CNUSMXY1蛋白及其在培育抗虫植物中的应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及cnusmxy1蛋白及其在培育抗虫植物中的应用。
背景技术：
：植物抗性是指植物适应逆境(如冻害、高温、病虫、淹水、干旱等)的能力。挖掘和开发抗性相关的基因对于农业生产具有重大的科学意义。甜菜夜蛾(beetarmyworm)学名spodopteraexiguahiibner俗称白菜褐夜蛾，隶属于鳞翅目、夜蛾科，是一种世界性分布、间歇性大发生的以危害蔬菜为主的杂食性害虫。对大葱、甘蓝、大白菜、芹菜、菜花、胡萝卜、芦笋、蕹菜、苋菜、辣椒、豇豆、花椰菜、茄子、芥兰、番茄、菜心、小白菜、青花菜、菠菜、萝卜等蔬菜都有危害。技术实现要素：本发明的目的是提供cnusmxy1蛋白及其在培育抗虫植物中的应用。本发明提供的蛋白质，获自哥伦比亚生态型拟南芥蛋白质，命名为cnusmxy1蛋白，是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗虫性相关的由序列1衍生的蛋白质。(c)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗菌性相关的由序列1衍生的蛋白质。为了使(b)或(c)中的蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述(b)或(c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)或(c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码cnusmxy1蛋白的基因(命名为cnusmxy1基因)也属于本发明的保护范围。所述基因具体可为如下1)或2)或3)或4)或5)的dna分子：1)编码区如序列表中序列2所示的dna分子；2)在严格条件下与1)限定的dna序列杂交且编码植物抗虫性相关蛋白的dna分子；3)与1)或2)限定的dna序列具有90％以上同源性且编码植物抗虫性相关蛋白的dna分子；4)在严格条件下与1)限定的dna序列杂交且编码植物抗菌性相关蛋白的dna分子；5)与1)或2)限定的dna序列具有90％以上同源性且编码植物抗菌性相关蛋白的dna分子。上述严格条件可为用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna杂交实验中65℃下杂交并洗膜。含有cnusmxy1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织或重组菌均属于本发明的保护范围。可用现有的表达载体构建含有cnusmxy1基因的重组表达载体。所述表达载体包括双元农杆菌载体和可用于微弹轰击的载体等。使用cnusmxy1基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用cnusmxy1基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物或转基因微生物进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入在植物或微生物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植物或微生物。所述重组表达载体具体可为重组质粒pcambia1300-cnusmxy1。重组质粒pcambia1300-cnusmxy1为将序列表的序列2所示的双链dna分子插入载体pcambia1300-35s-3ha的多克隆位点(例如sali和spei酶切位点之间)得到的重组质粒。本发明还保护cnusmxy1蛋白的应用，为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)中的至少一种：(d1)调控植物的抗虫性；(d2)提高植物的抗虫性；(d3)调控植物的抗菌性；(d4)降低植物的抗菌性。以上任一所述抗虫性具体可为对夜蛾的抗性，更具体可为对甜菜夜蛾的抗性。以上任一所述抗菌性可为对细菌的抗性，更具体可为对丁香假单胞菌的抗性，更具体可为对丁香假单胞菌pstdc3000的抗性。以上任一所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为十字花科植物，更具体可为拟南芥，更具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将cnusmxy1基因导入目的植物中，得到抗虫性高于目的植物的转基因植物。所述抗虫性具体可为对夜蛾的抗性，更具体可为对甜菜夜蛾的抗性。所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为十字花科植物，更具体可为拟南芥，更具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。所述cnusmxy1基因具体可通过以上任一所述重组表达载体导入所述目的植物。携带有cnusmxy1基因的重组表达载体可通过ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到目的植物中。本发明还保护一种植物育种方法，是提高目的植物中cnusmxy1蛋白的含量和/或活性，从而提高目的植物的抗虫性。所述抗虫性具体可为对夜蛾的抗性，更具体可为对甜菜夜蛾的抗性。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为十字花科植物，更具体可为拟南芥，更具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将cnusmxy1基因导入目的植物中，得到抗菌性低于目的植物的转基因植物。所述抗菌性可为对细菌的抗性，更具体可为对丁香假单胞菌的抗性，更具体可为对丁香假单胞菌pstdc3000的抗性。所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为十字花科植物，更具体可为拟南芥，更具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。所述cnusmxy1基因具体可通过以上任一所述重组表达载体导入所述目的植物。携带有cnusmxy1基因的重组表达载体可通过ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到目的植物中。本发明还保护一种植物育种方法，是提高目的植物中cnusmxy1蛋白的含量和/或活性，从而降低目的植物的抗菌性。所述抗菌性可为对细菌的抗性，更具体可为对丁香假单胞菌的抗性，更具体可为对丁香假单胞菌pstdc3000的抗性。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为十字花科植物，更具体可为拟南芥，更具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。本发明还保护cnusmxy1蛋白、cnusmxy1基因、以上任一所述重组表达载体或以上任一所述方法在植物育种中的应用。所述植物育种的目的为培育抗虫植物。所述抗虫具体可抗夜蛾，更具体可为抗甜菜夜蛾。所述植物育种的目的为培育抗菌植物。所述抗菌可为抗细菌，更具体可为抗丁香假单胞菌，更具体可为抗丁香假单胞菌pstdc3000。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。本发明提供了cnusmxy1蛋白以及cnusmxy1基因。过表达cnusmxy1基因使得植物对的抗虫性增强。本发明有助于促进人们对植物抗性的研究，有助于培育抗虫植物。本发明在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。附图说明图1为重组质粒pcambia1300-cnusmxy1部分元件的示意图。图2为相对表达水平、抗虫性鉴定和抗菌性鉴定的结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。哥伦比亚生态型拟南芥用col-0表示。cnusmxy1蛋白是本发明的发明人从哥伦比亚生态型拟南芥中发现的新蛋白，如序列表的序列1所示。编码cnusmxy1蛋白的基因命名为cnusmxy1基因，其cdna中的开放阅读框如序列表的序列2所示。提及载体pcambia1300-35s-3ha的文献：tworedundantreceptor-likecytoplasmickinasesfunctiondownstreamofpatternrecognitionreceptorstoregulateactivationofsabiosynthesis1；qingkong,tongjunsun,naqu,junlingma,mengli,yu-ticheng,qianzhang,diwu,zhibinzhang,yuelinzhang；plantphysiol.vol.171,2016,1344-1354。提及甜菜夜蛾的文献：thebhlhsubgroupiiidfactorsnegativelyregulatejasmonate-mediatedplantdefenseanddevelopment.songs,qit,fanm,zhangx,gaoh,huangh,wud,guoh,xied.plosgenet.2013；9(7):e1003653.doi:10.1371/journal.pgen.1003653.epub2013jul25。提及丁香假单胞菌pstdc3000(pseudomonassyringaepv.tomatodc3000)的文献：pseudomonassyringaepv.tomatodc3000:amodelpathogenforprobingdiseasesusceptibilityandhormonesignalinginplants.xinxf,hesy.annurevphytopathol.2013；51:473-98.doi:10.1146/annurev-phyto-082712-102321.epub2013may31.review。实施例1、转基因植物的获得和鉴定一、重组表达载体的构建1、合成序列表的序列2所示的双链dna分子。2、以步骤1合成的dna分子为模板，采用f1和r1组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。f1：5’-acgcgtcgacatgattaataccgacgataacttattg-3’；r1：5’-cggactagttcagctaattttcgacatcaacaaatc-3’。3、取步骤2得到的pcr扩增产物，采用限制新内切酶sali和spei进行双酶切，回收酶切产物。4、取载体pcambia1300-35s-3ha，采用限制新内切酶sali和spei进行双酶切，回收载体骨架。5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pcambia1300-cnusmxy1(部分元件的示意图见图1)。根据测序结果，对重组质粒pcambia1300-cnusmxy1进行结构描述如下：在载体pcambia1300-35s-3ha的sali和spei酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链dna分子。二、转基因植物的获得1、将重组质粒pcambia1300-cnusmxy1导入农杆菌gv3101，得到重组农杆菌。2、采用蘸花法，用步骤1得到的重组农杆菌侵染哥伦比亚生态型拟南芥，然后正常管理并收获种子，即为t1代种子。3、将t1代种子播种于含20mg/l潮霉素的固体ms培养基上，然后正常管理，得到t1代植株。4、分别将各个t1代植株进行pcr鉴定。具体方法：提取基因组dna作为模板，采用f2和r2组成的引物对进行pcr扩增，如果得到约1685bp的扩增产物，鉴定结果为阳性，该t1代植株为转基因植株。f2：5’-agaagacgttccaaccacgtc-3’；r2：5’-tcagctaattttcgacatcaacaaatc-3’。f2对应载体骨架上的35s启动子。5、取步骤4得到的转基因植株，进行实时定量pcr。具体方法：提取总rna并反转录为cdna,将cdna作为模板，采用f3和r3组成的引物对进行实时定量pcr。f3：5’-aacgtgaagatggggttgag-3’；r3：5’-tcgacatcaacaaatccctaag-3’。获得转基因植物叶片中cnusmxy1基因的相对表达量和同期哥伦比亚生态型拟南芥叶片中cnusmxy1基因的相对表达量。相对表达水平＝转基因植株叶片中的cnusmxy1基因的相对表达量÷哥伦比亚生态型拟南芥叶片中的cnusmxy1基因的相对表达量。36株转基因植株的相对表达水平为40以上。采用该36株转基因植株进行步骤四。哥伦比亚生态型拟南芥和一株转基因植株的结果见图2a。三、转空载体植物的获得用载体pcambia1300-35s-3ha代替重组质粒pcambia1300-cnusmxy1，其他同步骤二，获得30株转空载体植株。四、抗虫性鉴定将步骤二获得的18株转基因植株、步骤三获得的15株转空载体植株和15株哥伦比亚生态型拟南芥分别作为待测植株。将萌发5周的待测植株转移至装有栽培基质的花盆中，每个花盆一株，然后将刚孵化出的甜菜夜蛾幼虫放在植株的叶片上(每个植株放置10个甜菜夜蛾幼虫)，正常管理，6天后取植株上的甜菜夜蛾幼虫并称重。结果见图2b，纵坐标为单个幼虫重量(平均值)。与哥伦比亚生态型拟南芥上的甜菜夜蛾幼虫相比，转空载体植株上的甜菜夜蛾幼虫重量没有显著差异。与哥伦比亚生态型拟南芥上的甜菜夜蛾幼虫相比，转基因植株上的甜菜夜蛾幼虫重量更低。结果表明，与哥伦比亚生态型拟南芥上的甜菜夜蛾幼虫相比，转基因植株上的甜菜夜蛾幼虫生长更为缓慢，即过表达cnusmxy1基因可以增加植物对甜菜夜蛾的抗性。五、抗菌性鉴定将步骤二获得的18株转基因植株、步骤三获得的15株转空载体植株和15株哥伦比亚生态型拟南芥分别作为待测植株。将萌发5周的待测植株转移至装有栽培基质的花盆中，每个花盆一株，然后注射丁香假单胞菌pstdc3000(每个植株对2-3个叶片进行注射，每个叶片注射50-100微升菌液，菌液中丁香假单胞菌pstdc3000的浓度为105cfu/ml)，正常管理，4天后取注射丁香假单胞菌pstdc3000的叶片区域，测量表面积，然后通过平板稀释法检测本叶片中丁香假单胞菌pstdc3000的含量。结果见图2c，纵坐标为每平方厘米本叶片中丁香假单胞菌pstdc3000的cfu数量以10为底的对数值(平均值)。与哥伦比亚生态型拟南芥相比，转空载体植株的发病表型无差异，单位面积的叶片中丁香假单胞菌pstdc3000的含量无显著差异。与哥伦比亚生态型拟南芥相比，转基因植株的发病表型更严重，单位面积的叶片中丁香假单胞菌pstdc3000的含量显著增高结果表明，过表达cnusmxy1基因降低了植物对丁香假单胞菌的抗性。sequencelisting<110>首都师范大学<120>cnusmxy1蛋白及其在培育抗虫植物中的应用<130>gncyx171406<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>511<212>prt<213>拟南芥（arabidopsisthaliana）<400>1metileasnthraspaspasnleuleumetileglualaleuleuthr151015seraspproserproproleuleuproalaasnleuserleugluthr202530thrleuprolysargleuhisalavalleuasnglythrhisglupro354045trpsertyralailephetrplysprosertyraspaspphesergly505560glualavalleulystrpglyaspglyvaltyrthrglyglyasnglu65707580glulysthrargglyargleuargarglyslysthrileleuserser859095progluglulysgluargargserasnvalilearggluleuasnleu100105110metileserglyglualapheprovalvalgluaspaspvalserasp115120125aspaspaspvalgluvalthraspmetglutrpphepheleuvalser130135140metthrtrpserpheglyasnglyserglyleualaglylysalaphe145150155160alasertyrasnprovalleuvalthrglyseraspleuiletyrgly165170175serglycysaspargalalysglnglyglyaspvalglyleuglnthr180185190ileleucysileproserhisasnglyvalleugluleualaserthr195200205glugluileargproasnseraspleupheasnargileargpheleu210215220pheglyglyserlystyrpheserglyalaproasnserasnserglu225230235240leuphepropheglnleuglusersercysserserthrvalthrgly245250255asnproasnproserprovaltyrleuglnasnargtyrasnleuasn260265270pheserthrserserserthrleualaargalaprocysglyaspval275280285leuserpheglygluasnvallysglnserphegluasnargasnpro290295300asnthrtyrseraspglnileglnasnvalvalprohisalathrval305310315320metleuglulyslyslysglylyslysargglyarglysproalahis325330335glyargasplysproleuasnhisvalglualagluargmetargarg340345350glulysleuasnhisargphetyralaleuargalavalvalproasn355360365valserlysmetasplysthrserleuleugluaspalavalcystyr370375380ileasngluleulysserlysalagluasnvalgluleuglulyshis385390395400alailegluileglnpheasngluleulysgluilealaglyglnarg405410415asnalaileproservalcyslystyrgluglulysalaserglumet420425430metlysilegluvallysilemetgluseraspaspalametvalarg435440445valgluserarglysasphishisproglyalaargleumetasnala450455460leumetaspleugluleugluvalasnhisalaserileservalmet465470475480asnaspleumetileglnglnalaasnvallysmetglyleuargile485490495tyrlysglnglugluleuargaspleuleumetserlysileser500505510<210>2<211>1536<212>dna<213>拟南芥（arabidopsisthaliana）<400>2atgattaataccgacgataacttattgatgatcgaagctctcttgacctccgatccgtcg60ccaccattacttccggcgaatctcagcctcgagactactctcccgaagcgtttacatgct120gtgttgaatggaacccacgagccctggagttacgccattttctggaaaccgtcgtacgat180gacttttccggtgaagcagttctcaaatggggcgacggagtttacactggtggcaacgag240gaaaagacacgagggaggttgaggaggaagaagacgattctgtcgtctccggaggagaaa300gagcgtcggagtaatgttattcgggagcttaacttgatgatctccggcgaagcgtttccg360gtggttgaagacgacgtcagtgatgacgatgacgtggaagtgacggatatggagtggttc420ttcttggtttccatgacgtggagttttggtaacggatccgggttagcgggtaaggcgttt480gctagctataacccggttttggttaccggttcggatctgatttacgggtcgggttgtgat540cgggctaaacaaggaggggatgtagggttacagaccatcttgtgtattccttcacataac600ggagtgttggagcttgcatccacggaggagatccgaccaaattcggatctttttaatagg660atccggtttctttttggaggatccaaatatttttctggagccccgaattcgaactcggag720cttttcccatttcagttagagagcagttgttcaagtactgtaaccggtaacccgaatcct780agtccggtttatctacagaaccggtataatttgaacttctcgacgtcatcttccacattg840gcgagagctccatgcggcgatgtactgagttttggcgagaatgttaaacagagttttgaa900aatcggaaccctaatacttattctgatcagattcaaaacgtcgtccctcacgcgacggtg960atgctggagaagaagaagggaaaaaagcgcgggagaaaaccggcgcatggtagagacaag1020cctttgaaccacgtggaagcagagaggatgagacgtgagaagctaaaccacagattctac1080gcattacgagcggttgtaccaaacgtatcgaaaatggacaaaacgtcgttgctcgaagac1140gcggtttgttacataaacgagctgaaatcaaaagctgaaaacgttgaattggagaaacat1200gcgattgagattcagttcaatgaactcaaggagattgcaggacaacgaaacgcaattcct1260agcgtttgtaaatacgaggaaaaggcatcagagatgatgaagatcgaagtgaagattatg1320gaaagtgatgatgcaatggttagagttgaatcaaggaaggatcatcatccaggagcgaga1380ttgatgaatgctttgatggatttggagttagaagtgaatcatgcgagcatttctgtgatg1440aacgatcttatgatacaacaagcgaacgtgaagatggggttgagaatctacaagcaggaa1500gagcttagggatttgttgatgtcgaaaattagctga1536当前第1页12