本发明涉及一种新型农药及制备方法和应用，具体涉及向日葵花盘抑菌剂及其在抑制细胞壁降解酶的活性中的应用。
背景技术：
干腐病是马铃薯常见病害之一，是造成马铃薯块茎采后损失的最主要病害(Antifungal Activity of the Essential Oil of Zanthoxylum bungeanum and its Major Constituent on Fusarium sulphureum and Dry Rot of Potato Tubers[J].LiXing-dong,Phytoparasitica,2014,42(4):509-517)，发病症状主要是浸染块茎发病初期仅局部变褐色稍凹陷，扩大后病部出现很多皱褶，呈同心轮纹状，其上有时长出灰白色的绒状颗粒。由马铃薯干腐病引起的块茎腐烂约占病薯的88.5％(甘肃省定西地区马铃薯块茎干腐病病原真菌的分离鉴定[J],何苏琴,云南农业大学学报,2004,19(5):550-552)，严重影响马铃薯的产量和质量，给马铃薯种植业带来巨大的经济损失。
在实际生产中抗干腐病的马铃薯品种较少，主要通过采后应用噻苯咪唑等真菌杀菌剂对引起马铃薯干腐病主要病原菌硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)进行控制。由于化学合成类农药易对农业生态环境造成影响，并在作物中产生蓄积，进而影响人类健康，因而化学合成类农药在防治马铃薯干腐病的应用中逐渐减少使用。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种植物源抑菌剂-向日葵花盘提取物，使所述向日葵花盘提取物对引起的马铃薯干腐病的硫色镰刀菌有较好的抑制作用，从而达到对马铃薯干腐病的高效防治的目的。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了向日葵花盘抑菌剂，包括为以向日葵花盘为原料，采用溶剂提取方法获得的向日葵花盘提取物，所述的溶剂为水。
优选的，所述向日葵花盘的质量与溶剂的体积比为1kg：(5～15)L。
优选的，所述提取的方法包括以下步骤：
1)将向日葵花盘粉碎，得到的向日葵花盘粉末；
2)将所述向日葵花盘粉末与溶剂混合，浸提，得到浸提液；
3)将所述步骤2)得到的浸提液离心，得到的上清液为向日葵花盘提取物。
优选的，所述浸提的时间为3～5d。
优选的，所述步骤3)中的离心后还包括：将得到的上清液进行浓缩和干燥。
本发明还提供了所述述的向日葵花盘抑菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将向日葵花盘粉碎，得到的向日葵花盘粉末；
2)将所述向日葵花盘粉末与溶剂混合，浸提，得到浸提液，所述溶剂为水；
3)将所述步骤2)得到的浸提液离心，得到的上清液为向日葵花盘抑菌剂。
优选的，所述步骤2)中的向日葵花盘粉末在与溶剂混合前过60～100目筛。
优选的，所述步骤3)中离心的转速为2000～4000r/min转速；所述步骤3)中的离心的时间为10～20min。
本发明还提供了所述的向日葵花盘抑菌剂或所述方法制备的向日葵花盘抑菌剂在抑制马铃薯干腐病菌分泌的细胞壁降解酶的活性中的应用。
优选的，所述细胞壁降解酶包括多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、纤维素酶(Cx)或β-葡萄糖苷酶。
优选的，所述向日葵花盘抑菌剂中向日葵花盘提取物的质量浓度为300～340mg/ml。
本发明提供了向日葵花盘抑菌剂，包括以向日葵花盘为原料采用溶剂提取获得的向日葵花盘提取物，所述溶剂为水。用水作为溶剂提取向日葵花盘中的活性物质，所得向日葵花盘水提取中的活性物质具有抑菌功能。
同时，本发明提供了向日葵花盘抑菌剂，提取的原料来源广泛，容易获得，通过将向日葵花盘提取抑菌物质，将向日葵花盘变废为宝，同时减少了向日葵花盘因焚烧对环境造成的污染，也降低了向日葵花盘的处理成本。
本发明还提供一种所述的向日葵花盘抑菌剂的制备方法，将向日葵花盘粉碎后得到的粉末与溶剂混合，浸提，离心，得到的上清液为向日葵花盘抑菌剂。所述制备方法具有方法简单，操作简便，制备方法对操作人员的技术要求不高，重复性好的特点。
本发明还提供所述的向日葵花盘抑菌剂在抑制马铃薯干腐病中的应用。所述向日葵花盘抑菌剂能够有效抑制造成马铃薯干腐病的细胞壁降解酶的活性，从而达到对马铃薯干腐病的抑制效果。实施例数据表明，PG酶活性与空白对照相比抑制率为23.42％～35.19％；PMG酶活性与空白对照相比抑制率为35.20％～40.47％；Cx酶活性与空白对照相比抑制率为38.21％～52.66％；β-葡萄糖苷酶活性与空白对照相比抑制率为47.47％～56.59％。
进一步的，本发明所述的向日葵花盘抑菌剂对多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基半乳糖醛酸酶、纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的活性具有较好的抑制活性。多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基半乳糖醛酸酶、纤维素酶和β-葡萄糖苷酶是引起马铃薯干腐病的最为严重的4种细胞壁降解酶，通过对上述4种酶活性的抑制从而达到对马铃薯干腐病的抑制效果。所述向日葵花盘抑菌剂对
具体实施方式
本发明提供了向日葵花盘抑菌剂，包括以向日葵花盘为原料、采用溶剂提取获得的向日葵花盘提取物，所述溶剂为水。
本发明提供了向日葵花盘抑菌剂，采用水为溶剂提取向日葵花盘中的不同种类的活性物质，提取得到的向日葵花盘水提物中的活性物质具有抑菌功能。
在本发明中，所述向日葵花盘的质量与溶剂的体积比优选为1kg：(5～15)L，更优选为1kg：10L。
在本发明中，所述提取的方法优选包括以下步骤：
1)将向日葵花盘粉碎，得到向日葵花盘粉末；
2)将所述向日葵花盘粉末与溶剂混合，浸提，得到浸提液；
3)将所述步骤2)得到的浸提液离心，得到的上清液为向日葵花盘提取物。
在本发明中，所述向日葵花盘选择无虫害、霉变的向日葵花盘。
在本发明中，所述向日葵花盘优选在粉碎之前进行烘干。所述烘干的温度优选为35～60℃，更优选为37～50℃；烘干的时间优选为1～5h，更优选为2～4h。
在本发明中，所述粉碎的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的粉碎方法即可。在本发明中，所述的粉碎通过研磨的方法实现。
在本发明中，所述粉碎后向日葵花盘的粒度优选为60～100目，更优选为65～80目。
得到向日葵花盘粉末后，本发明将所述向日葵花盘粉末与溶剂混合，浸提，得到浸提液。本发明对所述混合的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的混合方法即可。在本发明实施例中，所述的混合采用搅拌的方法使原料和溶剂混合均匀。
在本发明中，所述浸提的时间为3～5d。所述浸提优选在常温条件下进行。
得到浸提液后，本发明对所述浸提液进行离心，得到上清液。在本发明中，所述离心的速度优选为2000～4000r/min，更优选为3500r/min。所述离心的时间为10～20min，更优选为15min。
得到上清液后，本发明优选将所述上清液进行浓缩和干燥，得到向日葵花盘提取物固体粉末。
在本发明中，所述浓缩优选为旋转蒸馏浓缩。所述的旋转蒸馏浓缩的温度优选为30～45℃，更优选为35～40℃。所述浓缩的时间优选为1～5h，更优选为2～4h。
在本发明中，所述的干燥优选为真空干燥。所述的真空干燥的冷阱温度优选为-25～-55℃，更优选为-30～-45℃。所述的真空干燥的真空度优选为15～110KPa，更优选为30～100KPa。
在本发明中，向日葵花盘抑菌剂优选还包括农药领域接受的辅料，制成农药领域的剂型。
本发明还提供一种所述的向日葵花盘抑菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将向日葵花盘粉碎，得到的向日葵花盘粉末；
2)将所述向日葵花盘粉末与溶剂混合，浸提，得到浸提液，所述溶剂为水；
3)将所述步骤2)得到的浸提液离心，得到的上清液为向日葵花盘抑菌剂。
在本发明中，所述向日葵花盘粉末在与溶剂混合前过60～100目筛，更优选为70～90目。
在本发明中，所述离心的转速优选为2000～4000r/min，更优选为3500r/min；所述离心的时间优选为10～20min，更优选为15min。
本发明中，所述向日葵花盘抑菌剂优选还包括农药领域接受的辅料。
在本发明中，所述农药领域接受的辅料的种类优选为优选包括润湿剂，分散剂，崩解剂，稳定剂，pH值调节剂，消泡剂，增效剂和填料中的一种和几种。
在本发明中，所述向日葵花盘抑菌剂优选制成农药领域的抑菌剂剂型。
在本发明中，所述剂型的种类优选为水分散粒剂或可湿性粉剂。
本发明还提供了所述的向日葵花盘抑菌剂在抑制马铃薯干腐病菌分泌的细胞壁降解酶的活性中的应用。
在本发明中，所述细胞壁降解酶包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基半乳糖醛酸酶、纤维素酶或β-葡萄糖苷酶。
在本发明中，所述的向日葵花盘抑菌剂的质量浓度优选为300～340mg/ml，更优选为320mg/mL。
在本发明中，所述的应用不受马铃薯品种的限制。本发明实施例中采用的马铃薯品种为陇薯7号马铃薯，陇薯10号马铃薯和新大坪马铃薯。
下面结合实施例对本发明提供的向日葵花盘抑菌剂、制备方法及其在防治马铃薯干腐病菌分泌的细胞壁降解酶的活性中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
选择无虫害、霉变的向日葵花盘为原料，用粉碎机制成粉状，过60目筛，收集得到的向日葵花盘粉末。称取粉末1kg，与10L的水混合，加入桶中浸提5天，浸提液以3000r/min转速离心15min，收集上清液，在45℃的条件下旋蒸浓缩2h，浓缩物经真空冷冻干燥，得提取物粉末，4℃冰箱中保藏备用。
实施例2
选择无虫害、霉变的向日葵花盘为原料，用粉碎机制成粉状，过70目筛，收集得到的向日葵花盘粉末。称取粉末1kg，与15L的水混合，加入桶中浸提3天，浸提液以3500r/min转速离心12min，收集上清液，在35℃的条件下旋蒸浓缩3h，浓缩物经真空冷冻干燥，得提取物粉末，4℃冰箱中保藏备用。
实施例3
选择无虫害、霉变的向日葵花盘为原料，用粉碎机制成粉状，过95目筛，收集得到的向日葵花盘粉末。称取粉末1kg，与5L的水混合，加入桶中浸提4天，浸提液以4000r/min转速离心10min，收集上清液，在30℃的条件下旋蒸浓缩4h，浓缩物经真空冷冻干燥，得提取物粉末，4℃冰箱中保藏备用。
实施例4～6
实施例4采用实施例1～3制备得到的向日葵花盘水提物将浓度配制成300mg/ml的向日葵花盘水提取物处理马铃薯切片，每个处理三个平行；
实施例5采用实施例1～3制备得到的向日葵花盘水提物将浓度配制成320mg/ml的向日葵花盘水提取物处理马铃薯切片，每个处理三个平行；
实施例6采用实施例1～3制备得到的向日葵花盘水提物将浓度配制成340mg/ml的向日葵花盘水提取物处理马铃薯切片，每个处理三个平行。
将外观整齐、无损伤的陇薯7号马铃薯块茎清洗后用1％商业漂白粉浸泡20min。洗去漂白液后，制成厚1cm直径50mm圆型切片。用无菌水清洗切片并用75％酒精消毒后，在酒精灯上灼烧除去多余酒精，置于无菌湿滤纸上黑暗恒温恒湿培养1h。将其中3枚切片的表面上均匀涂布0.5mL葵花盘水提物溶液，另两枚不作处理。将4个培养1周的硫色镰刀菌菌饼倒置接种于3枚经抑菌液处理的切片及1枚未处理切片中央，试验组分别设置3个平行，设置1个空白对照组(CT)，另一枚不做处理的切片接入与菌饼同样大小的无菌培养基作为正常对照组(CK)，将5枚切片置于恒温恒湿环境中培养。
罹病组织细胞PG、PMG、CX和β-葡萄糖苷酶的提取
所有切片组织培养二天时，分别从3枚平行试验组和空白组切片组织上取3g感病部位组织，正常组取3g正常组织作为PG、PMG、CX和β-葡萄糖苷酶提取样品，将每组样品分别与6mL95％乙醇混合，冰浴研磨匀浆后低温静置10min。然后于4℃、10000×g离心10min。倾去上清液，向沉淀物中加入预冷3mL80％乙醇，震荡，低温放置10min后在同条件下离心。再倾去上清液，向沉淀物中加入5mL提取缓冲液(50mmol/L，PH5.5，含1.8mol/LNaCl的乙酸-乙酸钠缓冲液)，于4℃下提取20min，再离心收集上清液，即为酶的提取液，4℃保存备用。
细胞壁降解酶活性测定
采用3,5-二硝基水杨酸法制作葡萄糖标准曲线，得出葡萄糖毫克数与吸光值之间的线性回归方程，用以计算试验中酶反应释放的还原糖量。
PG和PMG活性测定
向试管中加入1.0mL乙酸-乙酸钠缓冲液(50mmol/L，PH5.5)、0.5mL10g/L底物(PG为多聚半乳糖醛酸，PMG为果胶)，再加入0.5mL酶提取液。混匀后于37℃水浴保温1h，保温后立即加入1.5mL3,5-二硝基水杨酸(DNS)，沸水浴煮沸5min后迅速冷却至室温，按DNS法在540nm下测定吸光值。
根据酶反应所释放的还原糖量计算PG、PMG活性。酶活单位以每小时每克马铃薯组织样品在37℃催化底物水解生成半乳糖醛酸的质量表示(mg/h·g)，将3组试验组的酶活平均值与空白对照组和正常组进行比较。
PG或PMG活性＝(m，·V·1.08)/(VS·t·m)；
m，—从标准曲线上查得的葡萄糖质量，mg；
V—样品提取液总体积，mL；VS—测定时所取样品提取液体积，mL；
t—酶促反应时间，h；m—样品质量，g；
1.08—葡萄糖换算成半乳糖醛酸的系数(194/180)。
Cx与β-葡萄糖苷酶活性的测定
向试管中入1.5mL10g/L底物(Cx为羧甲基纤维素钠CMC，β-葡萄糖苷酶为水杨苷)后按测定PG和PMG活性的方法处理。Cx和β-葡萄糖苷酶活性以每小时每克马铃薯组织样品(鲜重)酶在37℃催化底物水解形成还原糖的质量表示，即(mg/h·g)。将3组试验组的酶活平均值与空白对照组和正常组进行比较。
Cx与β-葡萄糖苷酶活性＝(m，·V)/(VS·t·m)；
m，—从标准曲线上查得的葡萄糖质量，mg；
V—样品提取液总体积，mL；VS—测定时所取样品提取液体积，mL；
t—酶促反应时间，h；m—样品质量，g。
陇薯7号马铃薯细胞壁降解酶活性测定结果如表1所示。
表1硫色镰刀菌侵染陇薯7号马铃薯分泌细胞壁降解酶活性
从表1中可以看出，质量浓度为300～340mg/mL的向日葵花盘提取物处理硫色镰刀菌侵染陇薯7号马铃薯，测定得到的细胞壁降解酶活性均低于空白对照组细胞壁降解酶活性，其中质量浓度为320mg/mL的向日葵花盘提取物对细胞壁降解酶活性抑制性最佳。PG酶活性与空白对照相比抑制率为0.65％～9.77％；PMG酶活性与空白对照相比抑制率为17.66％～20.19％；Cx酶活性与空白对照相比抑制率为22.98％～24.64％；β-葡萄糖苷酶活性与空白对照相比抑制率为22.47％～28.64％。可以看出，质量浓度为300mg/mL的向日葵花盘提取物对四种细胞壁裂解酶的活性结果表明，向日葵花盘提取物对β-葡萄糖苷酶活性抑制效果最好，对PG酶活性最差，对PMG酶活性和Cx酶活性的抑制效果居中。
实施例7～9
采用陇薯10号马铃薯作为实验马铃薯；
实施例7实施例1～3制备得到的向日葵花盘水提物将浓度配制成300mg/ml的向日葵花盘水提取物处理马铃薯切片，每个处理三个平行；
实施例8实施例1～3制备得到的向日葵花盘水提物将浓度配制成300mg/ml的向日葵花盘水提取物处理马铃薯切片，每个处理三个平行；
实施例9实施例1～3制备得到的向日葵花盘水提物将浓度配制成300mg/ml的向日葵花盘水提取物处理马铃薯切片，每个处理三个平行。
实施例7～9采用实施例4中处理方法、酶提取方法和酶活测定方法进行实验，陇薯10号马铃薯细胞壁降解酶活性测定结果如表2所示。
表2硫色镰刀菌侵染陇薯10号马铃薯分泌细胞壁降解酶活性
从表2中可以看出，质量浓度为300～340mg/mL的向日葵花盘提取物处理硫色镰刀菌侵染陇薯10号马铃薯，测定得到的细胞壁降解酶活性均低于空白对照组细胞壁降解酶活性，其中质量浓度为320mg/mL的向日葵花盘提取物对细胞壁降解酶活性抑制性最佳，说明向日葵花盘提取物对硫色镰刀菌在陇薯10号马铃薯上分泌的4种细胞壁降解酶活性具有显著抑制作用。PG酶活性与空白对照相比抑制率为23.42％～35.19％；PMG酶活性与空白对照相比抑制率为35.20％～40.47％；Cx酶活性与空白对照相比抑制率为38.21％～52.66％；β-葡萄糖苷酶活性与空白对照相比抑制率为47.47％～56.59％。可以看出，质量浓度为320mg/mL的向日葵花盘提取物对四种细胞壁裂解酶的活性结果比质量浓度为300mg/mL的向日葵花盘提取物对四种细胞壁裂解酶的活力的抑制效果提高显著，向日葵花盘提取物对β-葡萄糖苷酶活性抑制效果最好，对PG酶活性最差，对PMG酶活性和Cx酶活性的抑制效果居中。
实施例10～12
采用新大坪马铃薯作为实验马铃薯；
实施例10具体是实施例1～3制备得到的向日葵花盘水提物将浓度配制成300mg/ml的向日葵花盘水提取物处理马铃薯切片，每个处理三个平行；
实施例11具体是实施例1～3制备得到的向日葵花盘水提物将浓度配制成300mg/ml的向日葵花盘水提取物处理马铃薯切片，每个处理三个平行；
实施例12具体是实施例1～3制备得到的向日葵花盘水提物将浓度配制成300mg/ml的向日葵花盘水提取物处理马铃薯切片，每个处理三个平行。
实施例10～12采用实施例4中处理方法、酶提取方法和酶活测定方法进行实验，陇薯10号马铃薯细胞壁降解酶活性测定结果如表3所示。
表3硫色镰刀菌侵染新大坪马铃薯分泌细胞壁降解酶活性
从表3中可以看出，质量浓度为300～340mg/mL的向日葵花盘提取物处理硫色镰刀菌侵染陇薯10号马铃薯，测定得到的细胞壁降解酶活性均低于空白对照组细胞壁降解酶活性，其中质量浓度为320mg/mL的向日葵花盘提取物对细胞壁降解酶活性抑制性最佳，说明向日葵花盘提取物对硫色镰刀菌在陇薯10号马铃薯上分泌的4种细胞壁降解酶活性具有显著抑制作用。PG酶活性与空白对照相比抑制率为11.22％～31.19％；PMG酶活性与空白对照相比抑制率为6.89％～21.98％；Cx酶活性与空白对照相比抑制率为24.577％～47.14％；β-葡萄糖苷酶活性与空白对照相比抑制率为13.55％～40.43％。可以看出，质量浓度为340mg/mL的向日葵花盘提取物对四种细胞壁裂解酶的活性结果比质量浓度为320mg/mL的向日葵花盘提取物对四种细胞壁裂解酶的活力的抑制效果略低，向日葵花盘提取物对β-葡萄糖苷酶活性抑制效果最好，对PG酶活性最差，对PMG酶活性和Cx酶活性的抑制效果居中。
由以上实施例可知，本发明提供的向日葵花盘抑制剂在质量浓度为300～340mg/mL的向日葵花盘提取物对硫色镰刀菌侵染马铃薯分泌细胞壁降解酶活性具有抑制作用，当向日葵花盘提取物的质量浓度为320mg/mL时对硫色镰刀菌侵染马铃薯分泌细胞壁降解酶活性抑制性最强，并且向日葵花盘抑制剂对不同马铃薯品种均具有抑制作用，并且对侵染陇薯10号马铃薯的病原菌的细胞壁裂解酶的活性抑制率最高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。