专利名称：一种制备肺炎链球菌噬菌体裂解酶的方法
技术领域：
本发明涉及利用重组DNA技术生产蛋白质或多肽药物领域，更具体的，本发明 涉及大肠杆菌表达生产并纯化肺炎链球菌噬菌体裂解酶的方法。
背景技术：
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是一种人类常见的和重要的病原体之
一。肺炎链球菌可引起肺炎、败血症、脑膜炎、中耳炎、鼻炎等疾病。在耐药性菌株日 益加剧和疫苗疗效不甚理想的情况下，肺炎链球菌造成了高发病率和死亡率，尤其是婴 幼儿，老年人和免疫功能低下患者。噬菌体是一类专门侵染原核细胞的病毒，于1917年被发现。噬菌体寄生于细菌 中，并在细菌中复制。在感染细菌的后期，噬菌体表达出细胞壁裂解酶，从而释放出子 代噬菌体，用于感染其它细菌。当这种裂解酶在细胞外部结合到细菌细胞壁时也能裂解 细菌细胞壁上的肽聚糖，从而使细菌裂解死亡。噬菌体裂解酶在体外能高效、专一地杀 死细菌，对感染细菌的模型动物有很好的治疗作用。噬菌体编码的裂解酶主要有三种类型，分别为溶菌酶(肽聚糖上氨基糖之间的 糖苷键)、酰胺酶(水解细菌细胞壁肽聚糖上糖与氨基酸间的酰胺键)和内肽酶(肽聚糖 上肽交联桥)。研究表明所有的噬菌体裂解酶在结构上具有相似性，即含有2个结构域 比较保守的N端催化区和差异较大的C端特异性结合区。裂解酶的高亲和性与种属特异 的细胞壁糖基有关，而后者常常是细菌存活的必要成分，因而细菌难以产生对裂解酶的 抗性。噬菌体裂解酶具有较高的特异性，仅攻击特定细菌，因此该酶不影响无害或有益 的人体寄生菌，也不影响其他细胞。所以，裂解酶作为新型抗菌药物具有一定的优势。CPL-I是肺炎链球菌的噬菌体CP-I表达的裂解酶，于1987年由Jose L.Garcia和 Ernesto Garcia 首次在肺炎球菌噬菌体 CP-I 中克隆到(Jose L.Garcia，Ernesto Garcia, Ana Arraras, et al.Cloning, Purification, and Biochemical Characterization of the Pneumococcal Bacteriophage Cp-I Ly sin [J], Journal of Virology, 1987，61: 2573-2580.)，该酶由 339 个 氨基酸组成，其分子量为39KD，等电点4.62，含一对二硫键。CPL-I属于糖基水解 酶GH25家族，能特异性的裂解肺炎链球菌细胞壁肽聚糖的β 1-4糖苷键。体外杀菌和 感染细菌的动物模型方面的实验证明其对肺炎球菌具有很强的抗菌活性(J.M.Entenza， J.M.Loeffler, D.Grandgirard, et al.Therapeutic Effects of Bacteriophage CPL-I Lysin against Streptococcus pneumoniae Endocarditis in Rats [J] .Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2005，49: 4789-4792)，基于其高效、专一的抗菌活性以及肺炎球菌耐药性的日趋严 重，将其开发成新型的抗菌药物具有很好的应用前景，利用基因工程技术低成本、大规 模制备噬菌体裂解酶也具有重要意义。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供了一种大肠杆菌高效表达并纯化重组CPL-I的方法。本发明的发明构思是这样的1987年Jose L.Garcia等克隆表达的CPL-I方法是将肺炎球菌噬菌体CP-1中的 CPL-I基因和CPL-I的启动子一起克隆至大肠杆菌，但是表达效率并不高，因为原始 CPL-I基因中有大约5%的大肠杆菌稀有密码子，会直接影响到CPL-I在大肠杆菌中的表 达。本发明通过对编码CPL-I的原始基因序列进行分析，发现其中有54个氨基酸 (占总体的15.8% )的编码子在大肠杆菌中使用频率非常低，会严重影响该基因序列在大 肠杆菌中的表达。因此本发明根据CPL-I的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱密码子，人 工设计合成了编码CPL-I的基因序列SEQ.ID.NO 1。本发明的技术方案是这样的本发明提供了一种大肠杆菌表达肺炎链球菌噬菌体裂解酶CPL-I的方法，包括 如下步骤(1)表达载体的构建将编码肺炎球菌噬菌体裂解酶CPL-I氨基酸序列的基因 序列与启动子相连；(2)转化大肠杆菌，使其含有步骤(1)所构建的载体，培养发酵；(3)从发酵液中分离纯化肺炎球菌噬菌体裂解酶CPL-1。其中步骤(2)中噬菌体裂解酶CPL-I的表达为诱导表达。所述及的载体是大肠杆菌表达用载体，是pET28a。启动子是T7启动子。步骤(3)采用的分离纯化重组CPL-I的方法为胆碱类似物DEAE-Sepharose亲和
层析纯化。具体步骤是，首先根据CPL-I氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱密码子，人工设 计合成编码CPL-I的基因序列，该基因编码序列全长1027bp。其5’端加上了 Nco I限 制性核酸内切酶位点的基因序列，以及3’端加上了 HindIII限制性核酸内切酶位点的基 因序列。人工合成的基因经Nco I和HindIII双酶切，割胶回收CPL-1基因片段，将酶切 后的片段用T4DNA连接酶与同样用Nco I和Hind III酶切过的pET28a载体在16°C连接2 小时，即连入pET28a载体的T7启动子之后，连接液再转化大肠杆菌DH5a，便得到重组 表达质粒 pET28a-cpl_l。将测序正确的表达质粒转化BL21 (DE3)感受态细胞，获得cpl_l的表达工程菌 BL21 (DE3) /pET28a-cpl-l。挑单克隆接种于50ml LB培养液(含30 μ g/ml卡那霉素)， 37°C振荡培养过夜，按接种到相同的LB培养液中，37°C振荡培养至光密度值(波长 600nm)为0.6时，然后加入IPTG到终浓度为ImM诱导蛋白表达，继续培养4小时，发 酵液离心，收集菌体。重组 CPL-I 的分离纯化方法可参考文献Immobilization and single-step purification of fusion proteins using DEAE_cellulose[Eur.J.Biochem.203，3 53-159(1992)]。比较好的 纯化步骤如下菌体沉淀重悬于破菌缓冲液(20mmol/L Tris-HCl, 2mmol/L EDTA，pH
7.0-9.0)，在冰浴下超声破菌。破菌液离心，收集上清液部分。破菌上清液上样至用25mM 磷酸缓冲液 pH6.0-8.0 平衡 DEAE-Sepharose 层析柱；用含 1-2M NaCl 的 25mM
磷酸缓冲液pH6.0-8.0清洗至紫外检测保证层析柱平衡至基线；再用25mM磷酸缓冲液 PH6.0-8.0清洗2-5个柱体积；用含1-5%氯化胆碱的25mM磷酸缓冲液pH6.0_8.0洗脱， 洗脱液经透析和冻干后即得重组CPL-1。本发明利用基因重组技术，将人工合成的噬菌体裂解酶CPL-I基因克隆至大肠 杆菌，IPTG诱导表达，再利用肺炎链球菌噬菌体裂解酶CPL-I的结合域能与肺炎链球菌 细胞壁上磷壁酸中的胆碱(choline)相结合的特性，采用胆碱类似物DEAE-Sepharose进 行亲和层析来纯化重组CPL-I，最后经透析和冷冻干燥制得重组CPL-I产品，其纯度达 97%,生产工艺快速简易，纯化效率高，能最大限度地保持酶活性，适合大规模生产。
图1为重组CPL-I的DEAE-Sepharose亲和纯化图2为SDS-PAGE分析CPL-1的表达其中泳道M 蛋白分子量标准泳道1-4:超声破菌上清液，分别为空载体未诱导；空载体诱导后4小时；重 组质粒未诱导；重组质粒诱导后4小时图3为纯化重组CPL-I的SDS-PAGE分析其中泳道M 蛋白分子量标准泳道1-4 经DEAE-Sepharose亲和纯化后的重组CPL-I
图4为重组CPL-I对肺炎球菌的抑菌活性1-3 重组 CPL-I 的浓度分别为 lmg/ml、2mg/ml 和 4mg/ml
具体实施例方式实施例1.获取噬菌体裂解酶CPL-I基因根据大肠杆菌偏爱密码子，全基因合成CPL-I基因，该基因编码序列全长 1027bp。SEQ.ID.NO 15 ‘ -CCATGGTTAAAAAGAATGATCTGTTTGTAGATGTTTCTTCCCACAACGG TTACGATATCACTGGTATCCTGGAGCAAATGGGCACCACTAACACCATCATTAAAATTT CTGAATCCACGACCTATCTGAACCCTTGCTTGTCTGCTCAAGTGGAGCAGTCCAACCC TATTGGCTTTTATCACTTCGCACGCTTTGGCGGTGACGTAGCAGAAGCCGAACGTGAA GCGCAGTTTTTCCTGGACAACGTGCCTATGCAAGTTAAATACCTTGTATTGGACTACG AGGACGACCCAAGCGGTGACGCACAAGCGAACACTAACGCATGCCTGCGCTTTATGC AGATGATTGCTGACGCTGGCTATAAACCTATTTATTATTCTTATAAACCGTTTACCCATG ATAATGTGGACTATCAGCAAATCCTTGCACAGTTCCCTAATTCTCTGTGGATTGCAGGC TATGGCCTGAACGATGGTACTGCTAACTTTGAATACTTCCCAAGCATGGACGGCATCC GTTGGTGGCAGTATTCTTCCAACCCGTTTGACAAGAATATTGTACTGTTAGACGATGA AGAAGACGACAAGCCAAAGACCGCTGGTACGTGGAAACAAGACAGCAAGGGTTGGT GGTTCCGCCGTAACAATGGCTCTTTCCCTTATAATAAATGGGAAAAAATCGGTGGTGT GTGGTACTACTTCGATTCTAAAGGCTATTGCCTGACGAGCGAATGGCTCAAAGATAATGAAAAATGGTACTACCTCAAGGACAACGGCGCAATGGCGACTGGTTGGGTGCTGGTC GGTTCTGAGTGGTATTATATGGACGATTCTGGCGCTATGGTTACTGGTTGGGTCAAGTA TAAGAATAACTGGTACTATATGACCAATGAACGTGGTAACATGGTTTCTAATGAATTTA TTAAGTCTGGCAAAGGTTGGTATTTCATGAACACCAACGGTGAGCTGGCAGACAATC CATCCTTCACGAAAGAACCAGACGGCCTGATCACCGTAGCATGAAGCTT-3'在设计的SEQ.ID.NO 1中，5，端加上了 Nco I限制性核酸内切酶位点(斜体 部分)的基因序列，以及3’端加上了 HindIII限制性核酸内切酶位点(斜体部分)的基 因序列。实施例2.工程菌的构建和表达人工合成的基因经Nco I和HindIII双酶切，割胶回收cpl_l基因片段，将酶切后 的片段用T4DNA连接酶与同样用Nco I和HindIII酶切过的pET28a载体在16°C连接2小 时，即连入pET28a载体的T7启动子之后，连接液再转化大肠杆菌DH5a，便得到重组表 达质粒 pET28a-cpl_l。重组质粒通过DNA自动测序仪测序，经过序列比较证实获得的DNA序列与设 计的编码噬菌体裂解酶CPL-I的基因序列完全一致。构建的重组质粒pET28a_cp卜1编码CPL-1的氨基酸序列如下SEQ.ID.NO 2 MVKKNDLFVD VSSHNGYDIT GILEQMGTTN TIIKISESTT YLNPCLSAQVEQSNPIGFYH FARFGGDVAE AEREAQFFLD NVPMQVKYLV LDYEDDPSGD AQANTNACLR FMQMIADAGYKPIYYSYKPF THDNVDYQQI LAQFPNSLWI AGYGLNDGTA NFEYFPSMDG IRWWQYSSNP FDKNIVLLDDEEDDKPKTAG TWKQDSKGWW FRRNNGSFPY NKWEKIGGVW YYFDSKGYCL TSEWLKDNEK WYYLKDNGAMATGWVLVGSE WYYMDDSGAM VTGWVKYKNN WYYMTNERGN MVSNEFIKSG KGWYFMNTNG ELADNPSFTKEPDGLITVA将测序正确的表达质粒转化BL21 (DE3)感受态细胞，获得cpl_l的表达工程菌 BL21 (DE3) /pET28a-cpl-l。挑单克隆接种于50ml LB培养液(含30 μ g/ml卡那霉素)， 37°C振荡培养过夜，按接种到相同的LB培养液中，37°C振荡培养至光密度值(波长 600nm)为0.6时，然后加入IPTG到终浓度为ImM诱导蛋白表达，继续培养4小时，发 酵液6000r/min离心IOmin收集菌体。实施例3.重组CPL-I的纯化实施例2获得的菌体沉淀重悬于破菌缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTApH 8.0),在冰浴下超声破菌。破菌液4°C，12000r/min离心20min，收集上清液部 分。样品经15% SDS-PAGE分析，在40KD处有一条明显的重组蛋白表达条带，目的蛋 白约占菌体总蛋白的30%，菌体超声破菌上清中有明显的表达产物(如图2)，说明表达 的目的蛋白都是以可溶的形式存在。破菌上清液上样至用25mM磷酸缓冲液pH7.0平衡DEAE-Sepharose层析柱；用 含1.5M NaCl的25mM磷酸缓冲液pH7.0清洗至基线；再用25mM磷酸缓冲液pH7.0清 洗2个柱体积；用含2%氯化胆碱的25mM磷酸缓冲液pH7.0洗脱，回收率达70% (见附 图1)。纯化后的样品经透析和冻干后即得成品。
纯化后的样品经15% SDS-PAGE检测显示在40KD处有一条纯度大于97%的条 带，其分子量与理论值39KD相符(如图3)。实施例4.重组CPL-I的抑菌活性采用纸片扩散法进行抑菌实验，将处于对数生长期的肺炎球菌HPK146 (对红霉 素和克林霉素耐药)在血平板上涂布均勻，取20yL纯化后的产物，浓度分别为Img/ ml、2mg/ml和4mg/ml，滴加在直径6mm的圆形纸片上，再贴于培养基表面，将平板正 面向上37°C培养Ih后，倒置继续培养18h。经纯化的重组CPL-I对临床分离的肺炎球 菌具有明显的抑菌活性(如图4)。说明CPL-I有望开发成为一个新的对付耐药菌感染极 为有效的抗菌药物，因此具有良好的临床应用前景。序列表
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<120> 一种制备噬菌体裂解酶Cpl-I的方法
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< 170>PatentIn Version2.1
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<211>1027
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CPL-1
<400>1
ccatggttaa aaagaatgat ctgtttgtag atgtttcttc ccacaacggt tacgatatca60
ctggtatcct ggagcaaatg ggcaccacta acaccatcat taaaatttct gaatccacga120
cctatctgaa cccttgcttg tctgctcaag tggagcagtc caaccctatt ggcttttatc180
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gtgagctggc agacaatcca tccttcacga aagaaccaga cggcctgatc accgtagcat10200079]gaagctt 10270080]<210>20081]<211>3390082]<212>PRT0083]<213>人工序列0084]<220>0085]<221>CHAIN0086]<400>20087]Met ValLysLysAsnAspLeuPheValAspValSerSerHisAsn0088]510150089]Gly TyrAsplieThrGlylieLeuGluGlnMetGlyThrThrAsn0090]2025300091]Thr IlelieLyslieSerGluSerThrThrTyrLeuAsnProCys0092]3540450093]Leu SerAlaGlnValGluGlnSerAsnProlieGlyPheTyrHis0094]5055600095]Phe AlaArgPheGlyGlyAspValAlaGluAlaGluArgGluAla0096]6570750097]Gln PhePheLeuAspAsnValProMetGlnValLysTyrLeuVal0098]8085900099]Leu AspTyrGluAspAspProSerGlyAspAlaGlnAlaAsnThr0100]951001050101]Asn AlaCysLeuArgPheMetGlnMetlieAlaAspAlaGlyTyr0102]1101151200103]Lys ProlieTyrTyrSerTyrLysProPheThrHisAspAsnVal0104]1251301350105]Asp TyrGlnGlnlieLeuAlaGlnPheProAsnSerLeuTrplie0106]1401451500107]Ala GlyTyrGlyLeuAsnAspGlyThrAlaAsnPheGluTyrPhe0108]1551601650109]Pro SerMetAspGlylieArgTrpTrpGlnTyrSerSerAsnPro0110]1701751800111]Phe AspLysAsnlieValLeuLeuAspAspGluGluAspAspLys0112]1851901950113]Pro LysThrAlaGlyThrTrpLysGlnAspSerLysGlyTrpTrp0114]2002052100115]Phe ArgArgAsnAsnGlySerPheProTyrAsnLysTrpGluLys0116]2152202250117]lie GlyGlyValTrpTyrTyrPheAspSerLysGlyTyrCysLeu0118]
0119]
0120] 0121] 0122]
0123]
0124]
0125]
0126]
0127]
0128]
0129]
0130]
0131]
0132]
Thr Ser Asp Asn Trp Tyr Lys Tyr Met Val Met Asn Glu Pro
Glu Gly Tyr Lys Ser Thr Asp
230 235240
Trp Leu Lys Asp Asn Glu Lys Trp TyrTyr Leu Lys
245 250255
Ala Met Ala Thr Gly Trp Val Leu ValGly Ser Glu
260 265270
Met Asp Asp Ser Gly Ala Met Val ThrGly Trp Val
275 280285
Asn Asn Trp Tyr Tyr Met Thr Asn GluArg Gly Asn
290 295300
Asn Glu Phe lie Lys Ser Gly Lys GlyTrp Tyr Phe
305 310315
Asn Gly Glu Leu Ala Asp Asn Pro SerPhe Thr Lys
320 325330 Gly Leu lie Thr Val Ala 33权利要求
1.一种制备肺炎链球菌噬菌体裂解酶的方法，包括如下步骤(1)表达载体的构建将编码肺炎球菌噬菌体裂解酶CPL-I氨基酸序列的基因序列 与启动子相连；(2)转化大肠杆菌，使其含有步骤(1)所构建的载体，培养发酵；(3)从发酵液中分离纯化肺炎球菌噬菌体裂解酶CPL-I。
2.根据权利要求1所述的制备肺炎链球菌噬菌体裂解酶的方法，其特征在于，步骤(2)中噬菌体裂解酶CPL-I的表达为诱导表达。
3.根据权利要求1所述的制备肺炎链球菌噬菌体裂解酶的方法，其特征在于，所述及 的载体是大肠杆菌表达用载体pET28a。
4.根据权利要求1所述的制备肺炎链球菌噬菌体裂解酶的方法，其特征在于，步骤 (1)中的启动子是T7启动子。
5.根据权利要求1所述的制备肺炎链球菌噬菌体裂解酶的方法，其特征在于，步骤(3)的肺炎球菌噬菌体裂解酶CPL-I的分离纯化包括如下步骤(1)菌体沉淀悬浮于破菌缓冲液中，经破菌，离心，收集上清液；(2)步骤(1)的上清液上样至用平衡缓冲液平衡好的DEAE-Sepharose层析柱，用清 洗缓冲液清洗至紫外检测保证层析柱平衡至基线，用平衡缓冲液清洗2-5个柱体积；(3)用洗脱缓冲液将肺炎链球菌噬菌体裂解酶从层析柱上洗脱并收集洗脱液，洗脱液 透析、冻干。
6.根据权利要求5所述的制备肺炎链球菌噬菌体裂解酶的方法，其特征在于，所述及 的破菌缓冲液为pH7.0-9.0的含有2mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-HCl缓冲液，平衡缓 冲液为PH6.0-8.0的25mM磷酸缓冲液，清洗缓冲液为pH6.0_8.0的含1_2M NaCl的25mM 磷酸缓冲液，洗脱缓冲液为pH6.0-8.0的含1-5%氯化胆碱的25mM磷酸缓冲液。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，具体的说涉及一种制备肺炎链球菌噬菌体裂解酶的方法。利用基因重组技术，将人工合成的噬菌体裂解酶CPL-1基因克隆至大肠杆菌，IPTG诱导表达，再利用肺炎链球菌噬菌体裂解酶CPL-1的结合域能与肺炎链球菌细胞壁上磷壁酸中的胆碱(choline)相结合的特性，采用胆碱类似物DEAE-Sepharose进行亲和层析来纯化重组CPL-1。该方法生产工艺快速简易，纯化效率高，能最大限度地保持酶活性，适合大规模生产。
文档编号C12R1/19GK102021161SQ20091005792
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月22日 优先权日2009年9月22日
发明者陆海荣, 黄青山 申请人:昆山博青生物科技有限公司