具有内切葡聚糖酶活性的多肽的制作方法

本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

发明背景

发明领域

本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的多肽，特别涉及具有内切葡聚糖酶活性并对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。本发明进一步涉及包括用于在洗涤剂以及用于在钻探和石油工业中使用的多肽和任选地黄原胶裂解酶的组合物。

相关技术描述

黄原胶是一种来源于野油菜黄单胞菌的细菌包被的多糖。黄原胶通过由野油菜黄单胞菌细菌发酵葡萄糖、蔗糖或乳糖而产生。在发酵周期后，用异丙醇将该多糖从生长培养基中沉淀，干燥，并磨成细粉。稍后，将该粉添加至液体介质中，以形成胶质。

黄原胶由五糖亚基构成，形成了纤维素主链，其三糖侧链由通过α1,3键附接到主链中替代的葡萄糖残基上的甘露糖(β1,4)葡萄糖醛酸(β1,2)甘露糖构成。这种生物聚合物由于其优异的假塑性、触变性和粘度而具有巨大的商业意义。目前，其广泛用作食品和非食品工业中的增稠剂或增粘剂，并且用作各种悬浮液、乳液和泡沫的稳定剂。

近年来，黄原胶已经被用作许多消费品中的成分，包括食品(例如在沙拉酱(salat dressing)和乳制品中作为增稠剂)和化妆品(例如在牙膏和化妆品中作为稳定剂和增稠剂，以阻止成分分离)和化妆品(例如防晒霜)。另外，黄原胶已经在石油工业中得以应用，其中黄原胶被大量使用以增稠钻井泥浆。这些流体用于将由钻头切割的固体运送回表面。当循环停止时，固体仍保持悬浮在钻井液中。水平钻井的广泛使用和对钻井固体的良好控制的需求已经导致其扩大使用。它还被添加到自密实混凝土中(包括在水下浇筑的混凝土)以增加其粘度。

黄原胶的广泛使用已导致对黄原胶的溶液或凝胶进行降解和/或改性的需求。黄原胶的完全酶降解需要若干酶活性，包括黄原胶裂解酶活性和内切-β-1,4-葡聚糖酶活性。

黄原胶裂解酶是切割黄原胶的β-D-甘露糖基-β-D-1,4-葡萄糖醛酸基键、从而去除末端丙酮酸甘露糖的酶。两种已经被分离自溶藻弧菌类芽孢杆菌XL-1的黄原胶裂解酶(例如，鲁基森纳斯(Ruijssenaars)等人(1999)“在由解藻朊类芽孢杆菌XL-1降解黄原胶中涉及的一种丙酮酸甘露糖特异性黄原胶裂解酶(A pyruvated mannose-specific xanthan lyase involved in xanthan degradation by Paenibacillus alginolyticus XL-1)”，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65(6):2446-2452和鲁基森纳斯等人(2000)，“一种编码解藻朊类芽孢杆菌菌株XL-1的黄原胶降解酶的新颖基因(A novel gene encoding xanthan lyase of Paenibacillus alginolyticus strain XL-1)”，应用与环境微生物学66(9):3945-3950)。

具有内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的酶必须能够切割去除末端丙酮酸甘露糖之后的黄原胶的高度取代的主链。这类酶从糖基水解酶家族GH9(WO 2013/167581)已知。

来源于Chthoniobacter flavus(uniprot:B4D329)的全基因组测序的预测氨基酸序列与本发明的多肽的氨基酸序列具有41％一致性。

发明概述

本发明提供了用于降解黄原胶的新的且改进的酶以及此类酶用于清洁目的(例如除去黄原胶污物)以及在钻探和石油工业中的用途。由于这些酶对纤维素也具有显著的活性，所以这些酶也可以用于降解纤维素材料的方法中，例如在纤维素生物质的降解中例如用于生产可发酵糖。

诸位发明人已经出人意料地发现了具有内切-β-1,4-葡聚糖酶活性并且能够切割黄原胶的高度取代的主链的酶，并且该酶不属于已知包含这种酶活性的糖基水解酶家族。该酶与任何已知的具有黄原胶降解活性的酶没有显著的序列相似性，并且不能归入已知的糖基水解酶家族中。

本发明提供了具有内切葡聚糖酶活性并对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的的多肽以及编码这些多肽的多核苷酸。

因此，本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性并对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；

(b)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交；

(c)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；

(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有内切葡聚糖酶活性并且对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性。

本发明还涉及编码本发明的多肽的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体；重组表达载体；重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。

本发明还涉及包含这些多肽的全培养液配制品或细胞培养组合物，涉及包含这些多肽的组合物。

本发明还涉及这些多肽和组合物用于降解黄原胶的用途，例如用于洗涤或清洁纺织品和/或硬表面(如餐具洗涤)中的用途。

本发明还涉及这些多肽和组合物用于降解纤维素材料的用途。

序列表综述

SEQ ID NO:1是编码本发明的多肽的DNA序列，其分离自浮霉状菌属物种R1(Planctomycete sp.R1)。

SEQ ID NO:2是本发明的多肽的氨基酸序列。成熟肽是氨基酸1至846。

定义

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

纤维素结合结构域：术语“纤维素结合结构域”是指介导酶结合至纤维素底物的非晶区域的酶的区域。

催化结构域：术语“催化结构域”意指酶的包含该酶的催化机器的区域。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

清洁或洗涤剂应用：术语“清洁或洗涤剂应用”意指用于手动、机械或自动化清洁或洗涤硬表面或纺织品的目的，将本发明的多肽应用于任何组合物中。

清洁或洗涤剂组合物：术语“清洁或洗涤剂组合物”是指用于从有待清洁的物品(例如纺织品、餐具和硬表面)除去不希望的化合物的组合物。这些术语涵盖经选择用于希望的具体类型的清洁组合物和产品的形式(例如，液体、凝胶、粉末、颗粒、糊状、或喷雾组合物)的任何材料/化合物，并且包括但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬表面清洁配制品，例如用于玻璃、木材、陶瓷以及金属台面和窗户；地毯清洁剂；炉灶清洁剂；织物清新剂；织物柔软剂；以及纺织品和衣物预去污剂(pre-spotter)，连同餐具洗涤剂)。除了本发明的多肽之外，该洗涤剂配制品还可以包含一种或多种另外的酶(例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、黄原胶裂解酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶，或其任何混合物)，和/或组分，例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂以及增溶剂。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”是指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。这些控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

降解黄原胶：在此将术语“降解黄原胶”或“黄原胶降解活性”定义为将黄原胶解聚、降解或分解为更小的组分。黄原胶的降解可以是去除一个或多个侧链糖，将黄原胶的骨架切成更小的组分，或去除一个或多个侧链糖并且将黄原胶的骨架切成更小的组分。黄原胶的降解优选地可以使用如描述于实例4中的粘度降低方法来测量。可替代地，黄原胶的降解可以使用如描述于实例5中的还原末端方法来测量。

洗涤剂组合物：术语“洗涤剂组合物”是指用于从有待清洁的物品(例如纺织品、餐具和硬表面)去除不希望的化合物的组合物。该洗涤剂组合物可以用于例如清洁纺织品、餐具以及硬表面，用于家用清洁剂和工业清洁二者。这些术语涵盖经选择用于希望的具体类型的清洁组合物和产品的形式(例如，液体、凝胶、粉末、颗粒、糊状、或喷雾组合物)的任何材料/化合物，并且包括但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬表面清洁配制品，例如用于玻璃、木材、陶瓷以及金属台面和窗户；地毯清洁剂；炉灶清洁剂；织物清新剂；织物柔软剂；以及纺织品和衣物预去污剂(pre-spotter)，连同餐具洗涤剂)。除了包含本发明的多肽之外，该洗涤剂配制品还可以包含一种或多种另外的酶(例如黄原胶裂解酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶，或其任何混合物)，和/或组分，例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂以及增溶剂。

餐具洗涤：术语“餐具洗涤”是指所有形式的洗涤餐具，例如手动或自动化餐具洗涤。洗涤餐具包括但不限于，清洁所有形式的陶器，例如盘子、杯子、玻璃杯、碗，所有形式的用餐工具，例如匙、刀、叉，以及上菜用具连同陶瓷，塑料，金属，瓷器，玻璃及丙烯酸酯。

餐具洗涤组合物：术语“餐具洗涤组合物”是指用于清洁硬表面的所有形式的组合物。本发明不局限于任何具体类型的餐具洗涤组合物或任何具体洗涤剂。

内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指一种内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键和混合β-1,3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖、木葡聚糖、黄原胶以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测定所确定的还原末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(张(Zhang)等人，2006，生物技术进展(Biotechnology Advances)24:452-481)。

对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的内切葡聚糖酶：将术语“对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的内切葡聚糖酶”或“具有内切葡聚糖酶活性并对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的多肽”定义为对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的内切葡聚糖酶。本发明的内切葡聚糖酶对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性。在本发明的一个方面，对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的内切葡聚糖酶是具有如SEQ ID NO:2的氨基酸1至846所示序列的多肽。可以如实例5所披露地确定对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶的活性。

酶洗涤益处：在此将术语“酶洗涤益处”定义为将一种酶添加至洗涤剂中与不具有该酶的同一洗涤剂相比的有利效果。可能由酶提供的重要去污益处是污渍去除伴随在洗涤和/或清洁之后无可见污物或污物非常少、阻止或减少在洗涤过程中释放的污物再沉积(一种又称作抗再沉积的作用)、完全或部分地恢复纺织品的白度(一种又称作增白的作用)，其中所述纺织品最初是白色的，但是在反复使用和洗涤后获得淡灰或淡黄色外观。不直接与污垢的催化去污或其再沉积的预防相关的纺织品护理益处对于酶洗涤益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是预防或减少染料从一织物转移至另一织物或同一织物的另一部分(一种也被称作染料转移抑制或抗返染的效果)，从织物表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的绒球或绒毛(一种也被称作抗起球的效果)，改善织物柔软性，织物的颜色澄清以及去除陷在织物或服装的纤维中的微粒状污垢。酶漂白是一种另外的酶洗涤益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(例如过氧化氢或其他过氧化物)的形成。

表达：术语“表达”包括涉及多肽的产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，该分子包括编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

片段：术语“片段”意指在一种成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在一个或多个(例如若干个)氨基酸的一种多肽；其中该片段具有内切葡聚糖酶活性并且对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性。在一方面，该片段包含至少840个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸1至840)、至少835个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸1至835)、或至少830个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸1至830)。

糖基水解酶家族：糖苷水解酶是催化糖基键水解以释放更小的糖的酶。存在超过100种已经被分类为糖基水解酶(GH)家族的糖苷水解酶，参见汉丽塞塔(Henrissat)等人(1991)‘基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶分类(A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities)’，生物化学杂志(J.Biochem.)280:309-316和Uniprot网站，www.cazy.org。

硬表面清洁：在此将术语“硬表面清洁”定义为清洁硬表面，其中硬表面可以包括地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面，例如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)。餐具洗涤包括但不限于，清洁盘子、杯子、玻璃杯、碗、及刀具(例如匙、刀、叉)、上菜用具、陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

改进的洗涤性能：在此将术语“改进的洗涤性能”定义为一种(变体)酶(还有酶的共混物，不只是变体还有骨架，以及与某种清洁组合物组合，等)相对于亲本蛋白酶变体的洗涤性能展示出一种蛋白质变体的洗涤性能的改变，例如增加的去污。术语“洗涤性能”包括在衣物洗涤并且例如在餐具洗涤中的洗涤性能。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从一个或多个或所有与它在自然界中相关的天然存在的成分中除去的任何物质，包括但不限于，任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子，也就是；(3)相对于在自然界中发现的物质经过人为改变的任何物质；或(4)相对于与它天然相关联的其它组分通过增加该物质的量(例如，在宿主细胞中的重组生产；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子)而改变的任何物质。分离的物质可以存在于发酵液样品中，例如，可以将宿主细胞进行遗传修饰来表达本发明多肽。来自宿主细胞的发酵液将包括分离的多肽。

湿洗(laundering)：术语“湿洗”涉及家用湿洗和工业湿洗两者并且意指用一种包含本发明的清洁或洗涤剂组合物的溶液处理纺织品的过程。洗衣过程可以例如使用例如家用或工业洗衣机进行或可以手动进行。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。本发明的成熟多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸1至846组成。SEQ ID NO:2的氨基酸-1至-27是信号肽。

本领域已知，宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达一种多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生一种不同的成熟多肽(例如，具有一个不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。使用N-末端测序，发现本发明的成熟肽的主要部分开始于ATPGKLF。成熟肽的次要部分具有N-末端序列TPGKLFP。因此，成熟多肽可以由SEQ ID NO:2的氨基酸2至846、SEQ ID NO:2的氨基酸3至846、SEQ ID NO:2的氨基酸4至846、SEQ ID NO:2的氨基酸5至846或其混合物组成。

在一个方面，成熟多肽含有多达846个氨基酸残基、多达845个氨基酸残基、多达844个氨基酸残基、多达843个氨基酸残基、多达842个氨基酸残基、多达841个氨基酸残基、多至840个氨基酸残基或多达835个氨基酸残基。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指一种编码成熟多肽的多核苷酸，该成熟多肽具有内切葡聚糖酶性并对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸82至2619。SEQ ID NO:1的核苷酸1至81编码信号肽。

在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸85至2619。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸88至2619。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸91至2619。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸94至2619。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链-或双-链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。

序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比一致性并且是如下计算的：

(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，同上)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位拓展罚分0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比一致性并且是如下计算的：

(一致的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)

严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针，按照标准DNA印迹程序在42℃于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“低严格条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针，按照标准DNA印迹程序在42℃于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“中严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“非常高严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5’端和/或3’端缺少的多核苷酸，其中该子序列编码具有内切葡聚糖酶活性并对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的片段。在一个方面中，子序列包含至少2520个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸82至2601)，至少2505个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸82至2586)，或至少2490个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸82至2571)。

纺织品：术语“纺织品”意指包括纱线、纱线中间体、纤维、非机织物材料、天然材料、合成材料、以及任何其他纺织品材料的任何纺织品材料，这些材料制造的织物和由这些织物制成的产品(例如服装和其他物品)。该纺织品或织物可以处于针织品、机织物、牛仔布、非机织物、毡、纱线、以及毛巾布的形式。这些纺织品可以是纤维素基的，如天然纤维素，包括棉布、亚麻/亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括纤维胶/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维(lyocell)或其共混物。纺织品或织物也可以不基于纤维素，如天然聚酰胺，包括羊毛、驼毛、羊绒、马海毛、兔毛和蚕丝或合成聚合物如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯和氨纶/弹性纤维(spandex/elastane)、或其共混物其以及基于纤维素和不基于纤维素的纤维的共混物。共混物的例子是棉和/或人造丝/纤维胶与一种或多种伴随材料的共混物，该伴随材料例如是羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚亚胺酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/纤维胶、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。织物可以是常规的可洗涤衣物，例如弄脏的家居衣物。当使用术语织物或衣服时，旨在也包括广义术语纺织品。

纺织品护理益处：不直接与污垢的催化去污或其再沉积的预防相关的“纺织品护理益处”对于酶洗涤益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是预防或减少染料从一纺织品转移至另一纺织品或同一纺织品的另一部分(一种也被称作染料转移抑制或抗返染的效果)，从纺织品表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的绒球或绒毛(一种也被称作抗起球的效果)，改善纺织品柔软性，纺织品的颜色澄清以及去除陷在纺织品的纤维中的微粒状污垢。酶漂白是一种另外的酶洗涤益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(例如过氧化氢或其他过氧化物或其他漂白种类)的形成。

变体：术语“变体”意指一种具有内切葡聚糖酶活性并对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的、并且在一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变(即取代、插入、和/或缺失)的多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸由不同的氨基酸代替；缺失意指除去占据一个位置的氨基酸；以及插入意指在占据一个位置的氨基酸的毗邻处和紧邻处添加一个氨基酸。

洗涤性能：术语“洗涤性能”被用作酶在例如洗涤或硬表面清洁过程中除去存在于有待清洁的物体上的污物的能力。可以通过计算如在此的‘用于衣物洗涤的自动机械应力测定(AMSA)’中的所谓的强度值(Int)或如在WO 2013/167581中所定义的反射值(Rem)来量化洗涤性能的改进。

白度：在此将术语“白度”定义为在不同领域并且针对不同顾客具有不同含义的广义术语。白度的损失可以例如归因于灰化、黄化、或光学增亮剂/调色剂的去除。灰化和黄化可归因于污垢再沉积、身体污垢、来自例如铁和铜离子或染料转移的着色。白度可包括来自以下列表的一个或若干个问题：着色剂或染料作用、不完全污渍去除(例如身体污垢、皮脂等)、再沉积(该物体的灰化、黄化或其他变色)(去除的污垢与纺织品的其他部分(弄脏的或未弄脏的)再关联)、在应用中纺织品的化学变化、以及颜色的澄清或淡色化。

黄原胶裂解酶：在此将术语“黄原胶裂解酶”定义为一种切割黄原胶中的β-D-甘露糖基-β-D-1,4-葡萄糖醛酸基键的酶(EC 4.2.2.12)。出于本发明的目的，根据实例5中所述的程序确定黄原胶裂解酶活性。

发明详述

本发明提供了对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的内切葡聚糖酶以及编码这些多肽的多核苷酸。内切葡聚糖酶不属于已知包含降解黄原胶的酶的GH家族。另外，黄原胶裂解酶与本发明的对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的内切葡聚糖酶的组合显示超过单独使用黄原胶裂解酶或对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的内切葡聚糖酶的协同的改进洗涤性能。此外，该酶可以对底物纤维素、凝胶多糖和β-葡聚糖中的任一种具有活性。

对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的内切葡聚糖酶

在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，该多肽具有内切葡聚糖酶活性和对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO:14的成熟多肽的区别不超过50个氨基酸，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、或49个。在一个优选的方面中，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少75％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少70％的内切葡聚糖酶活性和/或黄原胶降解活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少75％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少75％的内切葡聚糖酶活性和/或黄原胶降解活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少75％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少80％的内切葡聚糖酶活性和/或黄原胶降解活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少75％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少85％的内切葡聚糖酶活性和/或黄原胶降解活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少75％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少90％的内切葡聚糖酶活性和/或黄原胶降解活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少75％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少95％的内切葡聚糖酶活性和/或黄原胶降解活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少75％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少100％的内切葡聚糖酶活性和/或黄原胶降解活性。

在一个实施例中，该多肽已经被分离。本发明的多肽优选地包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至846或其等位变体或由其组成；或者是其具有内切葡聚糖酶活性和黄原胶降解活性的片段。在另一方面中，该多肽包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一方面中，该多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸2至846或由其组成。

在另一个实施例中，本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性并对由黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的多肽，该多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长补体杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。在一个实施例中，该多肽已经被分离。

根据本领域熟知的方法，SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列以及SEQ ID NO:2的多肽或其片段可用于设计核酸探针以鉴定和克隆DNA，该DNA编码具有内切葡聚糖酶活性和对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的多肽。具体地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针与来自不同属或种的株系的感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。

可以筛选从此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库的与上述探针杂交并编码本发明的多肽的DNA。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。

出于本发明的目的，杂交表明多核苷酸在非常低到非常高严格条件下与一种被标记的核酸探针杂交，该探针对应于(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补体；或(iv)其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

在一个方面，核酸探针是核苷酸是SEQ ID NO:1的子序列。在另一个方面，该核酸探针是编码以下项的多核苷酸：SEQ ID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1。

在另一个实施例中，本发明涉及一种具有内切葡聚糖酶活性并对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的多肽，该多肽由一种与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸编码。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。

在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。氨基酸变化可能是较小的种类，即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守的氨基酸取代或插入；小的缺失，典型地为1-30个氨基酸；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另外的功能来促进纯化的小的延伸，例如His-标签(多组氨酸束)、抗原表位或结合结构域。

保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979，在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见的取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质:改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得分子的内切葡聚糖酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。酶活性位点或其他生物学相互作用也可以通过对结构进行物理学分析来进行确定，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记，与假定接触位点氨基酸的突变相结合来进行确定。参见，例如，德沃斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；Wlodaver等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对推断鉴别必需氨基酸。

可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，罗曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)和区域定向诱变(德比舍尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。

可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。

该多肽可以是融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志12:2575-2583；道森(Dawson)，1994，科学(Science)266:776-779)。

融合多肽可以在两种多肽之间进一步包括切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在如下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物学生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；Svetina等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；Collins-Racie等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能和遗传学(Proteins:Structure,Function,and Genetics)6:240-248；和史蒂文斯(Stevens)，2003，世界药物发现(Drug Discovery World)4:35-48。

具有内切葡聚糖酶活性和对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的多肽的来源

本发明的多肽可以获得自任何属的微生物。出于本发明的目的，如在此结合给定的来源使用的术语“从…中获得”应意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，从给定来源中获得的多肽被分泌到细胞外。

在另一方面，该多肽是浮霉状菌多肽，例如获自浮霉状菌属物种R1(Planctomycete sp.R1)的多肽。

这一物种和相关物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的多肽的多核苷酸，如在此所述。在一个实施例中，编码本发明的多肽的多核苷酸已经被分离。

用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA，或其组合进行分离。来自基因组DNA的多核苷酸的克隆可以例如通过使用众所周知的聚合酶链反应(PCR)或用以对具有共有的结构特征的克隆的DNA片段进行检测的表达库抗体筛选来实现。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:A Guide to Methods and Application)，学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以克隆自浮霉状菌属的菌株或相关有机体，并且因此，例如可以是该多核苷酸多肽编码区的等位基因变体或物种变体。

修饰编码本发明多肽的多核苷酸对于合成与所述多肽基本上类似的多肽可为必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指该多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子使用的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德(Ford)等人，1991，蛋白质表达与纯化(Protein Expression and Purification)2:95-107。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。

可以用许多方式操作所述多核苷酸以便于多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

该控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的多肽的多核苷酸进行表达的多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括变体、截短型及杂合型启动子，并且可以由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteins from recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。

在丝状真菌宿主细胞中，用于指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是获得自以下各项的基因的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Daria(达莉亚)(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Quinn(奎恩)(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻译延伸因子，连同NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中已经用来自曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子)；和变体的、截短的和杂合的启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。

在酵母宿主中，有用的启动子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。

用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。

用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马诺斯(Romanos)等人，1992，见上文描述。

该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区域，它增加该基因的表达。

适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)177:3465-3471)。

该控制序列还可以是前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中起作用的任何前导子。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

适用于酵母宿主细胞的前导子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，一种可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中得以描述。

控制序列也可以是编码与多肽的N-末端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-端可以包含对于该编码序列而言是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下各项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，见上文，描述了其他有用的信号肽编码序列。

该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。

还可能希望地是添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该多肽的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。

该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可以包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含待引入宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

该载体优选包含允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。

细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(如氨比西林、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。优选在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。

选择性标记可以是如在WO 2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一个方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。

载体优选包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，该载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(origin of replication)”或“质粒复制子(plasmid replicator)”意指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可以根据披露于WO 00/24883中的方法完成。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些宿主细胞包含可操作地连接到一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，这些控制序列指导本发明的多肽的产生。将包括多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不局限于不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰链丝菌、以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见例如，克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(Folia Microbiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见，例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。

该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在将来可能有变化，出于本发明的目的，酵母应如酵母生物学和活动性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会(Soc.App.Bacteriol.Symposium)系列第9期，1980)所述地进行定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及以本身已知的方式进行细胞壁再生的过程来转化真菌细胞。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474以及科里蒂森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156、以及WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology)，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163；以及Hinnen等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。

生产方法

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，该方法包括：(a)培养细胞，该细胞处于其野生型形式，在有益于产生该多肽的条件下产生该多肽；以及任选地，(b)回收该多肽。在一个方面中,该细胞是浮霉状菌属细胞。在另一方面，该细胞是来自浮霉状菌属物种R1菌株的细胞。

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，该方法包括：(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；以及任选地，(b)回收该多肽。

这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包括碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中回收多肽。如果多肽不被分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。

可以使用特异性针对这些多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。在一方面，回收包含该多肽的发酵液。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。

在替代性方面中，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的来源。

植物

本发明还涉及分离的植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，该分离的植物、植物部分或植物细胞包含本发明的多核苷酸，以用来按可回收的量表达并且产生多肽。多肽可从植物或植物部分回收。可替代地，可以按原样将包含该多肽的植物或植物部分用于改善食品或饲料的质量，例如，改善营养价值、适口性、以及流变性质，或用以破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草甸草(蓝草，早熟禾属)；饲草，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖甜菜(sugar beet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(family Brassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式生物拟南芥)。

植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、以及包括这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织(parenchyme)、维管组织、分生组织。特定植物细胞区室，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以有助于本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。

同样包括于本发明范围内的是此类植物、植物部分以及植物细胞的子代。

表达多肽的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知的方法构建。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括：(a)在有助于产生该多肽的条件下培养包括编码该多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；并且(b)回收该多肽。

发酵液配制品或细胞组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包括在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。

如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞进行酶的表达)并且分泌到细胞培养基中时，产生发酵液。发酵液可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包括用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。

在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包括第一有机酸组分(包括至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述两种或更多种的混合物。

在一个方面，该组合物包含一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。

这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包括防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。

该细胞杀灭的全培养液或组合物可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。

如在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。

可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673所述的方法产生本发明的全培养液配制品和细胞组合物。

洗涤剂组合物

在一个实施例中，本发明涉及一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包括分离的内切葡聚糖酶，这些内切葡聚糖酶对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性并且与与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在一个实施例中，本发明针对洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含结合一种或多种额外的清洁组合物组分的本发明的酶。另外的组分的选择在普通技术人员技术内并且包括常规成分，包括以下列出的示例性、非限制性组分。

对于纺织品护理，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的纺织品的类型、污物的类型和/或程度、进行清洁时的温度以及洗涤剂产品的配制。尽管根据一种具体的功能性将以下提及的组分通过一般标题进行了分类，但是由于该组分可能具有熟练的业内人士将领会的一种或多种另外的功能，因此不应该将这理解为限制。

洗涤剂组合物可以适于洗涤纺织品，例如像织物、衣服或亚麻布，或用于清洁硬表面，例如像地板、桌子、或餐具洗涤。

本发明的酶-在本发明的一个实施例中，可以将本发明的多肽以对应于以下的量添加至一种洗涤剂组合物中：每升的洗涤液0.0001-200mg的酶蛋白，例如0.0005-100mg的酶蛋白，优选0.001-30mg的酶蛋白，更优选0.005-8mg的酶蛋白，甚至更优选0.01-2mg的酶蛋白。

用于在自动洗碗机(ADW)中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05％-5％的酶蛋白。

用于在洗衣造粒(laundry granulation)中使用的组合物例如可以包含按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05％-5％的酶蛋白。

用于在洗衣液中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-10％，例如0.001％-7％，例如0.1％-5％的酶蛋白。

可以使用常规稳定剂稳定本发明的洗涤剂组合物的一种或多种酶，这些常规稳定剂例如是多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制该组合物。

在某些市场中，不同洗涤条件并且就其本身而言，使用不同类型的洗涤剂。这披露于例如EP 1 025 240中。例如，在亚洲(日本)使用低的洗涤剂浓度体系，而美国使用中等洗涤剂浓度体系，并且欧洲使用高的洗涤剂浓度体系。

低的洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分。日本洗涤剂典型地被认为是低的洗涤剂浓度体系，因为它们具有存在于洗涤水中的大约667ppm的洗涤剂组分。

中等洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在约800ppm与约2000ppm之间的洗涤剂组分。北美洗涤剂通常被认为是中等洗涤剂浓度体系，因为它们具有存在于洗涤水中的大约975ppm的洗涤剂组分。

高的洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在多于约2000ppm的洗涤剂组分。欧洲洗涤剂通常被认为是高的洗涤剂浓度体系，因为在洗涤水中它们具有大约4500-5000ppm的洗涤剂组分。

拉丁美洲洗涤剂通常是高泡沫磷酸盐助洗剂洗涤剂并且在拉丁美洲使用的洗涤剂的范围可以落入中等和高的洗涤剂浓度两者中，因为在洗涤水中它们的洗涤剂组分的范围从1500ppm至6000ppm。此类洗涤剂组合物都是本发明的实施例。

本发明的多肽还可以结合到WO 97/07202中所披露的洗涤剂配制品中，通过引用将其结合在此。

表面活性剂-洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的或其混合物。在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。这种或这些表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％的水平存在，例如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且这种或这些表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。

当包含在其中时，所述去污剂通常将会含有按重量计约1％至约40％，例如约5％至约30％，包括约5％至约15％，或约20％至约25％的阴离子型表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地，直链烷基苯磺酸盐(LAS)，LAS的异构体，支链烷基苯磺酸盐(BABS)，苯基链烷磺酸盐，α-烯烃磺酸盐(AOS)，烯烃磺酸盐，链烯烃磺酸盐，链烷-2,3-二基双(硫酸盐)，羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐，烷基硫酸盐(AS)(例如十二烷基硫酸钠(SDS))，脂肪醇硫酸盐(FAS)，伯醇硫酸盐(PAS)，醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)，仲链烷磺酸盐(SAS)，石蜡烃磺酸盐(PS)，酯磺酸盐，磺化的脂肪酸甘油酯，α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))，烷基琥珀酸或烯基琥珀酸，十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)，氨基酸的脂肪酸衍生物，磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯，以及它们的组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约10％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，例如从约3％至约5％、或从约8％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)，烷基酚乙氧基化物(APE)，壬基酚乙氧基化物(NPE)，烷基多糖苷(APG)，烷氧基化胺，脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)，脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)，乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)，丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)，多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)，或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))，连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约10％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲基氧化胺、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲基氧化胺和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)氧化胺、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约10％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱及其组合。

助水溶剂-助水溶剂是如下化合物，该化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。典型地，助水溶剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性)；然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)(2007)的综述，胶体&界面科学新见(Current Opinion in Colloid&Interface Science)，12:121-128。助水溶剂并不显示临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多助水溶物显示连续类型的聚集过程，其中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包括极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。经典地从制药、个人护理、食品跨行业至技术应用使用助水溶剂。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过除去水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高粘度。

洗涤剂可以包含按重量计0％-5％，例如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。

助洗剂和共助洗剂-该洗涤剂组合物可以包含按重量计约0-65％，例如约5％至约45％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂、或其混合物。在洗涤餐具洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螫合剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为亚氨基二乙醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氨基三乙醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)及其组合。

洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-20％，例如约5％至约10％的洗涤剂共助洗剂或其混合物。洗涤剂组合物可以单独地包括一种共助洗剂，或与一种助洗剂，例如沸石助洗剂组合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂，例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四-(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMPA或DTMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N’,N’-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)及其组合和盐。其他示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中

漂白系统-洗涤剂可以包含按重量计0％-50％，如大约0.1％至大约25％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠、预成型过酸及其混合物。适合的预成型过酸包括但不限于：过氧羧酸及盐，过碳酸及盐，过亚氨酸(perimidic acid)及盐，过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))，及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，这些系统可以包括例如与过酸形成漂白活化剂组合的无机盐，包括碱金属盐，如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。术语漂白活化剂在此意指一种与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。有待在此使用的适合漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰)氧基]苯磺酸钠(ISONOBS)、二过氧月桂酸、4-(十二酰基氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(壬酰基氧基)-苯磺酸盐(NOBS)、和/或披露于WO 98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在储存时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC为洗衣添加剂提供一种良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺、或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包括过酸，例如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。漂白系统还可以包括漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下各项组成：具有下式的有机催化剂：

(iii)及其混合物；其中每个R¹独立地是包含从9至24个碳的支链烷基基团或包含从11至24个碳的直链烷基基团，优选地，每个R¹独立地是包含从9至18个碳的支链烷基基团或包含从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地，每个R¹独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、异-壬基、异-癸基、异-十三烷基和异-十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259以及WO 2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。

聚合物-该洗涤剂可以包含按重量计0％-10％，例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。聚合物可以作为如以上提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油污清洁和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提到的特性和/或多于一种的以下提到的基序(motif)。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修饰CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸乙二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。

织物调色剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如染料或色素，当配制在洗涤剂组合物中时，当所述织物与一种洗涤液接触时织物调色剂可以沉积在织物上，该洗涤液包括所述洗涤剂组合物，并且因此通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括色素。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如描述于WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276和EP 1876226中(将其通过引用而特此结合)。洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是特别优选的。适合的调色剂还披露于例如WO 2007/087257和WO 2007/087243中。

另外的酶-洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包括一种或多种另外的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、过氧化物酶和/或黄原胶裂解酶。

一般而言，一种或多种所选酶的特性应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性，等等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。

纤维素酶：适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰的或蛋白质工程改造的变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳菌属、支顶孢属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢属产生的真菌纤维素酶。

尤其适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，例如在WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK 98/00299中描述的那些。

表现出内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的纤维素酶(EC 3.2.1.4)的实例是已经描述于WO 02/099091中的那些。

纤维素酶的其他实例包括描述于WO 96/29397中的家族45纤维素酶，并且特别是在对应于WO 02/099091的SEQ ID NO:8中的以下位置的一个或多个位置处具有取代、插入和/或缺失的其变体：2、4、7、8、10、13、15、19、20、21、25、26、29、32、33、34、35、37、40、42、42a、43、44、48、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、70、72、76、79、80、82、84、86、88、90、91、93、95、95d、95h、95j、97、100、101、102、103、113、114、117、119、121、133、136、137、138、139、140a、141、143a、145、146、147、150e、150j、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160c、160e、160k、161、162、164、165、168、170、171、172、173、175、176、178、181、183、184、185、186、188、191、192、195、196、200、和/或20，优选选自P19A、G20K、Q44K、N48E、Q119H或Q146R。

可商购的纤维素酶包括Celluzyme^TM、和Carezyme^TM(诺维信公司(Novozymes A/S))、Clazinase^TM、和Puradax HA^TM(杰能科国际有限公司(Genencor International Inc.))、以及KAC-500(B)^TM(花王株式会社(Kao Corporation))。

蛋白酶：另外的酶可以是另一种蛋白酶或蛋白酶变体。该蛋白酶可以是动物、植物或微生物来源的，包括化学或基因修饰的变体。优选微生物来源。它可以是一种碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶的蛋白酶可以例如是来自例如家族M4、M5、M7或M8的嗜热菌蛋白酶。

术语“枯草杆菌酶”是指根据斯艾森(Siezen)等人，蛋白质工程学(Protein Engng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白质科学(Protein Science)6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚组。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。在本发明的一个方面，该蛋白酶可以是一种枯草杆菌酶，例如枯草杆菌蛋白酶或其变体。另外，枯草杆菌酶(以及丝氨酸蛋白酶)的特征为除了丝氨酸以外，还具有两个活性位点氨基酸残基，即一个组氨酸和一个天冬氨酸残基。

枯草杆菌蛋白酶的实例是来源于芽孢杆菌的那些，如枯草杆菌蛋白酶lentus、芽孢杆菌lentus、枯草杆菌蛋白酶Novo、嘉士伯枯草杆菌蛋白酶(subtilisin Carlsberg)、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279中)以及蛋白酶PD138(WO 93/18140)。另外的丝氨酸蛋白酶实例描述于WO 98/020115、WO 01/44452、WO 01/58275、WO 01/58276、WO 03/006602以及WO 04/099401中。枯草杆菌酶变体的实例可以是在任何以下位置上具有突变的那些：使用BPN’编号的3、4、9、15、27、36、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、217、218、222、232、235、236、245、248、252以及274。更优选的枯草杆菌酶变体可以包括以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN'编号)。另外的优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在(例如)WO 95/23221中所述)、以及其变体(在WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中描述的)。

胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)，以及在WO 89/06270和WO 94/25583中描述的镰孢属蛋白酶。有用的蛋白酶的实例是如WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946所描述的变体，特别是在下述位置中的一个或多个处发生取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、以及274。

金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993中的中性金属蛋白酶。

优选的可商购的蛋白酶酶类包括Alcalase^TM、Coronase^TM、Duralase^TM、Durazym^TM、Esperase^TM、Everlase^TM、Kannase^TM、Liquanase^TM、Liquanase Ultra^TM、Ovozyme^TM、Polarzyme^TM、Primase^TM、Relase^TM、Savinase^TM和Savinase Ultra^TM(诺维信公司(Novozymes A/S))，Axapem^TM(Gist-Brocases N.V.公司)，BLAP和BLAP X(Henkel AG&Co.KGaA)，Excellase^TM、FN2^TM、FN3^TM、FN4^TM、Maxaca^TM、Maxapem^TM、Maxatase^TM、Properase^TM、Purafast^TM、Purafect^TM、Purafect OxP^TM、Purafect Prime^TM和Puramax^TM(杰能科有限公司(Genencor int.))。

脂肪酶和角质酶：适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的变体酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如如描述于EP 258068和EP 305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO 96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔氏菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218272)、洋葱假单胞菌(EP 331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720&WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO 10/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US 5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 11/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO 11/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO 11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO 12/137147)。

另外的实例是有时被称为酰基转移酶或过水解酶(perhydrolase)的脂肪酶，例如与南极假丝酵母脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)、以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体，特别是用于在来自亨斯迈纺织染化私人有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业化产品Gentle Power Bleach(柔和漂白剂)中使用的S54V变体(WO 10/100028)。

其他实例是脂肪酶变体，例如描述于EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中的那些。

优选的商业化脂肪酶产品包括Lipolase^TM、Lipex^TM；Lipolex^TM和Lipoclean^TM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。

淀粉酶-淀粉酶可以是α-淀粉酶，β-淀粉酶或葡糖淀粉酶，并且可以是细菌或真菌来源的。包括经化学修饰的或蛋白质工程改造的变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如GB 1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌具体株系的α-淀粉酶。

淀粉酶的实例是具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:3的那些或与SEQ ID NO:3具有90％序列一致性的其变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在WO 95/10603中的SEQ ID NO:3的一个或多个以下位置处具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。

可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。

其他淀粉酶实例是包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或具有90％序列一致性的其变体。此杂合α-淀粉酶的优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：

M197T；

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或

G48+T49+G107+H156+A181+N190+I201+A209+Q264。

另外的淀粉酶实例是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特别优选的淀粉酶是在位置G182和H183或位置H183和G184中具有缺失的那些。

另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的优选变体是在以下位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在位置182和183或位置183和184中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476中具有取代的那些。

可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815中的SEQ ID NO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列一致性或与WO 01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列一致性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。

可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 09/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ ID NO:2具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:2的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQ ID NO:2的最优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K，和/或在位置R180和/或S181具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中该变体任选地进一步在位置243处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。

淀粉酶的其他实例是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ ID NO:12具有至少90％，例如至少95％序列一致性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的一个或多个以下位置中具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有R118K、N195F、R320K及R458K的取代的变体，以及另外在选自下组的一个或多个位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。

可商购的淀粉酶是Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM、Stainzyme^TM、Stainzyme Plus^TM、Natalase^TM和BAN^TM(诺维信公司)，Rapidase^TM和Purastar^TM(来自杰能科国际有限公司)。

过氧化物酶/氧化酶：适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰的或蛋白质工程改造的变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。

可商购的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(诺维信公司)。

该一种或多种酶可以通过添加包含一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等，优选的洗涤剂添加剂剂型为颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或者浆液。

非尘颗粒可以例如如在US 4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡状包衣材料的实例为具有1000至20000的平均摩尔重量的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有从16至50个环氧乙烷单元的乙氧化壬基苯酚；乙氧化脂肪醇，其中该醇包含从12至20个碳原子，并且其中具有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯以及甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制品可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中披露的方法来制备。

辅料-还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物整理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污垢助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独抑或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术内。

分散剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体地说，粉状洗涤剂可以包括分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。适合的分散剂例如描述于粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列(Surfactant Science Series)，第71卷中，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker)。

染料转移抑制剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，染料转移抑制剂可以按组合物重量计的以下水平存在：从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％。

荧光增白剂：本发明的洗涤剂组合物将优选地还包含另外的组分，这些组分可以给正在清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨芪-磺酸衍生物型的实例包括以下各项的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙胺基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐以及2-(芪基(stilbyl)-4"-萘-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸盐。优选的荧光增白剂是可从汽巴-嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的Parawhite KX，由派拉蒙矿物与化学(Paramount Minerals and Chemicals)，孟买，印度供应。适合用于在本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。适合的荧光增亮剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。

污物释放聚合物：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污垢释放聚合物，这些聚合物帮助从织物(如棉布和基于聚酯的织物)移除污物，特别是从基于聚酯的织物移除疏水性污物。污垢释放聚合物可以例如是非离子型或阴离子型对苯二甲酸基聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker，Inc.)。另一种类型的污垢释放聚合物是包括核心结构和连接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO 2009/087523中详细描述的(将其通过引用而特此结合)。此外，任意接枝共聚物是适合的污物释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856以及WO 2006/113314中(将其通过引用而特此结合)。其他污垢释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如改性纤维素衍生物，例如EP 1867808或WO 2003/040279中描述的那些(将二者都通过引用而特此结合)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子改性的纤维素、非离子改性的纤维素、阳离子改性的纤维素、兼性离子改性的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。

抗再沉积剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、和乙氧基化的聚乙亚胺。以上在污垢释放聚合物下描述的纤维素基聚合物还可以用作抗再沉积剂。

其他适合的辅料包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。

洗涤剂产品的配制

本发明的洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如条、均匀的片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个室的袋、规则的或压缩的粉末、颗粒、膏、凝胶、或规则的、压缩的或浓缩的液体。存在多种洗涤剂配制品形式，例如层(相同或不同相)、袋以及用于机械给料装置的形式。

可以将小袋配置为单一隔室或多隔室。它可以具有适合保存该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积的水溶性膜制成。可以将所述内体积分为袋的室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料，优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物和羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，在膜中的聚合物(例如PVA)的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混物组合物，该共混物组合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由美国印第安纳州盖里(Gary,Ind.，US)的克里斯克拉夫特工业产品公司(Chris Craft In.Prod.)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在构成上可以与包含固体的室不同。参考：(US 2009/0011970 A1)。

可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。由此可以避免组分之间的负面的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。

非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。含水液体或凝胶洗涤剂可以包含从0-30％的有机溶剂。液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。

本发明的酶可以被添加至洗衣皂条中并且用于手洗洗衣、织物和/或纺织品。术语洗衣皂条包括洗衣条、皂条、组合条(combo bar)、合成洗涤剂条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于它们包含的表面活性剂的类型，并且术语洗衣皂条包括包含来自脂肪酸的皂和/或合成皂的那些。洗衣皂条具有在室温下为固体而非液体、凝胶或粉末的物理形式。术语固体被定义为不随时间推移显著改变的实体形式，即如果将一个固体物件(例如洗衣皂条)放置在一种容器内，那么该固体物件不会改变以填充放置该固体物件的容器。该条是典型地呈条形式但是可以呈其他固体形状、如圆形或卵形的一种固体。

洗衣皂条可以包含一种或多种另外的酶，蛋白酶抑制剂例如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)，硼酸，硼酸盐，硼砂和/或苯基硼酸衍生物例如4-甲酰苯基硼酸，一种或多种肥皂或合成表面活性剂，多元醇例如甘油，pH控制化合物例如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸，和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中该一价阳离子可以是例如Na⁺、K⁺或NH₄⁺并且该有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，这样使得一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。

洗衣皂条还可以包含络合剂像EDTA和HEDP，香料和/或不同类型的填充剂，表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂，助洗剂，聚合的污垢释放剂，洗涤剂螯合剂，稳定剂，填充剂，染料，着色剂，染料转移抑制剂，烷氧基化的聚碳酸酯，抑泡剂，结构剂，粘合剂，浸出剂，漂白活化剂，粘土去污剂，抗再沉积剂，聚合分散剂，增白剂，织物柔软剂，香料和/或本领域已知的其他化合物。

洗衣皂条可以在常规的洗衣皂条制造设备中进行加工，例如但不限制于：混合器、压条机例如双级真空压条机、挤出机、切割机、标识压模机(logo-stamper)、冷却隧道以及包装机。本发明不局限于通过任何单一方法制备洗衣皂条。可以在过程的不同阶段向肥皂中添加本发明的预混料。例如，可以制备包含肥皂、酶、任选地一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂以及一价阳离子和有机阴离子的盐的预混料并且然后将该混合物压条。可以同时添加作为例如处于液态的蛋白酶抑制剂的酶以及任选的另外的酶。除了混合步骤和压条步骤以外，该工艺还可以进一步包括研磨、挤出、切割、压模、冷却和/或包装的步骤。

用于降解黄原胶的用途

已经将黄原胶用作许多消费品(包括食品和化妆品)中的成分并且已经用于石油工业中。因此，黄原胶的降解可以导致改进的清洁过程，例如更容易除去包含胶质(例如黄原胶)的污物，连同通常用于石油与钻探工业中的黄原胶的降解。因此，本发明针对本发明的内切葡聚糖酶或其组合物用于降解黄原胶的用途。本发明还针对黄原胶裂解酶或其组合物用于降解黄原胶的用途。一个实施例是本发明的内切葡聚糖酶与黄原胶裂解酶一起或其组合物用于降解黄原胶的用途。优选地使用如描述于实例4中的粘度减小测定(ViPr测定)或可替代地如描述于实例5中的还原末端测定测量黄原胶的降解。

在一个实施例中，可以使用如有关黄原胶的在此描述的粘度减小测定测量黄原胶的降解。一个优选实施例是黄原胶(0.25％或0.5％)在缓冲液或水中的用途，其中在5分钟、30分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时或4小时后测量粘度的下降。一个更优选的实施例是黄原胶(0.25％)在水中的用途，其中在3小时后测量粘度的下降。

当使用粘度减小测定时，用于降解黄原胶的粘度的下降是至少200Pa。当使用粘度减小测定时，用于降解黄原胶的粘度的下降是至少250Pa。当使用粘度减小测定时，用于降解黄原胶的粘度的下降是至少300Pa。当使用粘度减小测定时，用于降解黄原胶的粘度的下降是至少350Pa。当使用粘度减小测定时，用于降解黄原胶的粘度的下降是至少400Pa。当使用粘度减小测定时，用于降解黄原胶的粘度的下降是至少450Pa。当使用粘度减小测定时，用于降解黄原胶的粘度的下降是至少500Pa。当使用粘度减小测定时，用于降解黄原胶的粘度的下降是至少550Pa。当使用粘度减小测定时，用于降解黄原胶的粘度的下降是至少600Pa。

可替代地，可以使用由莱韦尔(Lever)(1972)，分析生物化学(Anal.Biochem.)47:273-279,1972研发的比色测定通过用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶上的还原末端测量黄原胶降解活性。一个优选实施例是用黄原胶裂解酶预处理的0.1％黄原胶的用途。可以通过计算空白与样品之间的差异确定用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶的降解，其中大于0.1mAU、大于0.15mAU、大于0.2mAU、大于0.25mAU、大于0.5mAU，优选大于0.6mAU，更优选大于0.7mAU或甚至更优选大于0.8mAU的差异显示用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶的降解。

在去污剂中的用途

本发明针对本发明的内切葡聚糖酶或其组合物在清洁过程中的用途，例如纺织品和织物的湿洗，例如家用衣物洗涤和工业衣物洗涤，以及家用和工业硬表面清洁，例如餐具洗涤。可以将本发明的内切葡聚糖酶添加至包括一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂组合物中。

一个实施例是本发明的内切葡聚糖酶连同黄原胶裂解酶或其组合物在清洁过程中的用途，例如纺织品和织物的湿洗(例如家用衣物洗涤和工业衣物洗涤)以及家用和工业硬表面清洁，例如餐具洗涤。可以将本发明的内切葡聚糖酶连同黄原胶裂解酶添加至包括一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂组合物中。

可以将本发明的多肽添加至洗涤剂组合物中并且因此变成洗涤剂组合物的组分。本发明的洗涤剂组合物可以配制为例如用于家用和工业衣物清洁两者的手洗或机洗衣物洗涤剂组合物，包括适用于预处理有污物的织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物软化剂组合物，或者配制为用于一般家用或工业硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或者配制用于手洗或机洗(家用和工业两者)餐具洗涤操作。在一个特定的方面中，本发明提供了一种洗涤剂添加剂，该添加剂包括如在此描述的本发明的多肽。

在一个实施例中，可以如WO 2013/167581中所述使用AMSA关于黄原胶与碳黑小块布样测量ΔInt酶值。一个优选实施例是黄原胶与碳黑(DN31、DN31C或DN31D)小块布样在20℃或40℃下的使用。一个更优选的实施例是黄原胶与碳黑(DN31C或DN31D)小块布样在40℃下的使用。一个甚至更优选的实施例是黄原胶与碳黑(DN31D)小块布样在40℃下的使用。用于对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的内切葡聚糖酶和用于黄原胶裂解酶的优选的酶浓度分别为0.5mg EP/L和1.0mg EP/L。

如通过AMSA所确定，黄原胶与碳黑小块布样的δ强度值是至少3个单位。如通过AMSA所确定，黄原胶与碳黑小块布样的δ强度值是至少3.5个单位。如通过AMSA所确定，黄原胶与碳黑小块布样的δ强度值是至少4个单位。如通过AMSA所确定，黄原胶与碳黑小块布样的δ强度值是至少4.5个单位。如通过AMSA所确定，黄原胶与碳黑小块布样的δ强度值是至少5个单位。如通过AMSA所确定，黄原胶与碳黑小块布样的δ强度值是至少5.5个单位。如通过AMSA所确定，黄原胶与碳黑小块布样的δ强度值是至少6个单位。如通过AMSA所确定，黄原胶与碳黑小块布样的δ强度值是至少7个单位。如通过AMSA所确定，黄原胶与碳黑小块布样的δ强度值是至少8个单位。如通过AMSA所确定，黄原胶与碳黑小块布样的δ强度值是至少9个单位。如通过AMSA所确定，黄原胶与碳黑小块布样的δ强度值是至少10个单位。

在一个实施例中，可以如WO 2013/167581中所述使用MiniMUM测定关于黄原胶与碳黑小块布样测量ΔRem酶值。一个优选实施例是黄原胶与碳黑(DN31、DN31C或DN31D)小块布样在20℃或40℃下的使用。一个更优选的实施例是黄原胶与碳黑(DN31C或DN31D)小块布样在40℃下的使用。一个甚至更优选的实施例是黄原胶与碳黑(DN31D)小块布样在40℃下的使用。优选地在460nm处测量反射值。用于对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的内切葡聚糖酶和用于黄原胶裂解酶的优选酶浓度分别为0.5mg EP/L和1.0mg EP/L。

如通过MiniLOM所确定，黄原胶与碳黑小块布样的ΔRem酶值是至少1.5个单位。如通过MiniLOM所确定，黄原胶与碳黑小块布样的ΔRem酶值是至少1.75个单位。如通过MiniLOM所确定，黄原胶与碳黑小块布样的ΔRem酶值是至少2个单位。如通过MiniLOM所确定，黄原胶与碳黑小块布样的ΔRem酶值是至少2.25个单位。如通过MiniLOM所确定，黄原胶与碳黑小块布样的ΔRem酶值是至少2.5个单位。如通过MiniLOM所确定，黄原胶与碳黑小块布样的ΔRem酶值是至少2.75个单位。如通过MiniLOM所确定，黄原胶与碳黑小块布样的ΔRem酶值是至少3个单位。如通过MiniLOM所确定，黄原胶与碳黑小块布样的ΔRem酶值是至少3.5个单位。如通过MiniLOM所确定，黄原胶与碳黑小块布样的ΔRem酶值是至少4个单位。如通过MiniLOM所确定，黄原胶与碳黑小块布样的ΔRem酶值是至少4.5个单位。如通过MiniLOM所确定，黄原胶与碳黑小块布样的ΔRem酶值是至少5个单位。

本发明还涉及用于降解纺织品的表面或硬表面上的黄原胶的方法，这些方法包括向黄原胶施用包括一种或多种本发明的内切葡聚糖酶的组合物。本发明进一步涉及用于降解纺织品的表面或硬表面上的黄原胶的方法，这些方法包括向黄原胶施用包括一种或多种黄原胶裂解酶的组合物。一个实施例是一种用于纺织品的表面或硬表面上的降解黄原胶的方法(例如餐具洗涤)，该方法包括向黄原胶施用包括一种或多种本发明的内切葡聚糖酶连同一种或多种黄原胶裂解酶的组合物。一个实施例是包括如在此描述的一种或多种洗涤剂组分的组合物。

在地下地层的压裂(石油和/或气体钻探)中的用途

使用水力压裂来创造自钻孔延伸至岩层的地下压裂，以便增加通过地层可以产生的流体的流速。通常，将高粘度压裂液以足够压裂地下地层的压力泵入井中。为了维持向地层的增加的暴露，将固体支撑剂添加至压裂液中，通过施加至流体的高压将其带进压裂处。一旦高粘度压裂液将该支撑剂带进地层中，破碎物用于减少流体的粘度，这允许该支撑剂停留在压裂处中并且由此增加地层向井的暴露。破碎物通过减少聚合物的分子量而工作，以此方式‘破碎’或降解聚合物。压裂处然后变为一种高渗透性管道，用于有待产生的流体和空气回至井中。此类过程进一步披露于美国专利号7,360,593、5,806,597、5,562,160、5,201,370以及5,067,566中。

因此，本发明涉及本发明的内切葡聚糖酶作为酶破碎物的用途。本发明的一个实施例是本发明的内切葡聚糖酶连同黄原胶裂解酶作为酶破碎物的用途。

因此，本发明提供了一种用于破碎钻井孔中的黄原胶的方法，该方法包括：(i)将包括水性流体的可胶凝压裂液、一种或多种能水合的聚合物、用于交联能水合的聚合物以形成一种聚合物凝胶的适合的交联剂，以及一种或多种本发明的酶(即，酶破碎物)共混在一起；(ii)将交联聚合物凝胶在足够压裂周围地层的压力下泵入钻井孔中；并且(iii)允许酶破碎物降解交联聚合物，以减少流体的粘度，这样使得可以将流体从地层泵回至井表面。因此，本发明的内切葡聚糖酶可以用于控制压裂液的粘度。此外，一种或多种本发明的内切葡聚糖酶连同一种或多种黄原胶裂解酶可以用于控制压裂液的粘度。

本发明的酶破碎物可以是压裂液或破碎物-交联剂-聚合物复合物的一种成分，该压裂液或复合物进一步包括一种能水合的聚合物和一种交联剂。压裂液或复合物可以是一种凝胶或可以是可胶凝化的。该复合物在以下方法中是有用的，该方法用于在一种压裂液中使用该复合物以将钻井孔周围的地下地层压裂，这是通过在足够将周围的地下地层压裂的压力下将该流体泵至钻井孔中的所希望的位置。该复合物可以通过维持特定条件的pH和温度来维持基本上非反应的状态，直到该流体被放置在钻井孔中的时刻并且完成所希望的压裂。一旦压力完成，该复合物维持无活性的特定条件便不再维持。当这些条件显著变化时，该复合物变得有活性并且破碎物开始催化聚合物降解，从而导致压裂液变得足够流动，以从地下地层泵至井表面。

降解黄原胶的方法，其中黄原胶用于压裂由钻井孔形成的地下地层

当钻井时，储层钻井液(RDF)在钻探设备内循环以冷却并清洁钻头，除去钻井孔外的钻屑，减少钻柱与钻孔的侧边之间的摩擦力，并且形成滤饼以便阻止流体渗漏进入地层中。用于形成滤饼的驱动力是应用以维持钻孔稳定性的较高的钻井孔压力。这一滤饼限制储层流体在钻探以及完井设备的放置过程中流入钻井孔。如果在井竣工之前或过程中未除去在钻探过程中造成的滤饼损伤，则当该井投入生产时可以出现一系列问题，即完井设备失败和受损的储层生产力。

钻井液(泥浆)(也称为储层钻井液(RDF))可以是合成/油基的或水基的。为了使钻井液对地层的侵入最小化，油基和水基泥浆滤饼两者都典型地包含一种桥接剂或增重剂，通常是碳酸钙颗粒、重晶石或两者的混合物，其桥接在地层的孔喉处并且由此形成相对低渗透性滤饼。油基和水基泥浆滤饼两者还都包含在钻探过程中带出的称作钻屑的固体，与添加在钻井液的配制品中的桥接/增重剂截然相反。这些固体可以是石英(砂)、粉砂和/或页岩，取决于储层地层以及由钻探路径至储层穿过的地层。另外，油基钻井泥浆包含陷于滤饼的孔域中的水滴，而水基泥浆滤饼包含聚合物，例如淀粉和黄原胶，以及其他无机盐。

形成泥浆滤饼对于钻探而言通常是必须的，特别是在具有钻井孔稳定性问题并且典型地具有高渗透性的疏松地层中。然后将滤饼用不同化学品处理，例如螯合剂或酸，以溶解方解石组分；和/或酶或氧化剂，以降解聚合物组分，从而恢复渗透性。

在一个方面中，本发明提供了一种用于降解黄原胶的方法，其中黄原胶用于压裂由钻井孔造成的地下地层，该方法是通过应用包括一种或多种本发明的酶的组合物。该方法可以包括以下步骤：(i)将包括一种或多种本发明的酶的处理流体泵入与有待去除的滤饼接触的钻孔中，以在该处理流体与邻接该滤饼的地层之间建立不同的压力并且(ii)在不同的压力周期过程中均匀地传播滤饼的处理，以通过该处理流体延迟突破。

在一个实施例中，该方法包括在地层与钻孔之间通过处理的滤饼建立渗透性。在另一个实施例中，该滤饼可以包括钻井固体和黏土，并且可以形成自水性钻井液。如果希望的话，用于处理水性钻井液滤饼的处理流体还可以包括氧化剂和/或螯合剂，或它可以是基本上不含螯合剂和氧化剂添加剂的。在另一个实例中，该滤饼可以形成自油或反相乳化钻井液。如果希望的话，用于处理油或反相乳化钻井液滤饼的处理流体还可以包括互溶溶剂、水润湿剂或其组合，以将疏水性组分分散在滤饼中。

在一个实施例中，该处理流体包括一种或多种本发明的内切葡聚糖酶。在另一个实施例中，该处理流体包括一种或多种黄原胶裂解酶。在一个优选实施例中，该处理流体包括一种或多种内切葡聚糖酶以及一种或多种黄原胶裂解酶。

降解黄原胶的方法，其中黄原胶是钻孔滤饼中的一种组分

在一个方面中，本发明提供了一种一旦钻孔滤饼被泵至表面，用于清洁该滤饼的方法，该滤饼包括聚合物，例如黄原胶和钻井液固体。钻井泥浆从泥浆池泵至钻头然后再泵出至表面，在该过程中带出除其他东西之外的破碎的或切碎的岩石(钻屑)。将钻屑滤出并且将泥浆返回至泥浆池，在泥浆池中细粒可以沉淀和/或可以将添加化学品或酶(破碎物)进行添加。

用于降解黄原胶的方法(其中黄原胶是钻孔滤饼中的一种组分)可以包括以下步骤：(i)用一种处理流体处理该钻孔滤饼，该处理流体包括一种或多种本发明的酶并且(ii)将固体与流体分离。在一个实施例中，该处理流体包括一种或多种本发明的内切葡聚糖酶。在另一个实施例中，该处理流体包括一种或多种黄原胶裂解酶。在一个优选实施例中，该处理流体包括一种或多种本发明的内切葡聚糖酶以及一种或多种黄原胶裂解酶。

可以将钻孔滤饼在泥浆池中用一种或多种本发明的酶处理并且可以再循环钻井液。可替代地，一旦滤饼已经被一种或多种本发明的酶处理，使用固液分离方法(例如离心)将固体与流体分离。

在纤维素材料加工中的用途。

本发明多肽的内切葡聚糖酶活性也可用于降解或转化纤维素材料，包括：用包含本发明多肽的酶组合物处理纤维素材料。在一个优选方面，该方法进一步包括对降解的或转化的纤维素材料进行回收。

本发明还涉及产生一种发酵产物的方法，这些方法包括：(a)在本发明的多肽的存在下，用一种酶组合物使纤维素材料糖化；(b)用一种或多种(若干种)发酵微生物发酵糖化的纤维素材料，以产生该发酵产物；并且(c)从发酵中回收该发酵产物。

本发明还涉及对纤维素材料进行发酵的方法，该方法包括用一种或多种(若干种)发酵微生物对纤维素材料进行发酵，其中纤维素材料是在本发明的多肽的存在下用酶组合物进行糖化。在一个优选方面，发酵该纤维素材料产生一种发酵产物。在另一个优选方面，该方法进一步包括从发酵中回收发酵产物。

本发明的方法可被用于将一种纤维素材料糖化成可发酵糖，并且将这些可发酵糖转化成许多有用的物质，例如燃料、饮用乙醇、和/或发酵产物(例如酸类、醇类、酮类、气体等)。由该纤维素材料产生所希望的发酵产物典型地涉及预处理、酶水解(糖化)、以及发酵。

根据本发明，可以使用本领域常规的过程来完成纤维素材料的加工。此外，可以使用被配置为根据本发明进行操作的常规生物质加工装置来实施本发明的方法。

分开或同时的水解(糖化)和发酵包括但不限于：分开水解和发酵(SHF)、同时糖化和发酵(SSF)、同时糖化和共发酵(SSCF)、杂合的水解和发酵(HHF)、分开水解和共发酵(SHCF)、杂合的水解和共发酵(HHCF)，以及直接微生物转化(DMC)。

常规装置可以包括补料分批搅拌反应器、分批搅拌反应器、具有超过滤的连续流搅拌反应器、和/或连续活塞流动柱反应器(柯瑞芝(Corazza)等人，2003，用于纤维二糖水解的补料分批反应器中的最佳控制(Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis)，技术学报(Acta Scientiarum.Technology)25:33-38；古萨科夫(Gusakov)和辛涅特西(Sinitsyn)，1985，纤维素酶水解动力学：1.用于分批反应器过程的数学模型(Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose:1.A mathematical model for a batch reactor process)，酶与微生物技术(Enz.Microb.Technol.)7:346-352)，研磨反应器(隆(Ryu)和李(Lee)，1983，通过使用研磨生物反应器，生物转化废物纤维素(Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor)，生物技术和生物工程(Biotechnol.Bioeng)25:53-65)，或具有电场诱导的有力搅拌的反应器(古萨科夫(Gusakov)等人，1996，使用具有电场诱导的有力搅拌的新颖类型的生物反应器的纤维素酶水解的增强(Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field)，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)56:141-153)。另外的反应器类型包括：用于水解和/或发酵的流化床反应器、升流层(upflow blanket)反应器、固定化反应器、以及挤出机型反应器。

预处理。在本发明的方法的实践中，可以使用本领域已知的任何预处理方法来破坏植物细胞壁的纤维素材料组分(钱德拉(Chandra)等人，2007，底物预处理：木质纤维素的有效酶水解的关键？(Substrate pretreatment:The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics？)，生物化学工程/生物技术的进展(Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.)108:67-93；盖博(Galbe)和小林(Zacchi)，2007，用于高效生物乙醇生产的木质纤维素材料的预处理(Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production)，生物化学工程/生物技术的进展108:41-65；亨德里克斯(Hendriks)和季曼(Zeeman)，2009，用以增强木质纤维素生物质的消化性的预处理(Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass)，生物资源技术(Bioresource Technol.)100:10-18；莫热(Mosier)等人，2005，用于木质纤维素生物质的预处理的有前景技术的特征(Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass)，生物资源技术96:673-686；塔希尔扎德(Taherzadeh)和卡里米(Karimi)，2008，预处理木质纤维素废弃物以改善乙醇和生物气体产生：综述(Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production:A review)，分子科学国际杂志(Int.J.of Mol.Sci.)9:1621-1651；杨(Yang)和怀曼，2008，预处理：释放低成本纤维素乙醇的关键(Pretreatment:the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol)，生物燃料、生物产品与生物精炼(Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.)2:26-40)。

纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行颗粒粒度减小、预浸泡、润湿、洗涤或调理。

常规预处理包括但不限于：蒸汽预处理(伴随或不伴随爆炸)、稀酸预处理、热水预处理、碱预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理、以及生物预处理。另外的预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO₂、超临界H₂O、臭氧、以及γ辐射预处理。

可以在水解和/或发酵之前对纤维素材料进行预处理。优选在水解前进行预处理。可替代地，预处理可以与酶水解同时进行，以释放可发酵的糖，例如葡萄糖、木糖、和/或纤维二糖。在多数情况下，预处理步骤自身导致将生物质转化为可发酵糖(即使在没有酶的情况下)。

蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁组分，包括木质素、半纤维素、以及纤维素，以使酶可接触纤维素和其他级分，例如，半纤维素。使纤维素材料经过或通过反应容器，其中注入蒸汽以将温度增加至所需的温度和压力，并且在其中保持所希望的反应时间。蒸汽预处理优选在140℃-230℃，更优选160℃-200℃，并且最优选170℃-190℃进行，其中最优的温度范围依赖于任何化学催化剂的添加。蒸汽预处理的停留时间优选1-15分钟，更优选3-12分钟，并且最优选4-10分钟，其中最优的停留时间依赖于温度范围和任何化学催化剂的添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，这样使得纤维素材料在预处理过程中通常仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的材料的爆发放料(explosive discharge)合并，这被称为蒸汽爆炸，即，快速急骤蒸发至大气压和材料的湍流，以通过破碎增加可接触的表面积(迪福(Duff)和默里(Murray)，1996，生物资源技术(Bioresource Technology)855:1-33；盖尔贝(Galbe)和赛琪(Zacchi)，2002，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)59:618-628；美国专利申请号20020164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基被裂解，并且所得到的酸自催化半纤维素部分水解成单糖和寡糖。仅在有限的程度上去除木质素。

经常在蒸汽预处理之前添加一种催化剂(例如H₂SO₄或SO₂)(典型地是0.3至3％w/w)，该催化剂减少时间并降低温度、增加回收率、并改进酶水解(巴列斯特罗斯(Ballesteros)等人，2006，应用生物化学与生物技术129-132:496-508；瓦尔加(Varga)等人，2004，应用生物化学与生物技术113-116:509-523；塞斯尼尔(Sassner)等人，2006，酶与微生物技术(Enzyme Microb.Technol.)39:756-762)。

化学预处理：术语“化学处理”是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放的任何化学预处理。适合的化学预处理方法的实例包括(例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)、氨渗滤(APR)、以及有机溶剂预处理。

在稀酸预处理中，纤维素材料与稀酸(典型地是H₂SO₄)和水混合，以形成浆料，由蒸汽加热至希望的温度，并且在停留时间后闪变至大气压。可以用许多反应器设计来进行稀酸预处理，例如，活塞流反应器、逆流反应器、或连续逆流收缩床反应器(达夫和默里，1996，见上文，舍尔(Schell)等人，2004，生物资源技术91:179-188；李(Lee)等人，1999，生物化学工程与生物技术的进展65:93-115)。

还可以使用碱性条件下的若干预处理方法。这些碱预处理包括但不限于：石灰预处理、湿氧化、氨渗滤(APR)、以及氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。

用碳酸钙、氢氧化钠、或氨，在85℃-150℃的低温下进行石灰预处理，并且停留时间为从1小时到几天(怀曼(Wyman)等人，2005，生物资源技术(Bioresource Technol.)96:1959-1966；莫热(Mosier)等人，2005，生物资源技术96:673-686)。WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO 2006/110900和WO 2006/110901公开了使用氨的预处理方法。

湿氧化是一种热预处理，其典型地在添加氧化剂(如过氧化氢或过压氧)的情况下在180℃-200℃下持续5-15分钟进行(施密特(Schmidt)和汤姆森(Thomsen)，1998，生物资源技术(Bioresource Technol.)64:139-151；帕罗内(Palonen)等人，2004，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)117:1-17；瓦尔加等人，2004，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)88:567-574；马丁(Martin)等人，2006，化学技术与生物技术杂志(J.Chem.Technol.Biotechnol.)81:1669-1677)。预处理优选以1％至40％干物质，更优选2％至30％干物质，并且最优选5％至20％干物质进行，并且经常通过添加碱如碳酸钠来增加初始pH。

被称为湿爆炸(湿氧化和蒸汽爆炸的组合)的湿氧化预处理方法的修改方案能够处理高达30％的干物质。在湿爆炸中，在某一停留时间后，在预处理过程中引入氧化剂。然后通过急骤蒸发至大气压结束预处理(WO 2006/032282)。

氨纤维爆炸(AFEX)涉及在如90℃-100℃的中等温度和如17至20巴的高压下，用液体或气态氨处理纤维素材料5至10分钟，其中干物质含量可以高达60％(格拉帕里(Gollapalli)等人，2002，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)98:23-35；俊达瓦特(Chundawat)等人，2007，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)96:219-231；阿里扎德(Alizadeh)等人，2005，应用生物化学与生物技术121:1133-1141；泰莫里(Teymouri)等人，2005，生物资源技术(Bioresource Technol.)96:2014-2018)。AFEX预处理导致纤维素的解聚和半纤维素的部分水解。木质素-碳水化合物复合物被裂解。

有机溶剂预处理通过使用含水乙醇(40％-60％乙醇)在160℃-200℃下萃取30-60分钟而将纤维素材料脱木质素(潘(Pan)等人，2005，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)90:473-481；潘等人，2006，生物技术与生物工程94:851-861；库拉比(Kurabi)等人，2005，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)121:219-230)。通常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分半纤维素被去除。

适合的预处理方法的其他实例由谢尔(Schell)等人，2003，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.and Biotechnol.)105-108:69-85，和马塞尔(Mosier)等人，2005，生物资源技术(Bioresource Technology)96:673-686，以及美国公开申请号2002/0164730进行描述。

在一个方面中，化学预处理优选是以酸处理进行，并且更优选持续稀酸和/或弱酸处理。酸通常是硫酸，但也可以使用其他酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢、或其混合物。弱酸处理优选在1-5，更优选1-4，并且最优选1-3的pH范围内进行。在一个方面，该酸浓度在优选从0.01至20wt％酸，更优选0.05至10wt％酸，甚至更优选0.1至5wt％酸，并且最优选0.2至2.0wt％酸的范围中。使酸与纤维素材料相接触，并在优选160℃-220℃，并且更优选165℃-195℃范围内的温度下保持从几秒到几分钟，例如1秒至60分钟范围内的时间。

在另一个方面中，预处理是作为氨纤维爆炸步骤(AFEX预处理步骤)进行。

在另一个方面中，预处理在水性浆料中进行。在优选的方面，在预处理过程中纤维素材料以优选10-80wt％之间，更优选20-70wt％之间，并且最优选30-60wt％之间，例如50wt％左右的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或使用本领域已知的任何方法洗涤，例如，用水洗涤。

机械预处理：术语“机械预处理”是指各种类型的研磨或碾磨(例如，干磨、湿磨、或振动球磨)。

物理预处理：术语“物理预处理”是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素从纤维素材料中分离和/或释放的任何预处理。例如，物理预处理可包括辐射(例如微波辐射)、汽蒸/蒸汽爆炸、水热解及其组合。

物理预处理可以包括高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在一个方面中，高压意指在优选约300至约600psi，更优选约350至约550psi，并且最优选约400至约500psi，例如450psi左右的范围中的压力。在另一个方面中，高温意指在约100℃至约300℃，优选约140℃至约235℃范围内的温度。在一个优选的方面，机械预处理在使用如上所定义的高温和高压的分批过程、蒸汽枪水解器系统，例如来自Sunds Defibrator AB,Sweden的Sunds Hydrolyzer中进行。

组合的物理和化学预处理：纤维素材料可以物理地且化学地预处理。例如，该预处理步骤可包括稀酸或弱酸预处理以及高温和/或高压处理。这些物理预处理和化学预处理可以根据需要顺序地进行或同时进行。也可以包括机械预处理。

因此，在一个优选方面中，使纤维素材料经受机械、化学或物理预处理、或其任何组合，以促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放。

生物预处理：术语“生物预处理”是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素从纤维素材料中分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以涉及应用溶解木质素的微生物(参见，例如，舒·T.-A.(Hsu,T.-A.)，1996，生物质的预处理(Pretreatment of biomass)，生物乙醇手册：生产和利用，怀曼·C.E.编辑，泰勒-弗朗西斯出版集团，华盛顿特区，179-212；高希(Ghosh)和辛格(Singh)，1993，用于纤维素生物质的酶/微生物转化的物理化学与生物处理(Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass)，应用微生物学进展(Adv.Appl.Microbiol.)39:295-333；麦克米兰·J.D.(McMillan,J.D.)，1994，预处理木质纤维素生物质：综述(Pretreating lignocellulosic biomass:a review)，用于燃料生产的生物质的酶转化(Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production)，希默尔·M.E.、贝克·J.O.、以及奥弗伦·R.P.(Overend,R.P.)编辑，美国化学学会讨论会系列566(ACS Symposium Series 566)，美国化学学会(American Chemical Society)，华盛顿特区，第15章；贡·C.S.(Gong,C.S.)、卡奥·N.J.(Cao,N.J.)、杜·J.(Du,J.)、以及曹·G.T.(Tsao,G.T.)，1999，由可再生资源生产乙醇(Ethanol production from renewable resources)，生物化学工程/生物技术的进展，舍佩尔·T.编辑，施普林格出版社德国海德堡柏林(Berlin Heidelberg,Germany)，65:207-241)；奥尔森(Olsson)和哈恩-哈格达尔(Hahn-Hagerdal)，1996，用于乙醇生产的木质纤维素水解物的发酵(Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production)，酶与微生物技术(Enz.Microb.Tech.)18:312-331；以及瓦蓝德(Vallander)和埃里克松(Eriksson)，1990，由木质纤维素材料生产乙醇：技术现状(Production of ethanol from lignocellulosic materials:State of the art)，生物化学工程/生物技术的进展42:63-95)。

糖化。在水解步骤(还称为糖化)中，将(例如预处理的)纤维素材料水解，以将纤维素以及可替代地还有半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶性寡糖。水解由酶组合物在本发明的多肽的存在下酶促进行。该组合物可进一步包括一种或多种(若干种)半纤维素分解酶或木聚糖降解酶。还可顺序地添加这些组合物的酶。

酶水解优选在易于由本领域技术人员确定的条件下、在合适的含水环境中执行。在一个优选方面，水解在适合于一种或多种酶的活性，即对于该一种或多种酶来说最佳的条件下进行。水解可以作为分批补料过程或连续过程进行，其中将预处理的纤维素材料(底物)逐渐补料至例如含酶的水解溶液中。

糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中，在受控的pH、温度和混合条件下进行。适合的处理时间、温度以及pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续长达200小时，但是典型地进行优选约12至约96小时，更优选约16至约72小时，并且最优选约24至约48小时。温度在优选约25℃至约70℃，更优选约30℃至约65℃，并且更优选约40℃至约60℃，特别是约50℃的范围中。pH在优选约3至约8，更优选约3.5至约7，并且最优选约4至约6，特别是约pH 5的范围中。干燥固体含量在优选约5wt％至约50wt％，更优选约10wt％至约40wt％，并且最优选约20wt％至约30wt％的范围中。

该酶组合物优选地包括多种具有纤维素分解活性和/或木聚糖降解活性的酶。在一个方面，该酶组合物包括一种或多种(若干种)纤维素分解酶。在另一个方面，该酶组合物包括一种或多种(若干种)木聚糖降解酶。在另一个方面，该酶组合物包括一种或多种(若干种)纤维素分解酶和一种或多种(若干种)木聚糖降解酶。

该一种或多种(若干种)纤维素分解酶优选是选自下组，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。该一种或多种(若干种)木聚糖降解酶优选是选自下组，该组由以下各项组成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。

在另一个方面，该酶组合物进一步或甚至进一步包括一种具有纤维素分解增强活性的多肽(参见，例如WO 2005/074647、WO 2005/074656、以及WO 2007/089290)。在另一个方面，该酶组合物可进一步或甚至进一步包括一种或多种(若干种)另外的酶活性以改善含纤维素材料的降解。优选的另外的酶是半纤维素酶(例如α-D-葡糖醛酸糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、内切-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、内切-α-L-阿拉伯聚糖酶、β-半乳糖苷酶)、碳水化合物-酯酶(例如乙酰基-木聚糖酯酶、乙酰基-甘露聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、葡萄糖醛酸酯酶)、果胶酶、蛋白酶、木质素分解酶(例如漆酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶、H₂O₂生产酶、氧化还原酶)、棒曲霉素、膨胀素、或其混合物。在本发明的方法中，可以在发酵之前或过程中，例如在糖化过程中，或在发酵微生物的繁殖过程中或之后添加这一种或多种另外的酶。

该酶组合物的一种或多种(若干种)组分可以是野生型蛋白、重组蛋白、或野生型蛋白与重组蛋白的组合。例如，一种或多种(若干种)组分可以是用作宿主细胞以重组表达该酶组合物的一种或多种(若干种)其他组分的细胞的原生蛋白质。该酶组合物的一种或多种(若干种)组分可以作为单组分产生，然后将这些单组分组合以形成该酶组合物。酶组合物可以是多组分和单组分蛋白制剂的组合。

用于本发明的方法中的酶可以处于适合用于此处所述的过程中的任何形式，例如像去除或未去除细胞的粗发酵液、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化的或纯化的酶制剂、或作为酶来源的宿主细胞。酶组合物可以是干粉或颗粒、非尘颗粒、液体、稳定化的液体、或稳定化的受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或其他多元醇)、和/或乳酸或另一种有机酸，对液体酶制剂进行稳定化。

在下面各段中对本发明进行了进一步的概述：

1.一种具有内切葡聚糖酶活性并且对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；

(b)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交；

(c)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；

(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有内切葡聚糖酶活性并且对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性。

2.如段落1所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。

3.如段落1或2所述的多肽，该多肽由如下多核苷酸编码，该多核苷酸在中-高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长补体杂交。

4.如段落1-3中任一项所述的多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。

5.如段落1-4中任一项所述的多肽，该多肽包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的成熟多肽或者由其组成。

6.如段落5所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至846。

7.如段落1-4中任一项所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处(例如多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个位置)包括取代、缺失和/或插入。

8.如段落1至7中任一项所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2的片段，其中该片段具有内切葡聚糖酶活性并且对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性。

9.一种编码如段落1-8中任一项所述的多肽的多核苷酸。

10.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如段落9所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导多肽在表达宿主内产生的一个或多个控制序列。

11.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如段落9所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽产生的一个或多个控制序列。

12.一种产生如段落1-8中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养一种细胞，该细胞处于其野生型形式时产生该多肽。

13.如段落12所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。

14.一种产生具有内切葡聚糖酶活性并对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的多肽的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养如段落11所述的宿主细胞。

15.一种用编码如段落1-8中任一项所述的多肽的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞。

16.一种产生具有内切葡聚糖酶活性并对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的多肽的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养如段落15所述的转基因植物或植物细胞。

17.如段落16所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。

18.一种包括如段落1-8中任一项所述的多肽的全培养液配制品或细胞培养组合物。

19.一种组合物，该组合物包括如段落1-8中任一项所述的多肽。

20.如段落19所述的组合物，该组合物进一步包括具有黄原胶裂解酶活性的多肽。

21.如段落19或20中任一项所述的组合物，该组合物是一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包括一种或多种洗涤剂组分。

22.如段落19-21中任一项所述的组合物，其中这些洗涤剂组分选自下组，该组包括表面活性剂、助洗剂、助水溶剂、漂白系统、聚合物、织物调色剂、辅料、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂以及污垢释放聚合物，或其任何混合物。

23.如段落19-22中任一项所述的组合物，其中该洗涤剂组合物处于以下形式：棒，均匀的片剂，具有两个或更多个层的片剂，具有一个或多个室的袋，规则的或压缩的粉末，颗粒，膏，凝胶，或规则的、压缩的或浓缩的液体。

24.根据段落19-23中任一项所述的组合物用于降解黄原胶的用途。

25.如权段落24所述的用途，用于控制钻井液的粘度。

26.如段落24所述的用途，用于洗涤或清洁纺织品和/或硬表面，例如餐具洗涤。

27.如段落24所述的用途，其中该洗涤剂组合物具有酶洗涤益处。

28.一种用于降解黄原胶的方法，该方法包括向黄原胶应用根据段落19-23中任一项所述的组合物。

29.如段落28所述的方法，其中该黄原胶在纺织品的表面上或硬表面，例如餐具洗涤。

30.如段落28所述的方法，其中该黄原胶在由钻井孔形成的地下地层的压裂中使用。

31.如段落28所述的方法，其中该黄原胶是钻孔滤饼中的组分。

32.一种用于降解或转化纤维素材料的方法，该方法包括：用根据段落19-23中任一项所述的酶组合物或在段落1-8中任一项所述的多肽存在下处理该纤维素材料。

33.如段落32所述的的方法，其中该纤维素材料经过预处理。

34.如段落31或32所述的方法，其中该酶组合物包括选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、或过氧化物酶。

35.如段落34所述的方法，其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。

36.如段落34所述的方法，其中该半纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。

37.如段落32-36中任一项所述的方法，进一步包括回收降解的纤维素材料。

38.如段落37所述的方法，其中该降解的纤维素材料是糖，优选地选自下组，该组由以下各项组成：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖以及阿拉伯糖。

39.一种用于产生发酵产物的方法，该方法包括：

(a)在如段落1-8中任一项所述的多肽的存在下，用酶组合物对纤维素材料进行糖化；

(b)用一种或多种发酵微生物对糖化的纤维素材料进行发酵，以产生该发酵产物；并且

(c)从发酵中回收该发酵产物。

通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。

实例

菌株

浮霉状菌属物种R1菌株从2009年-2012年在俄罗斯联邦收集的环境水样(温泉，46℃-58℃，pH 5.7-7.3)中分离。

培养基和溶液

Ka-Na-酒石酸盐/NaOH缓冲液：将Ka-Na-酒石酸盐(50g)和NaOH(20g)溶解于水中，至总体积为1升。

终止溶液：将PAHBAH(西格玛H-9882)溶解于Ka-Na-酒石酸盐/NaOH溶液中，至浓度为15mg/ml(例如，将500mg PAHBAH溶解于33ml Ka-Na-酒石酸盐/NaOH溶液中)

测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％Triton X-100，调节至pH 3-11

经修饰的黄原胶：基质修饰的黄原胶(mXG)是用可以将末端丙酮酸甘露糖除去的黄原胶裂解酶处理的黄原胶(XG)，并且使用改编的Nankai，Hashimoto等人1999，环境微生物(Environ.Microbiol)65(6):2520-2526：在2L烧杯中将2.5g的黄原胶(CP Kelco)用5mL的96％乙醇润湿。添加500mL的100mM ACES缓冲液pH 7.00，并将溶液在环境温度下搅拌2h。添加250μL的黄原胶裂解酶(Megazyme产品E-XANLB，芽孢杆菌属物种)，将该溶液在50℃孵育20h。在水解后，在搅拌下将1400mL的96％乙醇添加到500mL样品中。发生沉淀，并且在约5min后，倾析出乙醇，由此除去丙酮酸化的甘露糖残基。将500mL的96％乙醇再次添加到剩余的溶液中，并在任何沉淀后倾析。将样品在Whatman过滤器GF/C上在蒸发漏斗上干燥。将过滤器在50℃下干燥20h。收集样品，研磨并通过300μM筛分过筛。

实例1：浮霉状菌属内切葡聚糖酶编码基因的鉴定

将浮霉状菌属物种菌株R1进行基因组测序，并鉴定了编码推定的分泌蛋白(SEQ ID NO:1)的开放阅读框。针对Pfam数据库的Blast搜索(M.帕他(M.Punta)，P.C.柯吉尔(P.C.Coggill)，R.Y.埃博哈特(R.Y.Eberhardt)，J.密斯崔(J.Mistry)，J.特特(J.Tate)，C.保尔瑟尔(C.Boursnell)，N.潘(N.Pang)，K.福斯兰德(K.Forslund)，G.格瑞克(G.Ceric)，J.克里门特(J.Clements)，A.海格(A.Heger)，L.霍尔姆(L.Holm)，E.L.L.索恩哈默(E.L.L.Sonnhammer)，S.R.艾迪(S.R.Eddy)，A.比特曼(A.Bateman)，R.D.费恩(R.D.Finn.)Pfam:蛋白质家族数据库(the protein families database.)核酸研究(Nucleic Acids Research)(2014)数据库卷(Database Issue)42:D222-D230)鉴定了非常遥远相关的Pfam PF00150结构域(SEQ ID NO:2，残基93..229)，具有21.1％的序列一致性和22.2的HMM得分，恰好高于由Pfam定义的噪声水平。此外，发现PF00150结构域仅是部分的，跨越在定义为Pfam服务器(pfam.sanger.ac.uk)的管理和模型信息的281个中的137个残基。此外，鉴定了具有25.4％的序列一致性和40.4的HMM得分的PF02018结构域(SEQ ID NO 2，残基284至413)。PF00150的假定的催化结构域由β链四和七的羧基末端附近的两个谷氨酸组成，一个作为质子供体，另一个作为亲核体(吉克斯J(Jenkins J)，罗乐格L(Lo Leggio L)，哈瑞斯G(Harris G)和皮克斯吉尔RPickersgill R)β-葡糖苷酶，β-半乳糖苷酶，A家族纤维素酶，F家族木聚糖酶和两种大麦聚糖酶形成具有8倍β/α结构的酶的超家族，并且在β链四和七的羧基末端附近具有两个保守的谷氨酸，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)1995年4月10日；362(3):281-5)。推定的谷氨酸质子供体(E229)存在于部分PF00150结构域中，并且推定的亲核体(E566)位于PF02018结构域之后。这表明PF02018结构域已经被引入谷氨酸催化残基之间，导致新的结构域结构。

实例2：来自浮霉状菌属的内切葡聚糖酶的克隆和表达

鉴定内切葡聚糖酶基因的编码部分的成熟肽(SEQ ID NO:1中的位置82至2619)并插入大肠杆菌中。从大肠杆菌转化体纯化含有插入片段的表达质粒，并转化到米曲霉宿主细胞中。使转化的宿主细胞在液体培养基中生长。收集上清液，并且通过疏水相互作用层析，凝胶过滤和阴离子交换层析的组合来纯化酶。

使用N-末端测序，发现成熟肽的主要部分开始于ATPGKLF。成熟肽的次要部分具有N-末端序列TPGKLFP。

实例3：来自浮霉状菌属的纯化的内切葡聚糖酶的表征

AZCL-HE-纤维素(交联的和染色的纤维素)测定用于检测内切葡聚糖酶活性并且用于获得pH-活性曲线，温度-活性曲线以及底物特异性曲线。通过温和搅拌将1％AZCL-HE-纤维素(来自麦格酶公司(Megazyme))悬浮在0.01％Triton X-100中。将200微升该悬浮液和200微升测定缓冲液在微量离心管中混合并置于冰上。添加20微升内切葡聚糖酶样品。通过将微量离心管转移至设定为测定温度的恒温混合器来开始测定。将管在恒温混合器上以其最高振荡速率(1400rpm)孵育达60min。通过将微量离心管转移回冰浴停止孵育。然后将微量离心管在冰冷的离心机中离心2min，将200微升上清液转移至微量滴定板并读取OD₅₉₀。在该测定中包括空白缓冲液。使用ΔOD₅₉₀＝OD₅₉₀(酶)-OD₅₉₀(缓冲液)来测量内切葡聚糖酶活性。

不同测定条件

温度：30℃-80℃

底物：AZCL-HE-纤维素，AZCL-普鲁兰，AZCL-木葡聚糖，AZCL-凝胶多糖和AZCL-β-葡聚糖。

测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％Triton X-100，调节至pH 3-11。

实例4：来自浮霉状菌属的内切葡聚糖酶的黄原胶降解活性

本发明多肽的黄原胶降解活性通过测量与内切葡聚糖酶孵育后黄原胶溶液的粘度降低来评估。

使用描述于WO 2011/107472中的粘度压力测定进行粘度测量。

水解条件如下所示：50℃，0.6％黄原胶(XG)或0.3％经修饰的黄原胶(mSG)在50mM HEPES缓冲液中+0.01％triton X-100pH 7.0中。热平衡后添加酶。在热平衡后和酶添加之前测量初始粘度。对照亦如此，只是添加缓冲液而不是酶。

样品大小为100μL/1mL水解或对照。下表X中所示的结果是三次测量的平均值。

粘度的降低是酶活性的量度。当内切葡聚糖酶和黄原胶裂解酶与黄原胶一起孵育时，或当内切葡聚糖酶与经修饰的黄原胶单独孵育时，观察到粘度的显著下降。这表明一旦除去丙酮酸化的甘露糖，底物现在是空间可得的并且被内切葡聚糖酶降解。

实例5：还原端测定

可替代地，可以使用由莱韦尔(Lever)(1972)，分析生物化学(Anal.Biochem.)47:273-279,1972研发的比色测定，通过用黄原胶裂解酶(mXG)预处理的黄原胶上的还原末端确定内切葡聚糖酶活性。产生的任何还原末端都将与PAHBAH反应，从而产生颜色的变化，该颜色变化在用于该测定的条件下与酶活性成比例。

如以上描述通过还原末端测量黄原胶裂解酶活性，除了将0.1％黄原胶用作底物以外。

材料与化学品：0.1％底物：24ml Milli-Q水中的用黄原胶裂解酶预处理的6ml(5mg/ml)黄原胶。

活性缓冲液：100mM乙酸钠，100mM MES，1mM CaCl2，在0.01％Triton X100中，pH 7。

Ka-Na-酒石酸盐/NaOH缓冲液：将Ka-Na-酒石酸盐(50g)和NaOH(20g)溶解于水中，至总体积为1升。在4℃下储存。

终止溶液：将PAHBAH(西格玛H-9882)溶解于Ka-Na-酒石酸盐/NaOH溶液中，至浓度为15mg/ml(例如，将500mg PAHBAH溶解于33ml Ka-Na-酒石酸盐/NaOH溶液中)。

样品制备：使用BioMek液体处理机器人，将酶样品在柯仕达条(costarstrip)中的活性缓冲液中稀释至0.1mg/ml。将50μl的底物和50μl的每种稀释的样品转移至96孔PCR-MTP板，向每个样品中添加50μl活性缓冲液并将溶液混合。将密封的PCR-板在37℃下、在PCR机中孵育15min，然后立即冷却至10℃。向每个样品中添加75μl的终止溶液，将混合物振荡，并且将75μl的每个样品丢弃。将这些样品在95℃下孵育10min，然后在10℃下孵育1min。将150μl的每种样品转移至新的96孔PCR-MTP并且测量405nm处的吸光度。

比色反应与产生的还原末端的量成比例，并且因此与存在的内切葡聚糖酶的量成比例。

序列表

<110> 诺维信公司

<120> 具有内切葡聚糖酶活性的多肽

<130> 12796-WO-PCT

<160> 2

<170> PatentIn 版本3.5

<210> 1

<211> 2622

<212> DNA

<213> 浮霉状菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2619)

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(81)

<220>

<221> 成熟肽

<222> (82)..(2619)

<220>

<221> PF00150

<222> (277)..(687)

<220>

<221> PF02018

<222> (850)..(1239)

<400> 1

atg agg cga aac gtt gcg ttc gat tgc att ctg atc ctg cta ctt ggg 48

Met Arg Arg Asn Val Ala Phe Asp Cys Ile Leu Ile Leu Leu Leu Gly

-25 -20 -15

cta ctg tgc ttc gga gca aca ccc tct cgg gga gaa gaa acg gca act 96

Leu Leu Cys Phe Gly Ala Thr Pro Ser Arg Gly Glu Glu Thr Ala Thr

-10 -5 -1 1 5

cca ggc aag ctc ttt ccg ttt gtc ctg agc tac gaa cca acg gac agc 144

Pro Gly Lys Leu Phe Pro Phe Val Leu Ser Tyr Glu Pro Thr Asp Ser

10 15 20

atc aca aac atc tca gaa tgg ctt gac cgt ccc gct ggg aag cac ggg 192

Ile Thr Asn Ile Ser Glu Trp Leu Asp Arg Pro Ala Gly Lys His Gly

25 30 35

ttt att cgg gcg gaa aat ggg cac ttt gtg aca gat gcc ggg cgg atc 240

Phe Ile Arg Ala Glu Asn Gly His Phe Val Thr Asp Ala Gly Arg Ile

40 45 50

cgg ctg tgg gcc act aac ctc tgt ttt gaa gcc tgc ttc cca acc aag 288

Arg Leu Trp Ala Thr Asn Leu Cys Phe Glu Ala Cys Phe Pro Thr Lys

55 60 65

gaa gag gca gaa cgc ctt gcc agg cgt ctc gcc agc ctg ggg atc aat 336

Glu Glu Ala Glu Arg Leu Ala Arg Arg Leu Ala Ser Leu Gly Ile Asn

70 75 80 85

tgt gtg cga atg cat cac atg gac aat cgg cac atc tgg ggt aaa agc 384

Cys Val Arg Met His His Met Asp Asn Arg His Ile Trp Gly Lys Ser

90 95 100

ccc aat aag ctg acg att gat ccc gaa atg ctg gat aag ctg gat tac 432

Pro Asn Lys Leu Thr Ile Asp Pro Glu Met Leu Asp Lys Leu Asp Tyr

105 110 115

ctg att tat caa ttg aaa ttg cac ggg atc tat acc aac ctc aat ctg 480

Leu Ile Tyr Gln Leu Lys Leu His Gly Ile Tyr Thr Asn Leu Asn Leu

120 125 130

cat gtg tcc cgg gag ttt ggc ccg gcc gaa ggc ttt ccc gcg gtg gag 528

His Val Ser Arg Glu Phe Gly Pro Ala Glu Gly Phe Pro Ala Val Glu

135 140 145

ggc ctc ccc aac tac gat aaa ggg atc gac aac ttt gaa ccc cgg atg 576

Gly Leu Pro Asn Tyr Asp Lys Gly Ile Asp Asn Phe Glu Pro Arg Met

150 155 160 165

atc gag tac cag aaa aaa tat gcc cgc gat ttg ctc acg cac gtc aat 624

Ile Glu Tyr Gln Lys Lys Tyr Ala Arg Asp Leu Leu Thr His Val Asn

170 175 180

ccc tac acc ggc acg gcg tac atc aac gaa ccg gcc att gcg atg gtc 672

Pro Tyr Thr Gly Thr Ala Tyr Ile Asn Glu Pro Ala Ile Ala Met Val

185 190 195

gaa atc aat aac gaa aat gca gcg ttt gac gag tac cgc aag gga gcg 720

Glu Ile Asn Asn Glu Asn Ala Ala Phe Asp Glu Tyr Arg Lys Gly Ala

200 205 210

ttt gat cat ttg ccc gag ccg tac gcc agc caa ctc cgc aag ctg tgg 768

Phe Asp His Leu Pro Glu Pro Tyr Ala Ser Gln Leu Arg Lys Leu Trp

215 220 225

aat gcc tgg ctg aaa aag aaa tac ggc agt gac gac gcg ctt cgc aaa 816

Asn Ala Trp Leu Lys Lys Lys Tyr Gly Ser Asp Asp Ala Leu Arg Lys

230 235 240 245

gcg tgg aat gcc cag cgt caa ccc ctg ggc gag gaa atc ctg aaa aat 864

Ala Trp Asn Ala Gln Arg Gln Pro Leu Gly Glu Glu Ile Leu Lys Asn

250 255 260

cgt gac ttt tcc ggc cag tgg gaa aag gtg tgg aac ctc cag cgt gac 912

Arg Asp Phe Ser Gly Gln Trp Glu Lys Val Trp Asn Leu Gln Arg Asp

265 270 275

aat ctc tcg gag gtc gtc gcc gag gtc att ccg aat ggc ttt cag ggc 960

Asn Leu Ser Glu Val Val Ala Glu Val Ile Pro Asn Gly Phe Gln Gly

280 285 290

aaa ccc gcc ttg cgt ttg cgc gtc atc cgc aac gga caa gaa acc tgg 1008

Lys Pro Ala Leu Arg Leu Arg Val Ile Arg Asn Gly Gln Glu Thr Trp

295 300 305

atc ccc cag tta agc cag ggc ggt ttt tca gtt cag aaa ggt cag gtg 1056

Ile Pro Gln Leu Ser Gln Gly Gly Phe Ser Val Gln Lys Gly Gln Val

310 315 320 325

tac act ctc cga ttc tgg ctg aaa gcg gac aaa ccg ggc cgg atc gac 1104

Tyr Thr Leu Arg Phe Trp Leu Lys Ala Asp Lys Pro Gly Arg Ile Asp

330 335 340

gtg aac tgc atg atg aac cac gat ccc tgg cag cgt ctc ggc ctt tcc 1152

Val Asn Cys Met Met Asn His Asp Pro Trp Gln Arg Leu Gly Leu Ser

345 350 355

gcg gat gtt caa acc tcg gcc gag tgg aag gaa tat cgc ctc agc ttt 1200

Ala Asp Val Gln Thr Ser Ala Glu Trp Lys Glu Tyr Arg Leu Ser Phe

360 365 370

gtg gcg gat cgc gat gat cca aat gcc agg atc acg ttc agc caa ctc 1248

Val Ala Asp Arg Asp Asp Pro Asn Ala Arg Ile Thr Phe Ser Gln Leu

375 380 385

cgt ccc ggg acg tac gaa ctg gca gac gtg tca ctc cgg ccg ggt ggg 1296

Arg Pro Gly Thr Tyr Glu Leu Ala Asp Val Ser Leu Arg Pro Gly Gly

390 395 400 405

gtc atc ggc ctg gaa gag ggc caa tcc ctc gcc gat cag acg gtt ccc 1344

Val Ile Gly Leu Glu Glu Gly Gln Ser Leu Ala Asp Gln Thr Val Pro

410 415 420

att gtt cct gct cgc gga ccg caa atg acg gcc gcc gcc cgg gcc gac 1392

Ile Val Pro Ala Arg Gly Pro Gln Met Thr Ala Ala Ala Arg Ala Asp

425 430 435

ttc gca gat ttt ttg tgg gag ctc gaa cgc gac tac tgg tgg gga atg 1440

Phe Ala Asp Phe Leu Trp Glu Leu Glu Arg Asp Tyr Trp Trp Gly Met

440 445 450

tac cga ttt ctg aag gag gaa ctc aag ctg aag ccg ctg gtc gcg gga 1488

Tyr Arg Phe Leu Lys Glu Glu Leu Lys Leu Lys Pro Leu Val Ala Gly

455 460 465

acg caa ctc tcc tac agt cca gtt cac att caa gct ggg ctg gac tac 1536

Thr Gln Leu Ser Tyr Ser Pro Val His Ile Gln Ala Gly Leu Asp Tyr

470 475 480 485

atc gac tcg cat gcc tac tgg cag cat ccc gtt ttc ccc ggc agg cca 1584

Ile Asp Ser His Ala Tyr Trp Gln His Pro Val Phe Pro Gly Arg Pro

490 495 500

tgg gat ccg gaa aac tgg tat gtg cgt agt ctg gcc ctc gtg aat cag 1632

Trp Asp Pro Glu Asn Trp Tyr Val Arg Ser Leu Ala Leu Val Asn Gln

505 510 515

ccg gga ggc aca ctt tcc gga ctc gcc agt cgg cgt gtc gaa ggt ttg 1680

Pro Gly Gly Thr Leu Ser Gly Leu Ala Ser Arg Arg Val Glu Gly Leu

520 525 530

ccg ttc acc gtg agc gaa tac aac cac ccg gct ccc aac gaa tac gcc 1728

Pro Phe Thr Val Ser Glu Tyr Asn His Pro Ala Pro Asn Glu Tyr Ala

535 540 545

gcc gaa gga ttt ccg atg atc gcg gct ttt ggg gct ttt cag gat tgg 1776

Ala Glu Gly Phe Pro Met Ile Ala Ala Phe Gly Ala Phe Gln Asp Trp

550 555 560 565

gat gga atc ttc agc ttc act tac agc cac agt cga gat tac gag ccg 1824

Asp Gly Ile Phe Ser Phe Thr Tyr Ser His Ser Arg Asp Tyr Glu Pro

570 575 580

cga aaa atc acg ggt ttc ttc gac atc aaa agc gag gtg acc aaa ctc 1872

Arg Lys Ile Thr Gly Phe Phe Asp Ile Lys Ser Glu Val Thr Lys Leu

585 590 595

gtt cac atg ccc gcc tgc gtc gcc atg ttc tac cgg ggt gat gtg caa 1920

Val His Met Pro Ala Cys Val Ala Met Phe Tyr Arg Gly Asp Val Gln

600 605 610

ccc gcc acc cag gct gtg gtc gtg ggc atg acc cgt gaa aag gaa caa 1968

Pro Ala Thr Gln Ala Val Val Val Gly Met Thr Arg Glu Lys Glu Gln

615 620 625

tcc atc ctc cga gaa aca ctc aat ccc tgg gcg ctg acc gcc gac cgt 2016

Ser Ile Leu Arg Glu Thr Leu Asn Pro Trp Ala Leu Thr Ala Asp Arg

630 635 640 645

ttg ggt att ccc gcc aac ctg agc ttg ctc cat cgg gtg gcc atg gca 2064

Leu Gly Ile Pro Ala Asn Leu Ser Leu Leu His Arg Val Ala Met Ala

650 655 660

ctg aaa gaa ccc agc gat agt gtg cca cca ccc acg ctg tcc gcg gag 2112

Leu Lys Glu Pro Ser Asp Ser Val Pro Pro Pro Thr Leu Ser Ala Glu

665 670 675

cag aag gtt ttc ctg tcc gat acg caa caa atc tgc tgg gat gtc tct 2160

Gln Lys Val Phe Leu Ser Asp Thr Gln Gln Ile Cys Trp Asp Val Ser

680 685 690

cag ccc ggc gcc ggg gtg ttc ctg gtc aac tcg ccg aaa acg aaa ctc 2208

Gln Pro Gly Ala Gly Val Phe Leu Val Asn Ser Pro Lys Thr Lys Leu

695 700 705

gtg acc ggt ttc ccc gcc gga aga act ttc aat ctg aat gga atc cag 2256

Val Thr Gly Phe Pro Ala Gly Arg Thr Phe Asn Leu Asn Gly Ile Gln

710 715 720 725

att cag att gga gaa acg gag ctg ggt tgg gcg acc gtt tcg ctc acc 2304

Ile Gln Ile Gly Glu Thr Glu Leu Gly Trp Ala Thr Val Ser Leu Thr

730 735 740

gtt atc aaa ggg gac gga ttt gat cgg cct ggc cga atc ctc ctc gct 2352

Val Ile Lys Gly Asp Gly Phe Asp Arg Pro Gly Arg Ile Leu Leu Ala

745 750 755

gct acg gga aag gcc caa aat aca ggc tgg gac ttc cgt aaa gag ggc 2400

Ala Thr Gly Lys Ala Gln Asn Thr Gly Trp Asp Phe Arg Lys Glu Gly

760 765 770

gat cgg gtg acc gtg gga cgc cgc tgg ggc gac gag ccg atc ctc tgc 2448

Asp Arg Val Thr Val Gly Arg Arg Trp Gly Asp Glu Pro Ile Leu Cys

775 780 785

gaa gga gtg ccg gct cgc atc gtg ctg ccg gtt tcg tcc agc cgc gtg 2496

Glu Gly Val Pro Ala Arg Ile Val Leu Pro Val Ser Ser Ser Arg Val

790 795 800 805

aaa gtc tat gcc ctc gac gag gcg gga cgc cgc agg gac gcg gtg acg 2544

Lys Val Tyr Ala Leu Asp Glu Ala Gly Arg Arg Arg Asp Ala Val Thr

810 815 820

gtt tct ggt ggc gat cag gcc gtt gtc gaa ata ggg ccc caa ttc agg 2592

Val Ser Gly Gly Asp Gln Ala Val Val Glu Ile Gly Pro Gln Phe Arg

825 830 835

acg ctg tgg tac gaa atc gaa atc caa tga 2622

Thr Leu Trp Tyr Glu Ile Glu Ile Gln

840 845

<210> 2

<211> 873

<212> PRT

<213> 浮霉状菌

<400> 2

Met Arg Arg Asn Val Ala Phe Asp Cys Ile Leu Ile Leu Leu Leu Gly

-25 -20 -15

Leu Leu Cys Phe Gly Ala Thr Pro Ser Arg Gly Glu Glu Thr Ala Thr

-10 -5 -1 1 5

Pro Gly Lys Leu Phe Pro Phe Val Leu Ser Tyr Glu Pro Thr Asp Ser

10 15 20

Ile Thr Asn Ile Ser Glu Trp Leu Asp Arg Pro Ala Gly Lys His Gly

25 30 35

Phe Ile Arg Ala Glu Asn Gly His Phe Val Thr Asp Ala Gly Arg Ile

40 45 50

Arg Leu Trp Ala Thr Asn Leu Cys Phe Glu Ala Cys Phe Pro Thr Lys

55 60 65

Glu Glu Ala Glu Arg Leu Ala Arg Arg Leu Ala Ser Leu Gly Ile Asn

70 75 80 85

Cys Val Arg Met His His Met Asp Asn Arg His Ile Trp Gly Lys Ser

90 95 100

Pro Asn Lys Leu Thr Ile Asp Pro Glu Met Leu Asp Lys Leu Asp Tyr

105 110 115

Leu Ile Tyr Gln Leu Lys Leu His Gly Ile Tyr Thr Asn Leu Asn Leu

120 125 130

His Val Ser Arg Glu Phe Gly Pro Ala Glu Gly Phe Pro Ala Val Glu

135 140 145

Gly Leu Pro Asn Tyr Asp Lys Gly Ile Asp Asn Phe Glu Pro Arg Met

150 155 160 165

Ile Glu Tyr Gln Lys Lys Tyr Ala Arg Asp Leu Leu Thr His Val Asn

170 175 180

Pro Tyr Thr Gly Thr Ala Tyr Ile Asn Glu Pro Ala Ile Ala Met Val

185 190 195

Glu Ile Asn Asn Glu Asn Ala Ala Phe Asp Glu Tyr Arg Lys Gly Ala

200 205 210

Phe Asp His Leu Pro Glu Pro Tyr Ala Ser Gln Leu Arg Lys Leu Trp

215 220 225

Asn Ala Trp Leu Lys Lys Lys Tyr Gly Ser Asp Asp Ala Leu Arg Lys

230 235 240 245

Ala Trp Asn Ala Gln Arg Gln Pro Leu Gly Glu Glu Ile Leu Lys Asn

250 255 260

Arg Asp Phe Ser Gly Gln Trp Glu Lys Val Trp Asn Leu Gln Arg Asp

265 270 275

Asn Leu Ser Glu Val Val Ala Glu Val Ile Pro Asn Gly Phe Gln Gly

280 285 290

Lys Pro Ala Leu Arg Leu Arg Val Ile Arg Asn Gly Gln Glu Thr Trp

295 300 305

Ile Pro Gln Leu Ser Gln Gly Gly Phe Ser Val Gln Lys Gly Gln Val

310 315 320 325

Tyr Thr Leu Arg Phe Trp Leu Lys Ala Asp Lys Pro Gly Arg Ile Asp

330 335 340

Val Asn Cys Met Met Asn His Asp Pro Trp Gln Arg Leu Gly Leu Ser

345 350 355

Ala Asp Val Gln Thr Ser Ala Glu Trp Lys Glu Tyr Arg Leu Ser Phe

360 365 370

Val Ala Asp Arg Asp Asp Pro Asn Ala Arg Ile Thr Phe Ser Gln Leu

375 380 385

Arg Pro Gly Thr Tyr Glu Leu Ala Asp Val Ser Leu Arg Pro Gly Gly

390 395 400 405

Val Ile Gly Leu Glu Glu Gly Gln Ser Leu Ala Asp Gln Thr Val Pro

410 415 420

Ile Val Pro Ala Arg Gly Pro Gln Met Thr Ala Ala Ala Arg Ala Asp

425 430 435

Phe Ala Asp Phe Leu Trp Glu Leu Glu Arg Asp Tyr Trp Trp Gly Met

440 445 450

Tyr Arg Phe Leu Lys Glu Glu Leu Lys Leu Lys Pro Leu Val Ala Gly

455 460 465

Thr Gln Leu Ser Tyr Ser Pro Val His Ile Gln Ala Gly Leu Asp Tyr

470 475 480 485

Ile Asp Ser His Ala Tyr Trp Gln His Pro Val Phe Pro Gly Arg Pro

490 495 500

Trp Asp Pro Glu Asn Trp Tyr Val Arg Ser Leu Ala Leu Val Asn Gln

505 510 515

Pro Gly Gly Thr Leu Ser Gly Leu Ala Ser Arg Arg Val Glu Gly Leu

520 525 530

Pro Phe Thr Val Ser Glu Tyr Asn His Pro Ala Pro Asn Glu Tyr Ala

535 540 545

Ala Glu Gly Phe Pro Met Ile Ala Ala Phe Gly Ala Phe Gln Asp Trp

550 555 560 565

Asp Gly Ile Phe Ser Phe Thr Tyr Ser His Ser Arg Asp Tyr Glu Pro

570 575 580

Arg Lys Ile Thr Gly Phe Phe Asp Ile Lys Ser Glu Val Thr Lys Leu

585 590 595

Val His Met Pro Ala Cys Val Ala Met Phe Tyr Arg Gly Asp Val Gln

600 605 610

Pro Ala Thr Gln Ala Val Val Val Gly Met Thr Arg Glu Lys Glu Gln

615 620 625

Ser Ile Leu Arg Glu Thr Leu Asn Pro Trp Ala Leu Thr Ala Asp Arg

630 635 640 645

Leu Gly Ile Pro Ala Asn Leu Ser Leu Leu His Arg Val Ala Met Ala

650 655 660

Leu Lys Glu Pro Ser Asp Ser Val Pro Pro Pro Thr Leu Ser Ala Glu

665 670 675

Gln Lys Val Phe Leu Ser Asp Thr Gln Gln Ile Cys Trp Asp Val Ser

680 685 690

Gln Pro Gly Ala Gly Val Phe Leu Val Asn Ser Pro Lys Thr Lys Leu

695 700 705

Val Thr Gly Phe Pro Ala Gly Arg Thr Phe Asn Leu Asn Gly Ile Gln

710 715 720 725

Ile Gln Ile Gly Glu Thr Glu Leu Gly Trp Ala Thr Val Ser Leu Thr

730 735 740

Val Ile Lys Gly Asp Gly Phe Asp Arg Pro Gly Arg Ile Leu Leu Ala

745 750 755

Ala Thr Gly Lys Ala Gln Asn Thr Gly Trp Asp Phe Arg Lys Glu Gly

760 765 770

Asp Arg Val Thr Val Gly Arg Arg Trp Gly Asp Glu Pro Ile Leu Cys

775 780 785

Glu Gly Val Pro Ala Arg Ile Val Leu Pro Val Ser Ser Ser Arg Val

790 795 800 805

Lys Val Tyr Ala Leu Asp Glu Ala Gly Arg Arg Arg Asp Ala Val Thr

810 815 820

Val Ser Gly Gly Asp Gln Ala Val Val Glu Ile Gly Pro Gln Phe Arg

825 830 835

Thr Leu Trp Tyr Glu Ile Glu Ile Gln

840 845