一种经基因工程改造金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶及制 备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)是一种重要的人兽共患病原菌，可以 引起伤口感染、心内膜炎、骨髓炎、中毒性休克综合征等多种疾病，在奶牛场金黄色葡萄球 菌引发的奶牛乳房炎疾病发病率高达35-59%，极大地影响了我国奶牛的产奶量、所产牛奶 的品质、奶牛场的经济效益甚至我国牛奶质量在国际上的竞争力和声誉。
[0003] 目前，金葡菌感染引发的奶牛乳房炎主要通过1)抗生素挂水全身注射、乳房注射 或灌注、乳头浸润等方式，和2)金葡菌疫苗免疫，3)中草药使用等方法控制和治疗，虽然抗 生素能够在一定程度上抑制了金黄色葡萄球菌引起的细菌感染，但抗生素的长期使用带来 了世界范围内不可逆转的致病菌耐药性的危害。这种危害不仅导致巨大的经济损失，而且 对人类造成严重的健康威胁，主要包括两方面：第一，抗生素的使用导致多年来不断产生多 重耐药金葡菌，如耐甲氧西林金葡菌（methicillin-resistant S. aureus，MRSA)和耐万古 霉素金葡菌（vancomycin-resistant S. aureus，VRSA)，而这些耐药菌的出现又使得急切需 要研发新型抗菌药物。而新型抗生素的出现又会导致产生更耐药更难以防治的金葡菌，从 而形成了恶性循环。第二，因治疗金葡菌感染所导致的牛奶中的抗生素残留，带来了严重的 食品安全隐患，间接危害了人类的健康。因此，研发新型的抗菌药物成为迫在眉睫的社会需 要和各国科学家的研宄热点。
[0004] 噬菌体作为细菌专性寄生病毒，分为裂解性噬菌体和溶源性噬菌体，其中裂解性 噬菌体可以通过吸附、注入基因组、重新组装病毒颗粒、裂解细菌释放子代噬菌体病毒颗粒 完成一个病毒更新周期，同时达到将细菌裂解成碎片的目的。
[0005] 早在1915年发现噬菌体以来，噬菌体已经被苏联、德国军队等用于治疗士兵的痢 疾、伤口感染等的治疗，并取得了较好的治疗效果。近期，由于细菌耐药菌以及超级细菌的 出现，噬菌体因其能裂解细菌的特性又被各国科学家们重新关注、并认为是一种潜在的新 型抗菌药物而成为研宄热点。2007年，美国FDA批准了李斯特菌噬菌体制剂用于禽肉和芝 士的保藏杀菌，2014年新西兰政府批准了大肠杆菌0157噬菌体用于屠宰前奶牛的净化杀 菌。
[0006] 当前，也有一些科学家认为噬菌体作为活体病毒，用于细菌控制和治疗添加于食 品中有一定的风险。因此，现在许多科学家转向开始将噬菌体中表达裂解酶的基因进行重 组表达安全性较高的裂解酶用于细菌性疾病的治疗和细菌性污染的控制。
[0007] 噬菌体裂解酶（Bacteriophage Iysin)是由双链DNA噬菌体基因组编码并在噬菌 体感染细菌后期表达的一类细胞壁蛋白水解酶，能够直接破坏细菌细胞壁的肽聚糖从而使 细菌裂解。一般认为，裂解酶具有两个结构域，即位于N端的具有裂解功能的结构域和位于 C端的决定宿主特异性的结构域。
[0008] 近年来的研宄表明，对于革兰氏阳性菌，噬菌体的裂解酶能够识别细菌细胞壁受 体、并裂解细菌。噬菌体裂解酶作为一种新型安全的抗菌药物具有高效快速、裂解谱广、安 全性高、很难产生抗性菌、能够有效裂解多重耐药菌等优点，得到越来越多的重视。国内外 越来越多的体内动物试验表明裂解酶具有很高的杀菌性、较之噬菌体具有更广的裂解谱和 难产生抗性菌、对耐药性致病菌的裂解性和其他抗菌剂协同作用的高效性，并且由体内使 用裂解酶导致动物体内产生的抗体没有影响裂解酶的作用。因此该研宄有望将金黄色葡萄 球菌噬菌体裂解酶研发成为一种防治由金黄色葡萄球菌感染引起的疾病和控制动物源性 食品中金葡菌的新型抗菌制剂。
[0009] 目前，关于对金葡菌有杀灭或裂解作用的噬菌体裂解酶报道不多，本实验室成员 张辉申报的专利（ZL201210157894.6)是一种来自于天然金葡菌噬菌体的裂解酶基因，未 经过改造和重组，与本发明的噬菌体裂解酶LysSl核酸序列和氨基酸序列也不同，是两种 不同的裂解酶。
【发明内容】
[0010] 本发明需要解决的技术问题是，提供一种金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶。
[0011] 本发明还要解决的技术问题是，提供上述金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶的制备方 法。
[0012] 本发明最后要解决的技术问题是，提供上述金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶的应用
[0013] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0014] 一种经基因工程改造的金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶，该金黄色葡萄球菌噬菌体 裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO :1。
[0015] 一种经基因工程改造的金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶的编码基因，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO : 2 所示。
[0016] 包含上述的金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶的编码基因的质粒也在本发明的保护 范围之内。
[0017] 包含上述的质粒的重组菌也在本发明的保护范围之内。
[0018] 一种金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶的制备方法，该方法包括如下步骤：
[0019] (1)将SEQ ID NO :2所示核苷酸序列克隆到表达载体中，得到重组质粒；
[0020] (2)将步骤（1)得到的重组质粒转化宿主菌，得到重组菌；
[0021] (3)利用重组菌表达金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶；
[0022] (4)纯化步骤（3)得到的金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶。
[0023] 步骤（1)中，所述的表达载体为pET32b (+)。
[0024] 步骤（2)中，所述的宿主菌为大肠杆菌TransB (DE3)。
[0025] 步骤（3)中，利用IPTG诱导重组菌表达金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶，IPTG的浓 度为I. 0~I. 2mmol/L，诱导表达的温度为20~26°C。
[0026] 利用重组菌产金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶的具体方法如下：
[0027] 将SEQ ID NO :2所示核苷酸序列克隆到pET32b(+)质粒上，得到重组质粒命名 为：pET32b-LysSl，将pET32b-LysSl质粒转化大肠杆菌TransB (DE3)，得到的重组菌命名为 TransB(pET32b_LysSl)。
[0028] 将重组菌TransB (pET32b-LysSl)接种到含氨苄青霉素（50 μ g/mL)的LB培养液 中，37°C振荡培养12h ;按体积比为1 %转接至IOOmL LB培养基中，37°C振荡培养至OD6cJ直 约为0. 5时，加入IPTG至终浓度1.0 mmol/L，26°C诱导20h。收集菌体，超声波破碎细胞，收 集上清上清用His亲和层析镍柱纯化。将纯化的裂解酶产物经去毒素试剂盒进行去毒处理 (彡0· OlEU/ μ g内毒素）。
[0029] 上述金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶的制备方法制备得到的金黄色葡萄球菌噬菌 体裂解酶在本发明的保护范围之内。
[0030] 上述金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶在制备抑制金黄色葡萄球菌生长的药物中的 应用在本发明的保护范围之内。
[0031] 上述金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶在制备防治奶牛乳房炎药物中的应用在本发 明的保护范围之内。
[0032] 上述金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶在制备奶牛养殖场防疫药物中的应用。
[0033] 上述金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶在抑制食品中金黄色葡萄球菌生长中的应用， 本发明制备的金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶可以抑制牛奶中金黄色葡萄球菌生长。
[0034] 有益效果：
[0035] (1)本发明将金黄色葡萄球菌裂解酶克隆到pET32M+)质粒中，并将重组质粒转 化至大肠杆菌中，进过诱导表达制备得到金黄色葡萄球菌裂解酶。
[0036] (2)本发明制备的金黄色葡萄球菌裂解酶对多种金黄色葡萄球菌具有裂解作用。
【附图说明】
[0037] 图1裂解酶LysSl基因的构建和鉴定；其中，泳道1~5为重组表达质粒 pET32b-LysSlNde I/Xho I双酶切鉴定，泳道6为空质粒对照pET32b(+)Nde I/Xho I双酶 切鉴定，Ml 为 2Kb DNA ladder，Mr 为 15Kb DNA ladder。
[0038] 图2重组裂解酶LysSl表达产物的鉴定分析；泳道1为纯化的重组裂解 酶LysSl，泳道2为诱导表达TransB(pET32b) 1.0 mmol/L IPTG，泳道3为诱导表达 TransB (pET32b-LysSl) I. 0mmol/L IPTG，M 为蛋白分子质量 Marker。
[0039] 图3重组裂解酶LysSl对金黄色葡萄球菌的裂解活性分析;A :金黄色葡萄球菌 X12外滴加重组裂解酶LysSl和空载体pET32b (+)对照，B :金黄色葡萄球菌S6菌外滴加重 组裂解酶LysSl和空载体pET32b (+)对照。
[0040] 图4重组裂解酶LysSl对金黄