一种用于动物组织基因组dna和rna快速提取试剂盒及提取方法和应用

一种用于动物组织基因组dna和rna快速提取试剂盒及提取方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于动物组织基因组DNA和RNA快速提取试剂盒及提取方法和应 用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 分子生物学研宄中提取纯化DNA和RNA是分子试验的第一步，各种临床检测或科 研中均需要提取纯化DNA和RNA。目前，国内外已有多种基于PCR、RT-PCR技术检测DNA和 RNA的试剂盒应用于临床诊断和检测中，这些试剂盒所提供的DNA和RNA提取方法主要是苯 酚-氯仿提取法。苯酚、氯仿是DNA和RNA提取过程的变性剂，反复抽提可以去除蛋白质、 盐类和杂质。但苯酚和氯仿对人体有较大毒性，挥发性较强，并且整个提取过程步骤繁琐， 耗时较长，往往容易导致DNA和RNA的降解，并且增加能耗和试验成本，对下游实验往往造 成不利影响。
[0003] 全基因组是细胞或组织中包括编码序列和非编码序列在内的全部基因信息，几乎 所有的生命信息均可以从全基因组中发现，包括与动物疾病相关的基因表达与调控。目前， 病原学检测与分子诊断是临床检测中常见的技术，其敏感性、特异性与DNA和RNA提取的纯 度和浓度有很大关系，直接决定了检测结果。在动物疾病检测与分子诊断中，高灵敏度与特 异性的分子诊断已逐步取代血清学检查。因而，获取高纯度与高浓度的基因组DNA和RNA 是动物病原菌科研和临床检测中的第一步，其决定了扩增结合和诊断的特异性。
[0004] DNA和RNA的提取是分子生物学研宄中常用的一种技术，目前市场上有多种DNA 和RNA提取方法。动物组织中含有大量的蛋白质、盐类及杂质，其性质与核酸的性质非常相 似，难以从提取的DNA和RNA中分离出，在动物组织的DNA和RNA提取过程中，很容易与DNA 和RNA共同沉淀，并且难以分离，往往造成提取的DNA和RNA纯度和浓度不够，影响了后续 的扩增和测序。
[0005] 为降低或清除动物组织中的蛋白质、盐类及杂质，现有的DNA和RNA提取过程中常 常有污染，并且步骤繁琐，提取过程时间较长。如高氯酸钠法、SDS法和尿素法等提取方法， 但这些方法需要样本量较大，并且苯酚类等有机物容易在DNA和RNA溶液中残留，特别是在 后续的PCR、RT-PCR扩增过程中会干扰扩增过程，影响扩增结果，使得该方法的应用受到一 定的限制。
[0006] 目前市场上采用的方法为：（1)采用氯仿、苯酚抽提法来去除蛋白质、盐类和杂 质。（2)提取DNA和RNA的首要步骤为裂解样品，目前市场上公开的方法为多为水浴裂解 15分钟到1个小时，裂解时间较长，增加了检测成本。
[0007] 对于动物组织而言，采用分子生物学方法来研宄其病原菌诊断，首先要进行的就 是样品中细菌或病毒的DNA和RNA提取。能获取不同种类细菌和病毒的DNA及RNA，以及基 因组的完整性、纯度和浓度，是从动物组织中提取DNA和RNA用于动物病原菌诊断研宄的首 要目标。因此，需要一种适于用于动物基因组DNA和RNA超级快速提取试剂盒，才能满足当 前快速分子诊断的需求，保障畜牧业的健康发展。

【发明内容】

[0008] 本发明的目的：在于提供一种用于动物组织基因组DNA和RNA快速提取试剂盒及 其应用，本方法操作简便、省工省时，可以满足样品较多和快速提取DNA、RNA的需求，为动 物病原菌快速诊断和养殖业的健康发展提供技术支持和理论基础。
[0009] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 一种用于动物组织基因组DNA和RNA的快速提取试剂盒，包括以下试剂：裂解液、冲洗 液1、冲洗液2、无水乙醇和重量比为0. 5~1. 5%的焦碳酸二乙酯水溶液，其中裂解液、冲洗液 1、冲洗液2的组成分别为： (1) 裂解液：EDTA 30~50 mM，重量比1~3%的聚乙二醇辛基苯基醚，异硫氰酸酯1~3 M， 0. 5~0. 9 M氯化钠； (2) 冲洗液I :5~15 mM EDTA，体积比70%的乙醇，pH 7. 0 ; (3) 冲洗液2 :含有65~85 mM Tris-HCl，体积比80%的乙醇，pH 7. 0。
[0010] 所述的用于动物组织基因组DNA和RNA的快速提取试剂盒，其中：焦碳酸二乙酯水 溶液的浓度为1% ; 裂解液：EDTA 40禮，重量比2%的聚乙二醇辛基苯基醚，异硫氰酸酯2 M，0.7 M氯化 钠； 冲洗液I :10 mM EDTA，体积比70%的乙醇，pH 7. 0 ; 冲洗液2 :含有75 mM Tris-HCl，体积比80%的乙醇，pH 7. 0。
[0011] 一种利用所述的DNA和RNA快速提取试剂盒提取动物组织基因组的方法，包括以 下步骤： (1)将固体状的动物组织先进行研磨处理，液体状的动物组织直接用于提取； (1) 取液体状动物组织20 μ 1~100 μ 1，或取研磨后的固体状动物组织20mg~100 mg， 加500 μL裂解液，70°C水浴3-5 min，12000 rpm 30 S，分离出上清液； (2) 将上清液转入离心管中，加500 μ 1无水乙醇，分次转到DNA和RNA纯化柱上， 12000 rpm离心30 S ;得到粗提的DNA和RNA，倒掉收集管中的废液； (3) 用500 μ 1冲洗液1冲洗纯化柱，12000 rpm离心30 S，倒掉收集管中的废液； (4) 用600 μ 1冲洗液2冲洗纯化柱，12000 rpm离心30 S，倒掉收集管中的废液； (5) 用500 μ 1冲洗液2冲洗纯化柱，12000 rpm离心30 S，倒掉收集管中的废液； (6) 再次12000离心30 S，得到DNA和RNA ; (7) 将DNA和RNA纯化柱转到另一离心管，加50 μ 1焦碳酸二乙酯水溶液，12000离 心30 S，即可得到高纯度的病毒及组织基因组的DNA和RNA，于-20 °C保存备用。
[0012] 所述固体状的动物组织为心脏、肝脏、肺脏、脾脏或肾脏；所述液体状的动物组织 为全血、血浆、血清或动物分泌物。
[0013] 所述的试剂盒在用于动物组织基因组DNA和RNA快速提取中的应用。
[0014] 本发明的积极有益效果： 本发明的动物组织基因组DNA和RNA快速提取试剂盒，可以快速提取动物组织的DNA 和RNA，用于动物病原菌的快速诊断，又可以用于分子遗传学研宄、临床基因诊断及动物疾 病诊断。本发明的试剂盒也可以用于其他同类组织DNA和RNA的提取和病原菌的诊断。
[0015] 本发明的试剂盒DNA和RNA提取效率高、检测灵敏度高，为早期诊断各类DNA和 RNA细菌或病毒病原体感染和早期诊断提供可靠的实验依据。
[0016] 本发明的试剂盒中的样品经过裂解后，基因组DNA和RNA分别被吸附在DNA和RNA 吸附柱上，然后用DEPC水冲洗即可得到全基因组的DNA和RNA，提取过程中DNA和RNA所用 试剂相同，不同之处就是DNA纯化柱和RNA纯化柱。操作简便、省工省时，提取速度超快，整 个提取过程只需5分钟，可以满足样品较多和快速提取DNA和RNA的需求，为动物病原菌快 速诊断和养殖业的健康发展提供技术支持和理论基础。
[0017] 本发明的试剂盒用于提取动物组织(如心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏)、全血、血浆、 血清和动物分泌物(乳液、鼻液）的基因组DNA和RNA，此基因组DNA和RNA可用于RT-PCR 反应、RAPD、AFLP、RFLP及病毒基因组扩增。
[0018] 本发明适用于科研单位临床病原检测、分子遗传学研宄、临床基因诊断及动物疾 病诊断和疾病控制中心，具有广阔的市场前景和较好的经济效益。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1 : 一种用于动物组织基因组DNA和RNA快速提取试剂盒及提取方法 (1)试剂盒试剂：包括裂解液、冲洗液1、冲洗液2和无水乙醇和浓度为1%的焦碳酸二 乙酯水溶液； 裂解液：EDTA 40 mM (mmol/L)，重量比2%的聚乙二醇辛基苯基醚，异硫氰酸酯2 M (mol/L)，0. 7 M 氯化钠； 冲洗液1 :10 mM EDTA，体积比70%的乙醇，pH 7. 0 ; 冲洗液2 :含有75 mM Tris-HCl，体积比80