检测肝糖原累积症Ⅰa型GP6C基因突变的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测肝糖原累积症I a型GP6C基因突变的试剂盒，以及利用该试 剂盒检测肝糖原累积症I a型GP6C基因突变的方法。 (二）
【背景技术】
[0002] 糖原累积症I型又称VonGierke病，简称GSD I，是遗传性肝内葡萄糖-6-磷酸酶 (G6Pase)先天性缺乏而导致糖原分解或合成障碍的常染色体隐性遗传性疾病。G6Pase体 系主要由4个组分组成：葡萄糖-6-磷酸酶-a (G6PC)、葡萄糖-6-磷酸转运体（G6PT1)、无 机磷酸盐转运体（Τ2)、葡萄糖转运体（Τ3)，分别行使葡萄糖-6-磷酸的水解，G6p的转位， 磷酸的运输和葡萄糖运输的功能。根据缺陷的酶的不同将GSD I分为4个亚型：G6PC缺陷 引起GSD I a ;G6PTI缺陷引起GSD I b;磷酸盐转运体缺陷引起GSD I c和葡萄糖转运体 缺陷引起GSD I d。
[0003] 研宄表明，其中GSD I型约占整个糖原累积症的25%，而I型中I a型约占80%， 故GSD I a型是一种相对较为常见的糖原代谢障碍疾病，其活产儿发病率约为十万分之 一。临床表现主要为低血糖、肝脏肿大、高脂血症、高尿酸血症、高乳酸血症等，主要累及肝 脏、肾脏和小肠，在临床上主要问题表现为诊断率低和诊断手段有限。控制GSD I a型的基 因为G6PC，该基因定位于G6Pase基因位于人类的17号染色体长臂2区1带，全长12. 5kb， 包含5个外显子。G6PC蛋白为细胞内质网膜蛋白，包含357个氨基酸，为高度疏水性蛋白， 有9个跨膜单位，其N端位于内质网腔内，C端位于质膜上。目前国内外学者对GSD I a 型的基因型研宄已确定了多种突变，包括错义突变、剪接突变、移码突变、缺失、基因与假基 因融合与基因转化等，具有种族差异性，常见的突变位点为R83C、Q347、R83H、R83C、V338F、 D38V、G68R、IVS3-58T>A、IVS4+10G>A。中国人GP6C基因突变等位基因中以R83H及R83C为 最常见。
[0004] 基因测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A)、胸腺嘧啶（T)、胞 喃啶（C)与鸟嗓呤的（G)排列方式。目前常用的Sanger测序法是Frederick Sanger于 1975年发明的，测序过程需要先做一个聚合酶连锁反应（PCR)。PCR过程中，双脱氧核糖核 苷酸可能随机的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核苷酸又少了一个氧 原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有 可能获得的、不同长度的DNA片段。作为一种新型基因检测技术，基因测序能够从血液或唾 液中分析测定目的基因序列，助力相关遗传病诊断，可以对那些即使没有临床症状的患者， 也可以得到尽早的诊断和治疗，为临床诊治提供科学依据。与患者拥有相同基因型的家族 成员，尽管没有临床症状也应该尽早治疗，而临床症状或生化检查都模棱两可的家族成员， 有可能是杂合子携帯者需加以关注，具有高度特异且精确，低成本，操作简便，快速，高通量 等优点，是国际上公认的检测基因突变的"金标准"。
[0005] 在G6PC基因克隆之前，GSD I a的诊断主要靠临床表现和生化检查，确诊则需要 肝穿刺检测肝标本中G6Pase的活性，对携带者无法进行检查，产前诊断如果对胎儿肝脏进 行活检会给胎儿带来危险。G6PC基因突变检测使得以DNA为基础的基因诊断成为可能，该 方法不仅显著提高了不典型GSD I a型病例的诊断率，也是通过产前诊断从而有效降低该 病发病率的重要手段。同时对患者的同胞进行基因检测将有可能将诊断提前至无症状的临 床前期，因而对于GSD I a型的基因测序检测，具有更准确、更经济、更简便，利于开展，避免 了以往该病的诊断有赖于肝穿刺及活检的诊断方法，更易于被患者接受。 (三）
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种检测肝糖原累积症I a型GP6C基因突变的试剂盒及方法， 用于检测G6PC基因突变位点，特异性好，灵敏度高。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] 检测肝糖原累积症I a型GP6C基因突变的试剂盒，主要包括特异性引物和PCR反 应试剂；
[0009] 所述特异性引物序列如下：
[0010] 外显子Exonl扩增引物：
[0011] 上游引物：5 ' -AGCAATCACCACCAAGC-3 '
[0012] 下游引物：5' -TCCAAAGTCAGAGAGAGGG-3' ；
[0013] 外显子Exon2扩增引物：
[0014] 上游引物：5' -TTCTCAGGCTACACTCTTC-3'
[0015] 下游引物：5' -CGTGCCTCTCTGGAC-3' ；
[0016] 外显子Exon3扩增引物：
[0017] 上游引物：5' -GTGGCTGGGTAGATGATGC-3'
[0018] 下游引物：5' -ACATTCCCTGACTCTGAGGTTTA-3' ；
[0019] 外显子Exon4扩增引物：
[0020] 上游引物：5 ' -CCTGTGTTCTGTTATGGTT-3 '
[0021] 下游引物：5' -AGGATGTGGCTGGAA-3' ；
[0022] 外显子Exon5扩增引物：
[0023] 上游引物：5 ' -CCATCTGCCATCTGTG-3 '
[0024] 下游引物：5 ' -AATAGTAGTCCTCCTCAATCC-3 '。
[0025] 所述PCR反应试剂为本领域常规试剂，主要包括：dNTP、10*PCR缓冲液、双蒸水、 Tag酶等。
[0026] 所述试剂盒还可包括GP6C基因外显子序列标准品，所述标准品序列如下：
[0027] 外显子 Exonl:
[0028] 5 ' -ATGGAGGAAGGAATGAATGTTCTCCATGACTTTGGGATCCAGTCAACACATTACCTCCAGGTGAAT TACCAAGACTCCCAGGACTGGTTCATCTTGGTGTCCGTGATCGCAGACCTCAGGAATGCCTTCTACGTCCTCTTCCC CATCTGGTTCCATCTTCAGGAAGCTGTGGGCATTAAACTCCTTTGGGTAGCTGTGATTGGAGACTGGCTCAACCTCG TCTTTAAGTG-3 ,；
[0029] 外显子 Exon2:
[0030] 5 ' -GATTCTCTTTGGACAGCGTCCATACTGGTGGGTTTTGGATACTGACTACTACAGCAACACTTCCGT GCCCCTGATAAAGCAGTTCCCTGTAACCTGTGAGACTGGACCAG-3 ' ；
[0031] 外显子 Exon3:
[0032] 5，-GGAGCCCCTCTGGCCATGCCATGGGCACAGCAGGTGTATACTACGTGATGGTCACATCTACTCTTT CCATCTTTCAGGGAAAGATAAAGCCGACCTACAGATTTCG-3 ' ；
[0033] 外显子 Exon4:
[0034] 5? -GTGCTTGAATGTCATTTTGTGGTTGGGATTCTGGGCTGTGCAGCTGAATGTCTGTCTGTCACGAAT CTACCTTGCTGCTCATTTTCCTCATCAAGTTGTTGCTGGAGTCCTGTCAG-3 ' ；
[0035] 外显子 Exon5:
[0036] 5 ' -GCATTGCTGTTGCAGAAACTTTCAGCCACATCCACAGCATCTATAATGCCAGCCTCAAGAAATATT TTCTCATTACCTTCTTCCTGTTCAGCTTCGCCATCGGATTTTATCTGCTGCTCAAGGGACTGGGTGTAGACCTCCTG TGGACTCTGGAGAAAGCCCAGAGGTGGTGCGAGCAGCCAGAATGGGTCCACATTGACACCACACCCTTTGCCAGCCT CCTCAAGAACCTGGGCACGCTCTTTGGCCTGGGGCTGGCTCTCAACTCCAGCATGTACAGGGAGAGCTGCAAGGGGA AACTCAGCAAGTGGCTCCCATTCCGCCTCAGCTCTATTGTAGCCTCCCTCGTCCTCCTGCACGTCTTTGACTCCTTG AAACCCCCATCCCAAGTCGAGCTGGTCTTCTACGTCTTGTCCTTCTGCAAGAGTGCGGTAGTGCCCCTGGCATCCGT CAGTGTCATCCCCTACTGCCTCGCCCAGGTCCTGGGCCAGCCGCACAAGAAGTCGTTGTAA-3'。
[0037] PCR及测序所需野生型标准品的制备以Genebank中发布G6PC的基因序列为标准， 以健康体检人的外周血基因组为模板，用上述5对引物扩增出5个特异性的PCR片段，合成 与表1引物一致的野生型质粒，并与G6PC的标准基因序列比对，确认质粒的正确性，作为检 测分析中的标准品。
[0038] 所述的试剂盒在检测肝糖原累积症I a型GP6C基因突变中的应用。
[0039] 具体的，所述应用方法如下：
[0040] (1)采集待测血液样本，提取DNA ;
[0041] ⑵以样品DNA为模板，加入所述特异性引物和PCR反应试剂，组成PCR反应体系， 进行PCR扩增；
[0042] (3)步骤（2)得到的PCR反应产物进行进一步的测序，依据单基因遗传病基因突变 数据库或者对照标准品序列进行分析，确定是否肝糖原累积症I a型致病突变