全文摘要
本发明涉及可以抑制膜联蛋白和膜联蛋白结合蛋白之间的相互作用的衍生有肽的1,4－苯并二氮杂类或1,4－苯并硫杂吖庚因类。具体地说,本发明涉及能抑制膜联蛋白和结合膜联蛋白的病毒蛋白质之间的相互作用的1,4－苯并二氮杂类或1,4－苯并硫杂吖庚因类衍生物,所述病毒蛋白质是例如HBV的HbsAg蛋白、巨细胞病毒的糖蛋白B或者来自流感病毒的任何膜联蛋白结合蛋白。这些1,4－苯并二氮杂类或1,4－苯并硫杂吖庚因衍生物可以用来预防或治疗其中涉及膜联蛋白家族成员和膜联蛋白结合蛋白之间的相互作用的疾病,例如HBV和/或HDV感染、巨细胞病毒感染或流感病毒感染。
文档编号C07K14/045GK1315963SQ99810388
公开日2001年10月3日 申请日期1999年8月25日 优先权日1998年9月1日
发明者E·德普拉, H·梅雷尔斯, G·梅尔滕斯 申请人:基因创新有限公司