检测dm致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属分子生物学技术领域，设及检测DM致病基因突变的方法，及其引物、试 剂盒。
【背景技术】
[0002] DM(myotonicdystro地y)基因位于19号染色体长臂（19ql3. 3)，基因组跨度为 14化，含15个外显子，编码582个氨基酸残基组成萎缩性肌强直蛋白激酶（dystrophia myotonicaproteinkinase,DMPK)。现有研究成果提示，DM基因发生突变时将导致一组W 肌无力、肌强直和肌萎缩为特点的多系统受累的常染色体显性遗传病，发病率为1/8000。
[0003] 现有的检测DM的致病基因技术主要是基于单个突变位点的PCR和测序方法及单 基因忍片方法，显著缺点主要在于仅仅能检测单个突变位点，不能对多个突变位点进行同 时检测，也不能对分布于多个外显子的位点进行同时检测。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服上述不足，提供一种检测DM致病基因突变的方法，其解决 了现有技术中进行DM致病基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和灵敏度低等 问题。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种检测DM致病基因突变的方 法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其包括如下实现步骤：
[0006] 样本处理：取外周血2ml于邸TA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4°C保存；
[0007]DNA提取，取220μ1抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
[000引 1)加220μ1BufferBL，震荡混合，于70°C解育10分钟；
[000引。加220μ1无水乙醇震荡混合约20秒；
[0010] 扣12000巧m离屯、1分钟；
[0011] 4)取上清转入收集柱中，1200化pm离屯、2分钟；
[0012] 5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μ1皿solution,室溫放置5分钟；
[0013] 6) 12000巧m离屯、2分钟；
[0014] 7)加入 700μ1washBuffer, 12000巧m离屯、2 分钟；
[0015] 8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μ1washBuffer, 12000巧m离屯、2分 钟；
[0016] 9)弃收集管内液体，12000巧m离屯、2min;
[0017] 10)将收集柱放入一个新的1. 5ml离屯、管内，加入50μ1 70°C预热的洗脱液，室 溫放置l-2min，12000巧m离屯、2分钟，滤液即为模板DNA;
[001引PCR扩增 [001引PCR反应体系：
[0020] 10XPCRBuffer2μ1 ；
[0021] HotStarTaqDMPolymerase按kit标准调整；
[0022] dNTPmix 2μ1 ;
[0023] 上游引物PrimerU1μ1 ；
[0024] 下游引物PrimerL1μ1 ;
[00巧]DM模板 Xμ1 ;
[0026] 灭菌蒸馈水 20μ1 上述总体积；
[0027] PCR产物电泳：1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
[0028] PCR产物纯化
[0029] 每管内加入100μ1PCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000巧m离屯、2min;
[0030] 弃收集管内液体，加入 700μ 1 washingbuffer, 12000巧m 离屯、2min;
[0031] 弃收集管内液体，加入 400μ 1 washingbuffer, 12000巧m 离屯、2min;
[003引 弃收集管内液体，12000巧m离屯、2min;
[003引柱内加入30μ1 70°C预热洗脱液，12000巧m离屯、3min;
[0034] 测序反应
[0035] 反应体系：0. 8μ1Bi曲ye+1.5ylBi曲yeSeqBuffer+3yl引物+1μ1PCR纯 化产物+3. 5μ1 (1地2〇;
[0036] 测序PCR热循环条件：
[0037] 1)变性的条件，96°ClOsec;
[0038] 5)退火的条件，（首先96°ClOsec，其次50°C5sec，然后60°C4min)X25个循环；
[0039] 6)延伸的条件，60°C4min;
[0040] 7)4°C保溫；
[0041] 每一步的时间应从反应混合液达到所要求的溫度后开始计算；
[0042] 测序产物纯化
[0043] 10μ1反应体系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法；
[0044] 1)每管加入100μΙ100%酒精，或每管加入1μ1 125mM邸TA到管底，或每管加 入1μ1 3MNaAc到管底，然后震荡混匀，室溫放置15min;
[0045] 2) 10°C，4000巧m离屯、30min，马上倒置，1200巧m离屯、Imin;
[0046] 3)每管加入100μl70%酒精，离屯、15min;5°C，3600巧m离屯、30min，马上倒置， 1200巧m离屯、Imin;
[0047] 4)室溫挥发净酒精，加入10μ1Hi-Di化rmamide溶解DM;
[0048] 5) 95°C变性 5min，4°C保溫 4min，加样上机；
[0049] 6)测序纯化：ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit;
[0050] PCR检测，包括：
[0051] 1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对 照和样本均采用复孔.
[0052] 在DM基因突变位点两端设计两对特异性引物；
[0053] 所述引物是DMPK和ZNF-9 ;
[0054] 所述引物DMPK的sense为：
[00巧]5'TTGTAGCCGGGAATGCTG3'，
[0056]所述引物DMPK的antisense为：
[0057] 5' GCACTTTGCGAACCAACG 3',
[005引所述引物ZNF-9的sense为：
[0059]5' TCTCAGTCACCAGGCAAGTG 3'，
[0060]所述引物ZNF-9的antisense为：
[0061] 5'TGGAATTTACAGGGTTAGGGTCA3'；
[0062] 所述引物PCR扩增出目的片段模板；
[006引所述目的片段的获取包括：W上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条 带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-2化g/μL作为检 测阴性对照用；
[0064] 。25μL反应体系检测：
[0065] PremixTaqPC民MaKerIVIIX 12.5μ1 DNA模板 I-lOng/μΙ Primer? 终浓度为400nM PrimerL 终浓度为400nM 灭菌蒸馈水 Upto25μ1
[0066] 混合均匀；所有样本混合完后，将ΑΒΙ Veriti Dx PCR系统仪器中进行程序性检 测；
[0067] 结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
[0068] 本发明的另一目的在于提供一种检测DM致病基因突变的引物，其特征在于，所述 引物序列包括：
[0069]沈Q ID N0:15'TTGTAGCCGGGAATGCTG 3'
[0070] SEQ ID NO:25'GCACTTTGCGAACCAACG 3'
[0071]沈Q ID NO:35'TCTCAGTCACCAGGCAAGTG 3'
[0072] SEQ ID N0:45'TGGAATTTACAGGGTTAGGGTCA3'。
[0073] 本发明的还一目的在于提供包含所述引物的试剂盒。
[0074] 本发明的有益效果为：
[0075] 能对多个突变位点进行同时检测，也能对分布于多个外显子的位点进行同时检 巧。，简单、快速、准确、有效的对强直性肌营养不良两种突变类型进行检测和临床诊断，利用 多种特异性引物同时对患者可能存在的多个突变位点进行检测，使用该方法能保证95% W 上的疾病检出率。解决了现有技术中进行DM致病基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、 易污染和灵敏度低等问题，尤其是提供了病理组织之外的非创伤性如血清或血浆等检测。
【具体实施方式】
[0076]W下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，运些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可W根据具体厂家的条件做 进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
[0077] 实施例1
[0078] 样本处理：取外周血2ml于邸ΤΑ抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4°C保存；
[0079]DNA提取，取220μ1抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
[0080] 1)加 220μ1BufferBL，震荡混合，于 70°C解育 10 分钟；
[0081] 2)加220 μ 1无水乙醇震荡混合约20秒；
[0082] 3) 12000巧m离屯、1 分钟；
[008引4)取上清转入收集柱中，12000巧m离屯、2分钟；
[0084] 5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μ1皿solution,室溫放置5分钟；
[0085] 6) 12000巧m离屯、2 分钟；
[0086] 7)加入 700μ1washBuffer,12000巧m离屯、2 分钟；
[0087] 8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μ1washBuffer,12000巧m离屯、2分 钟；
[0088] 9)弃收集管内液体，12000;rpm离屯、2min;
[0089] 10)将收集柱放入一个新的1. 5ml离屯、管内，加入50μL70°C预热的洗脱液，室 溫放置l-2min，12000巧m离屯、2分钟，滤液即为模板DNA;
[0090]PCR扩增
[00川PCR反应体系：
[0092] 10XPCRBuffer 2μ1;
[0093]HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
[0094]dNTPmix 2μ1 ;
[0095]上游引物PrimerU 1μ1