一种松江鲈Tf?Hepcidin基因、松江鲈Tf?Hepcidin成熟肽蛋白及其应用
【专利摘要】本发明提供了一种松江鲈Tf?Hepcidin基因、松江鲈Tf?Hepcidin成熟肽蛋白及其应用，属于基因工程技术领域，获得了松江鲈Tf?Hepcidin基因的全长序列以及能够应用于水产养殖中的鱼源抗菌肽。该松江鲈Tf?Hepcidin基因，其序列全长为988bp，包含273bp基因开放阅读框。本发明可用于抗菌组合物或鱼饲料的制备中。
【专利说明】
-种松江妒Tf-Hepc i d i n基因、松江妒Tf-Hepc i d i n成熟化蛋 白及其应用
技术领域
[0001 ] 本发明属于基因工程技术领域，具体设及一种松江驴Tf-胎pcidin基因的cDNA全 长序列，由其通过酵母真核表达系统表达得到的松江驴Tf-胎pcidin成熟肤蛋白及其应用。
【背景技术】
[0002] 松江驴（Trachidermus fasciatus)又名四觸驴，隶属于軸形目 (Sco;rpaenifo;rme)，杜父鱼科(Cottidae)，松江驴属(Trachidermus)，是一种典型的降海徊 游性的小型鱼类，整个生长期面临海水与淡水两种更加复杂的生存环境，曾广泛分布于我 国沿海。近年来，由于水体污染及兴建河道水利等原因破坏了松江驴栖息、繁殖和徊游路 线，导致该物种种群数量锐减，分布区也急剧缩小，因此，研究、发展松江驴的养殖和应用， 具有重要的意义。
[0003] 抗菌肤(Antimicrobial peptides，AMPs)是一类由基因编码、核糖体合成的多肤 类物质，是生物体先天免疫反应的重要组成部分。抗菌肤作为一种新型的抗菌剂，具有广谱 的抗细菌活性、抗真菌、病毒和寄生虫活性，尤其是水产动物来源的抗菌肤，因具有免疫原 性低的特点，可充分发挥药物的优势。
[0004] 化pcidin是一类富含半脫氨酸、具有二硫键结构的多肤，主要在肝脏内表达，为一 类有独特性质的抗菌肤，研究发现，胎pcidin在体内除了和其它抗菌肤一样参与宿主的天 然防御功能外，它作为一种新发现的炎症急性反应蛋白，是铁代谢重要的负性调节素，在固 有免疫、慢性炎症性贫血、血色病等与铁代谢相关性疾病中发挥重要作用。
[0005] 鱼源抗菌肤化pcidin最早在2002年由化ike等从杂交斑纹驴鱼的觸中分离到。与 其它抗菌肤的应用研究类似，鱼源抗菌肤面临一些亟待解决的问题，例如在体内易失活、易 受蛋白酶降解且合成费用昂贵等。因此迄今为止，研究较为成熟的抗菌肤主要来源于昆虫 和哺乳类动物，且主要应用于畜禽养殖业，几乎未见抗菌肤、尤其是水产动物来源的抗菌 肤在水产养殖中的应用报道。因此，基于松江驴独特的生物学和生态生理学特点，如果能够 获得松江驴Tf-Hepcidin基因的全长序列，并由此获得一种性质稳定且能够应用于水产养 殖中的鱼源抗菌肤运对于本领域而言将具有的深远意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种松江驴Tf-胎pcidin基因的cDNA全长序列，由其通过 酵母真核表达系统表达得到的松江驴Tf-胎pcidin成熟肤蛋白及其应用。
[0007] 本发明的一方面提供了一种松江驴Tf-胎pcidin基因，其序列全长为988bp，包含 273bp基因开放阅读框，其核巧酸序列如下：
[000引
12 其中，序列中下划线标示的ATG为起始密码子，下划线标示的TGA为终止密码子，双 下划线示出的AATAAA为加尾信号。 2 本发明的另一方面提供了一种利用上述技术方案所述的松江驴Tf-化pcidin基 因编码的蛋白，包括90个氨基酸，其氨基酸序列如下：
[0011：
[0012] 其中，1-24位氨基酸为信号肤，25-64位氨基酸为前肤，65-90位氨基酸为成熟肤。
[0013] 本发明的再一方面提供了一种松江驴Tf-Hepcidin成熟肤蛋白，由上述技术方案 所述的松江驴Tf-Hepcidin基因通过酵母真核表达系统表达得到。在该技术方案中，所采用 的真核表达菌株为毕赤酵母Pichia pastoris GS115,表达载体为pPICZaA。运里需要说明 的是，本发明所提供的松江驴Tf-化pcidin成熟肤蛋白是松江驴Tf-化pcidin基因通过酵母 真核表达系统而非原核表达系统表达得到的，因为由原核表达系统（pet30a)表达的Tf- 化pcidin原前体肤蛋白和成熟肤蛋白均没有活性。
[0014] 本发明的又一方面提供了一种如上述技术方案所述的松江驴Tf-Hepcidin成熟肤 蛋白在制备抗菌组合物中的应用。可W理解的是，该技术方案所提供的松江驴Tf-Hepcidin 成熟肤蛋白可用于制备抗菌组合物，当然，该技术方案并不局限于使用松江驴Tf-Hepcidin 成熟肤蛋白，还可W是使用松江驴Tf-Hepcidin成熟肤蛋白与其它组分的任意混合物来制 备抗菌组合物。其中，该抗菌组合物可W是任一种抗菌产品，也可W是抗菌药物等，本技术 方案中对其具体应用范围不做限定。
[0015] 优选的，所述松江驴Tf-Hepcidin成熟肤蛋白对革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度范 围为5-70iig/mL，对革兰氏阴性菌的最小抑菌浓度范围为30-8化g/mL。
[0016] 具体的，所述革兰氏阳性菌选自金黄色葡萄球菌S.aureus、苏云金芽抱杆菌 8.1：11111'；[叫1日]1313、枯草芽抱杆菌8.311131：；[113和巨大芽抱杆菌8.111日邑日1日1'；[111]1中的至少一种， 其中，所述松江驴Tf-胎pcidin成熟肤蛋白对巨大芽抱杆菌B.megaterium的最小抑菌浓度 为如g/mL，对枯草芽抱杆菌B. subtil is的最小抑菌浓度为扣g/mL，对金黄色葡萄球菌 S.aureus的最小抑菌浓度为50]ig/mL，对苏云金芽抱杆菌B. thuringiensis的最小抑菌浓度 为 70]ig/mL。
[0017]具体的，所述革兰氏阴性菌选自大肠杆菌E. coli、媛弧菌V.anguillarum、肺炎克 雷伯氏菌K. pneumoniae和绿脈杆菌P. aeruginosa中的至少一种，其中，所述松江驴Tf- Hepcidin成熟肤蛋白对大肠杆菌E.coli的最小抑菌浓度为80iig/mL，对媛弧菌 V.anguillarum的最小抑菌浓度为65]ig/mL，对肺炎克雷伯氏菌K. pneumoniae的最小抑菌浓 度为30]ig/mL，对绿脈杆菌P. aeruginosa的最小抑菌浓度为60]ig/mL。
[0018] 本发明的又一方面提供了一种所述的松江驴Tf-Hepcidin成熟肤蛋白在制备鱼饲 料添加剂中的应用。
[0019] 本发明通过松江驴Tf-Hepcidin基因的获得，填补了松江驴Tf-Hepcidin基因研究 的空缺。同时，根据松江驴Tf-Hepcidin基因序列可W人工合成或转基因生物合成具有生物 活性的重组蛋白，有助于我们了解松江驴Tf-胎pcidin基因的基因组结构，分析该基因的表 达和蛋白的功能。此外，发明人通过松江驴Tf-Hepcidin基因序列还构建得到了松江驴Tf- 化pcidin成熟肤蛋白，可作为鱼饲料的添加剂，有效运用到水产养殖中。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明实施例2所提供的液体抑菌曲线示意图；
[0021] 图2为本发明实施例3所提供的松江驴Tf-Hepcidin成熟肤蛋白糖结合定量表，其 中，试验所得数值为3次重复试验平均值；
[0022] 图3为本发明实施例4所提供的分别注射媛弧菌、媛弧菌+松江驴Tf-Hepcidin成熟 肤蛋白后的經鱼死亡率示意图。
【具体实施方式】
[0023] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施 例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范 围。
[0024] 实施例1:松江驴Tf-H邱cidin基因的克隆W及cDNA全长序列的获得：
[0025] 首先，利用媛弧菌及脂多糖化PS)感染松江驴2小时后，取松江驴肝、觸、胃、肠、脾、 肾、皮、脑等多个组织构建松江驴cDNA全长序列文库，通过随机挑选单克隆测序获得Tf- 化pcidin基因片段信息及单克隆菌株(载体pDNR-LIB)，随后，提取质粒WPCR引物M13-47和 RV-M进行PCR获得完整的Tf-胎pcidin基因的cDNA全长序列。其中：
[0026] PCR引物：
[0027] Ml3-47：GAGCGGATAACAATTTCACACAGG；
[0028] RV-M：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC；
[0029] PCR反应条件：
[0030] 94 °C 预变性 5min，94°C 变性 45s，56 °C 复性 45s，72 °C 延伸 30s，35 个循环，72 °C 总延 伸lOmin，得到序列表中所示的松江驴Tf-Hepcidin基因的cDNA全长序列，并对其进行编码， 得到相应的氨基酸序列。预测蛋白分子9996.7化，理论等电点(pi)为8.42。
[0031] 实施例2:抑菌活性检测
[0032] 本实施例通过管碟法(牛津杯法)检测纯化后的松江驴Tf-Hepcidin成熟肤蛋 白是否具有抑菌活性。
[0033] 选取4种革兰氏阴性菌:大肠杆菌E.coliJ曼弧菌V.anguillarum、肺炎克雷伯氏菌 K. pneumoniae、绿脈杆菌P. aeruginosa和4种革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌S. aureus、苏 云金芽抱杆菌8.1：11111'；[叫1日]1313、巨大芽抱杆菌8.111日旨日1日1'；[11111、枯草芽抱杆菌8.311131：；[113进 行抑菌实验。
[0034] 首先在固体平板上挑取各细菌的单菌落接种于3mL液体培养基中37°C(媛弧菌28 °C)培养，当细菌长到对数生长期时，取50化均匀涂布于LB固体培养基表面，然后放置3个灭 菌的牛津杯，牛津杯中分别加入纯化的松江驴Tf-Hepcidin成熟肤蛋白、卡那霉素作为阳性 对照、BSA作为阴性对照，培养1-2天，观察抑菌结果。
[0035] 本实施例还通过液体抑菌来检测松江驴Tf-Hepcidin成熟肤蛋白对各种细菌的最 小抑菌浓度。将通过管碟法测得有抑菌效果的细菌进行培养，用PBS将菌体洗3次，然后重悬 于灭菌后的LB培养基中，并将浓度调至2 X106个/mL，取细菌51化L和90化的不同浓度的松 江食卢Tf-Hepcidin成熟肤蛋白混合均匀，按照每孔加2(K)化加入96孔板中，每次实验重复S 次，对照组有无菌的LB培养基组和PBS代替重组蛋白组，37°C解育lOh，每隔一小时用酶标仪 测量OD630值。需要特别注意的是，操作过程中要避免细菌污染，操作过程在无菌工作台里进 行。最小抑菌浓度即为各菌株的生长完全被抑制时的蛋白浓度。液体抑菌测得的松江驴Tf- 化pcidin成熟肤蛋白对各种细菌的最小抑菌浓度见表1，并且如图1所示，给出了 W枯草芽 抱杆菌(B.subtilis)为代表的革兰氏阳性菌和W媛弧菌(V.anguillarum)为代表的革兰氏 阴性菌的液体抑菌曲线。
[0036] 表1Tf-Hepcidin蛋白对各细菌的最小抑菌浓度
[0037]
[
[0039] 由此可见，本发明上述实施例提供的松江驴Tf-Hepcidin成熟肤蛋白抑菌活性显 著，可有效添加到抗菌组合物中起到抑菌作用。
[0040] 实施例3:糖结合试验
[0041 ]为了探索松江驴Tf-Hepcidin成熟肤蛋白的抑菌模式，通过化ISA检测其是否能与 肤聚糖（peptidoglycans, PGN)、脂多糖（lipopolysaccha;rides,LPS)、脂憐壁酸 (lipoteichoic acid,LTA)等病原相关模式分子结合。
[0042] 分别称取Img LTA、LPS和PGN，溶于20化1双蒸水中配成母液(多糖20%功率，2X3s 超声破碎后即可溶于水），然后吸16iil母液加入到98化1双蒸水中配成80iig/ml溶液备用。
[0043] 糖结合试验具体步骤如下：
[0044] (1)包板:在96孔板中加入50化多糖，并置于25°C恒溫培养箱中过夜惊干(注意：该 96孔板为高亲和性的）。
[0045] (2)固定:次日清晨，60°C解育30min。
[0046] (3)封闭：每孔加入200化含5%的脱脂奶粉的PBS，37°C封闭化。
[0047] (4)洗板:倒掉封闭液，每孔加入200化的PBST (20 % Tween-80: PBS = 1:100)洗4次， 每次5min。
[0048] (5)蛋白结合:每孔加入50化的蛋白（蛋白用含1 %脱脂奶粉的PBS二倍梯度稀释， 对照组加入50化BSA，室溫下解育化。
[0049] (6)洗板:倒掉蛋白，每孔加入200化的PBST(20%Tween-80:PBS=l:100)洗4次，每 次5min。
[(K)加](7)加一抗:将Tf-Hepcidin的抗体按照1:300的比例稀释于含1%脱脂奶粉的PBS 中，每孔加入10化L，室溫条件下反应1-化。
[0051 ] (8)洗板:倒掉一抗，每孔加入200化的PBST( 20 % Tween-80: PBS= 1:100)洗4次，每 次5min。
[0052] (9)加二抗:将辣根过氧化物酶标记羊抗兔(二抗)按照1:2000的比例稀释于含1% 脱脂奶粉的PBS中，每孔加入10化L，室溫条件下反应化。
[0053] (10)洗板：倒掉二抗，每孔加入200化的PBST( 20 % Tween-80: PBS= 1:100)洗4次， 每次5min。
[0化4] (11)显色：按照上海生工IL-TMB显色试剂盒说明书进行显色，37°C条件下显色5- lOmin，酶标仪450nm处读取吸光值。
[0055] 结果可见，本实施例用化ISA法对巧巾糖：肤聚糖(peptidoglycans，PGN)、脂多糖 (lipopolysaccharides ,LPS)、脂憐壁酸（lipoteichoic acid,LTA)进行糖的直接结合实 验，结果如图2所示，糖结合实验表明：松江驴Tf-Hepcidin成熟肤蛋白可W和W上S种糖特 异性结合，并且随着蛋白浓度的增加结合能力呈现出饱和性。运说明松江驴Tf-化pcidin蛋 白可作为模式识别受体发挥作用，在运种情况下，动物蛋白可通过糖结合等识别致病菌，从 而介导下游的免疫效应作用，例如凝集、固化、诱导吞隧作用、激活补体、激活血小板、加强 自然杀伤细胞活性。
[0056] 实施例4:细菌感染试验
[0057] 将媛弧菌在28°C溫度下振荡培养并转培养至对数生长期后，用TBS洗涂2次后重悬 至1 %体积。将个体大小相似的經鱼(Cyprinus carpio)饲养于充气的淡水中，室溫下适应 一周后进行试验。实验經鱼平行分为3组，分别注射媛弧菌、0.65%化C1溶液（阴性对照）、松 江食卢Tf-Hepcidin成熟肤蛋白（0.8mg/ml)+媛弧菌（1:1混合），每12小时统计死亡率，直至96 小时。
[005引结果如图3所示，媛弧菌刺激后松江驴Tf-Hepcidin成熟肤蛋白在松江驴体内的免 疫作用实验表明，相比于只注射媛弧菌组，注射媛弧菌+松江驴Tf-Hepcidin成熟肤蛋白组 在96小时内的致死率相比降低到30 %。由于0.65 %NaCl溶液为阴性对照，没有死亡，因此图 3中未示出该条曲线。
[0059]可W理解的是，媛弧菌是条件致病菌，当水产养殖动物在不良的环境条件下，遭遇 不利刺激或是受伤时，媛弧菌会诱发水产养殖动物疾病的发生。但结合实施例4所给出的细 菌感染试验可知，在向媛弧菌中加入松江驴Tf-Hepcidin成熟肤蛋白后，可明显降低經鱼在 96小时内的致死率，因此，可将松江驴Tf-Hepcidin成熟肤蛋白作为添加剂加入到鱼饲料 中，作为鱼饲料投喂水产动物时，不仅可降低其致死率，而且结合上述实施例可知，松江食卢 Tf-Hepcidin成熟肤蛋白还具有免疫识别效应，因此还可提高水产养殖动物的免疫能力。
【主权项】
1. 一种松江鲈Tf-Hepcidin基因，其特征在于，其序列全长为988bp，包含273bp基因开 放阅读框，其核苷酸序列如下：其中，序列中下划线标示的ATG为起始密码子，下划线标示的TGA为终止密码子，双下划 线示出的AATAAA为加尾信号。2. -种利用如权利要求1所述的松江鲈Tf-Hepcidin基因编码的蛋白，其特征在于，包 括90个氨基酸，其氨基酸序列如下：其中，1-24位氨基酸为信号肽，25-64位氨基酸为前肽，65-90位氨基酸为成熟肽。3. -种松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白，其特征在于，由权利要求1所述的松江鲈Tf-Hepcidin基因通过酵母真核表达系统表达得到。4. 根据权利要求3所述的松江f卢Tf-Hepcidin成熟肽蛋白，其特征在于，所述酵母真核 表达系统中所采用的真核表达菌株为毕赤酵母Pichia pastoris GS115,表达载体为pPICZ aA〇5. -种如权利要求3所述的松江f卢Tf-Hepcidin成熟肽蛋白在制备抗菌组合物中的应 用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白对革 兰氏阳性菌的最小抑菌浓度范围为5-70yg/mL，对革兰氏阴性菌的最小抑菌浓度范围为30- 80iig/mL〇7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阳性菌选自金黄色葡萄球菌 S. aureus、苏云金芽孢杆菌B. thuringiensis、枯草芽孢杆菌B. subtil is和巨大芽孢杆菌 B.megaterium中的至少一种，其中，所述松江解Tf-Hepcidin成熟肽蛋白对巨大芽孢杆菌 B.megaterium的最小抑菌浓度为8yg/mL，对枯草芽孢杆菌B. 811131:;[118的最小抑菌浓度为511 g/mL，对金黄色葡萄球菌S.aureus的最小抑菌浓度为50yg/mL，对苏云金芽孢杆菌 B. thuringiensis的最小抑菌浓度为70iig/mL〇8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌选自大肠杆菌E.coli、 暢弧菌V ? angui 1 larum、肺炎克雷伯氏菌K ? pneumoniae和绿胺杆菌P ? aeruginosa中的至少 一种，其中，所述松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白对大肠杆菌E.coli的最小抑菌浓度为80y g/mL，对暢弧菌V.anguillarum的最小抑菌浓度为65yg/mL，对肺炎克雷伯氏菌 K. pneumoniae的最小抑菌浓度为30iig/mL，对绿脓杆菌P. aeruginosa的最小抑菌浓度为60ii g/mL〇9. 一种如权利要求3所述的松江f卢Tf-Hepcidin成熟肽蛋白在制备鱼饲料添加剂中的 应用。
【文档编号】A61K38/17GK106047883SQ201610369487
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】刘莹莹, 韩晓弟, 于珊珊, 陈学昭, 柴迎梅, 张雷, 祝茜
【申请人】山东大学（威海）