木霉菌种衣剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种木霉菌种衣剂及其制备方法和应用，特别是关于生防型木霉菌生物种衣剂制备方法及在玉米茎腐病、纹枯病、根腐病防治中的应用技术。
背景技术：
：木霉菌是土壤和植物根际生态系统中普遍存在的一种习居真菌。木霉是国际上公认的有益微生物，主要通过营养和空间竞争、抗生作用、重寄生作用和诱导抗性等机制防治各类作物的土传病害，包括作物苗病、根腐病和枯萎病等。木霉菌不仅具有防治病害的功能，同时还具有促进植物根系生长、提高营养利用效率、提高作物产量和抗逆性、修复土壤等功能，是一种防病增产作用显著的多功能微生物。近年来，玉米土传病害，如玉米茎腐病和纹枯病发生逐年加重，一些地区通常年份的发病率为15-20％，严重年份发生率达40％以上，造成了严重的产量损失，并且已成为全国玉米产区优质高产的主要威胁。不仅如此，由于玉米茎腐病的高发生率引发了严重的玉米倒伏现象，限制了玉米机械化生产技术的推广。多年来国内外关于木霉菌生防菌剂主要以堆肥、颗粒剂等形式予以应用，以木霉菌制备种衣剂成功的报导较少，美国Biowork木霉菌生物种衣剂也仅应用于对玉米苗病的防治和提高玉米产量，而很少有研究用于防治玉米生育后期发生的茎腐病(Fusariumspp.,Pythiumspp.)和纹枯病(Rhizoctoniasolani)。由于玉米茎腐病菌和纹枯病菌侵染时期较长，从苗期到成株期均可侵染，而显症一般是在灌浆期以后，因此，这就要求生物防治过程中，微生物对土壤和作物根系具较长时间的定殖能力和系统诱导植物抗性的功能，从而实现微生物处理种子后能够防治玉米生育后期病害的发生。技术实现要素：针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种木霉菌种衣剂及其制备方法和应用，有效用于防治玉米茎腐病、纹枯病和根腐病等。本发明是从大量的木霉菌资源中筛选获得的拮抗木霉菌株，在土壤中具有很强的竞争能力，有效抑制土壤中和根表病菌的繁殖和定殖，更为重要的是所筛选的菌株具有系统诱导抗性，即木霉菌随着种子的萌发定殖于玉米根系，在根系内产生一系列的激发子来诱导根系内防御反应基因的系统表达，并且持效期可达到整个玉米生育期(吴晓等2015)，从而实现对茎腐病、纹枯病等后期病害的防治。因此，开发出能够防治玉米土传病害病的生防木霉菌种衣剂并在全国进行推广使用对玉米的绿色防控具有十分重要的意义，应用前景广阔。本发明的目的是通过如下技术方案实现的：第一方面，本发明提供一种木霉菌种衣剂，所述种衣剂包括木霉菌厚垣孢子发酵液、成膜剂、壳寡糖、申嗪霉素、腐殖酸；其中，每升木霉菌厚垣孢子发酵液中含13-17％(W/V)成膜剂、0.35-0.45％(W/V)壳寡糖，0.5-1.5ug/ml申嗪霉素、0.05-0.1％(W/V)腐殖酸。优选地，每升木霉菌厚垣孢子发酵液中含1.0ug/ml申嗪霉素、0.06％(W/V)腐殖酸。优选地，所述成膜剂包括853成膜剂。优选地，所述木霉菌为哈茨木霉SH2303，保藏号：CTCCSJ-A-QT11266。优选地，所述木霉菌厚垣孢子发酵液的制备包括如下：以0.5％(V/V)的接种量将一级菌种接种于木霉菌液体发酵培养基中，28℃发酵培养7天，即得；其中，所述一级菌种是将木霉菌菌饼以3-5片/三角瓶的接种量于PD培养基中、180r/min、28℃条件下培养5天获得的。优选地，所述木霉菌液体发酵培养基的组成包括：每1000升木霉菌液体发酵培养基中含玉米粉40kg、硫酸镁400g、硫酸亚铁6.0g、硫酸锰2.0g、硫酸锌1.6g、硫酸二氢钾3.06kg、硝酸钠1.13kg、硝酸铵880g、氯化钙800g，余量为水，初始pH调节为4-5。本发明所述的PD培养基及木霉菌液体发酵培养基在使用前均经121℃高压灭菌25min。优选地，所述发酵培养的装罐量控制在：200L液体发酵培养基装入300L发酵罐中。第二方面，本发明提供一种所述种衣剂的制备方法，包括如下步骤：按所述比例将壳聚糖、申嗪霉素、腐殖酸、木霉菌厚垣孢子发酵液混合，然后加入成膜剂混合，即得种衣剂。第三方面，本发明提供一种所述木霉菌种衣剂作为生防制剂在控制玉米土传病害中的应用。优选地，所述土传病害包括防治玉米茎腐病、纹枯病、根腐病等。第四方面，本发明提供一种所述木霉菌种衣剂在控制玉米土传病害中的使用方法，具体为将所述木霉菌种衣剂与玉米种子按质量比为1:(10-15)均匀混合，即可。本发明经过木霉菌初筛，复筛纯化后保存于玻璃试管斜面中。在玉米粉培养液中进行液体发酵使其产生木霉菌厚垣孢子发酵液，将含有大量厚垣孢子的发酵液(1亿CFU/mL)与成膜剂、壳寡糖、申嗪霉素、腐殖酸按照回应面设计获得的最佳配比混合制成木霉菌种衣剂，包衣玉米种子(1:10-1:15W/W)，在温室与田间进行播种。与对照相比，防治玉米土传病害效果显著，平均达60％以上。与现有技术相比，本发明的优点在于：1.该木霉菌复合生物种衣剂中不仅有木霉菌厚孢子发酵液，同时还有壳寡糖和申嗪霉素(吩嗪-1-羧酸)两种生物源农药成分。研究表明，木霉菌发酵液具有抑制镰孢菌(Fusariumspp)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、腐霉菌(Pythiumspp)的作用同时诱导玉米抗性，壳寡糖(Chitosanoligosaccharide)具有诱玉米抗性的功能，而申嗪霉素具有抑制纹枯病菌的功能。2.木霉菌生物种衣剂是由三种生物源成分优化组配而成，功能上优势互补，是一种防治玉米土传病害的新型种衣剂；不仅对玉米茎腐病，纹枯病等有较明显的防效，同时还对植物的生长指标有显著的促进作用、提高植物抗逆性，增加作物产量。3.按照本发明提供的木霉菌生物种衣剂，按照一定比例要求包衣玉米种子并播种，对土壤无污染。在四川南充、宁夏银川、河北石家庄、贵州遵义、辽宁丹东、江苏南京等地田间试验，木霉菌生物种衣剂对玉米茎腐病、纹枯病防效均能达到60％以上，玉米增产10％以上。4.本发明适用于大多数具有良好生防效果的木霉菌菌株，制作方法简单，成本低，适合于不同规模生产，市场前景广阔。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1是成膜剂种类筛选结果示意图；图2是本发明种衣剂货架期测定结果示意图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。实施例11、平板菌种活化：将哈茨木霉SH2303接种于PDA培养皿中，28℃培养箱中倒置培养4-5天。PDA培养基：200g马铃薯蒸煮后过滤的上层汁液，20g葡萄糖，20g琼脂粉，纯净水定容至1L，每250mL分装至500mL三角瓶，121℃高压灭菌25min。2、一级菌种的制备：200g马铃薯，20g葡萄糖，纯净水1L，每250mL分装至500mL三角瓶，121℃高压灭菌25min。接入平板菌种，置于180r/min、28℃摇床中摇瓶培养5天，得到哈茨木霉SH2303液体发酵菌种。3、木霉菌液体发酵：玉米粉8kg、硫酸镁80g、硫酸亚铁1.2g、硫酸锰0.4g、硫酸锌0.32g、硫酸二氢钾0.61kg、硝酸钠0.23kg、硝酸铵176g、氯化钙160g，水补足200L，装入300L发酵罐。培养基初始pH调节为4-5。121℃下高温灭菌40-60min。接入重量比为0.5％的木霉菌液体发酵菌种，发酵温度为28℃，发酵时间7天，即为最终木霉菌厚垣孢子发酵液。4、木霉菌生物种衣剂制备：木霉菌发酵液1L，壳聚糖4g，申嗪霉素1mg，腐殖酸0.6g，充分混合。上述混合液与13％(W/V)成膜剂混合，即为木霉菌生物种衣剂。5、木霉菌生物种衣剂促进玉米幼苗生长作用温室盆栽实验结果显示，与对照相比，种衣剂包衣处理后种子出苗率、植株株高和主根长都有一定程度的增加，增加率分别为6.32％、9.84％和3.34％，但均与对照差异不显著(p>0.05)；其他各生长指标与对照差异显著(表3)。表3种衣剂包衣处理对玉米生长的影响实施例21、平板菌种活化：将哈茨木霉菌SH2303接种于PDA培养皿中，28℃培养箱中倒置培养4-5天。PDA培养基：200g马铃薯蒸煮后过滤的上层汁液，20g葡萄糖，20g琼脂粉，纯净水定容至1L，每250mL分装至500mL三角瓶，121℃高压灭菌25min。2、一级菌种的制备：200g马铃薯，20g葡萄糖，纯净水1L，每250mL分装至500mL三角瓶，121℃高压灭菌25min。接入平板菌种，置于180r/min、28℃摇床中摇瓶培养5天，得到木霉菌液体发酵菌种。3、木霉菌液体发酵：玉米粉8kg、硫酸镁80g、硫酸亚铁1.2g、硫酸锰0.4g、硫酸锌0.32g、硫酸二氢钾0.61kg、硝酸钠0.23kg、硝酸铵176g、氯化钙160g，水补足200L，装入300L发酵罐。培养基初始pH调节为4-5。121℃下高温灭菌40-60min。接入重量比为0.5％的木霉菌液体发酵菌种，发酵温度为28℃，发酵时间7天，即为最终木霉菌厚垣孢子发酵液。4、木霉菌生物种衣剂的制备：木霉菌发酵液1L，壳聚糖4g，申嗪霉素1mg，腐殖酸0.6g，充分混合。上述混合液与17％(W/V)853成膜剂混合，即为木霉菌生物种衣剂。按药种比1:10(W/W)拌种。以空白种衣剂(仅含成膜剂)为对照。5、生物种衣剂社区试验：将培养于茎腐病镰孢菌或纹枯病菌用麦粒培养基培养10天，在玉米播种时，接种在种子周围，每穴2g麦粒接种物，每个处理接种50穴，重复三次，对照包衣空白种衣剂，待玉米进入灌浆期，考察对玉米茎腐病的发生率、计算防效。发病率％＝病株数/调查总株数×100％防效＝[(对照田的发病率-处理田的发病率)/对照田发病率]×100％社区试验表明：生物种衣剂包衣处理后，病情指数由对照的70下降到45.83；枯叶数、早衰率均比对照低，差异均达极显著水平(p<0.01)；倒伏率低于对照，差异均达到显著水平(p<0.05)；穗垂率也低于对照，但差异不显著(p>0.05)。表明种衣剂包衣后能减轻玉米茎基腐病的发生情况(表4)。进一步调查表明：木霉菌生物种衣剂对茎腐病和纹枯病防效明显，对纹枯病防效达57.35％，对茎腐病的防效达到了75％。表4种衣剂对玉米茎腐病的防效表5种衣剂对纹枯病和茎腐病的防效处理纹枯病病株率(％)防效(％)茎腐病病株率(％)防效(％)重复113.5055.003.7575.00重复211.2562.503.7575.00重复313.6554.553.7575.00CK30.00----15.00----实施例31、平板菌种活化：将哈茨绿木霉SH2303接种于PDA培养皿中，28℃培养箱中倒置培养4-5天。PDA培养基：200g马铃薯蒸煮后过滤的上层汁液，20g葡萄糖，20g琼脂粉，纯净水定容至1L，分装至250mL三角瓶，121℃高压灭菌25min。2、一级菌种的制备：200g马铃薯，20g葡萄糖，纯净水1L，分装至250mL三角瓶，121℃高压灭菌25min。接入平板菌种，置于180r/min，28℃摇床中摇瓶培养5天，得到哈茨木霉SH2303液体发酵菌种。3、木霉菌液体发酵：玉米粉8kg、硫酸镁80g、硫酸亚铁1.2g、硫酸锰0.4g、硫酸锌0.32g、硫酸二氢钾0.61kg、硝酸钠0.23kg、硝酸铵176g、氯化钙160g，水补足200L，装入300L发酵罐。培养基初始pH调节为4-5。121℃下高温灭菌40-60min。接入重量比为0.5％的木霉菌液体发酵菌种，发酵温度为28℃，发酵时间7天，即为最终木霉菌厚垣孢子发酵液。4、木霉菌生物种衣剂制备：木霉菌发酵液1L，壳聚糖4g，申嗪霉素1mg，腐殖酸0.6g，充分混合。上述混合液与14％(W/V)853成膜剂混合，即为木霉菌生物种衣剂。按药种比1：15(W/W)拌种。5、田间应用试验：供试基地安排为贵州遵义、四川南充、河北石家庄等地。当地主栽的玉米品种，种子均匀、发芽率正常。选择历年发生病虫害较重，地势平坦，不易积水，不易发生旱涝的地块为供试田地块；试验设计采用随机区组排列。结果表明：木霉菌生物种衣剂对这三种病害有较好的防效(表6)。表6木霉菌生物种衣剂防治土传病害效果本发明种衣剂组分对不同病原菌都有不同程度的抑制和拮抗机理。本试验通过不同浓度配比对比研究表明，壳聚糖浓度为3.5-4.5mg/mL、嗪霉素浓度为1ug/mL二者共同对玉米镰刀菌有较为明显的抑制作用，抑制率为53.3％。此浓度配比与木霉菌厚垣发酵液共同对镰刀菌的抑制效果达到了62.9％。而在此基础上，加入不同比例的腐殖酸，对病原菌的抑制作用有很明显的不同。腐殖酸含量在0.05-0.1％(W/V)范围内，组合配比对病原菌的防效与对照相比极显著，同时比不加入腐殖酸的配比防效同样差异显著，防效明显提高，达到73.5％。而在腐殖酸浓度低于0.05％(W/V)或高于0.1％(W/V)范围时，防效明显下降，甚至腐殖酸的加入对前者配比的抑制病菌作用有一定的副作用。因此，严格按照0.05-0.1％(W/V)的比例加入配比中制成复合型木霉菌种衣剂对病原菌有极明显的防效。(表7a、表7b)同时，本发明种衣剂组分对玉米的生长有一定的促进作用。壳聚糖浓度为3.5-4.5mg/mL、嗪霉素浓度为1ug/mL二者共同对玉米胚根和胚芽生长有促进作用，但促进作用不明显；而此浓度配比与木霉菌厚垣发酵液复合后，对玉米胚芽及胚根的生长都有明显的促进作用；胚芽的生长量达到对照的两倍，胚根伸长35.2％。在上述复合配比中加入一定比例的腐殖酸后，增效极为显著，胚根伸长量增加52.6％，胚芽伸长量增加42.3％。而加入腐殖酸的量在0.05-0.1％(W/V)之外，对玉米胚根及胚芽的生长促进效果不明显，甚至有抑制生长趋势。这说明，腐殖酸在一定范围内与木霉菌促生长机理存在协同作用。(表8a、表8b)通过优化三元组合配方，并与成膜剂等载体混合制成生物种衣剂，制作方法简便，成本低，适于不同规模生产使用。本发明通过优化组合配方后，与成膜剂按照一定比例混合制成生物种衣剂。经过试验，不同成膜剂及其含量的不同对种衣剂的防病效果都有一定的影响。经过筛选，选择一种对生防木霉菌的生长无影响的成膜剂(图1)。试验表明，成膜剂853对木霉菌生长无副作用，甚至有一定的促进生长作用。本发明将通过对优化组合后的配方与不同浓度853成膜剂混合，对镰刀菌及立枯丝核菌进行抑菌率的测定(表9)。结果表明，不同浓度的853成膜剂在与上述优化配比配方混合后，对病菌的抑制作用有明显的影响。当成膜剂浓度范围在13-17％(W/V)时，抑菌率为68％，差异极显著。而浓度范围在低于或高于此范围时，抑菌半径与对照相比差异显著性不明显甚至不显著。这说明一定浓度成膜剂(丙烯酰胺改性合成聚合物)与上述优化后的配方成分可能具有协同作用，促进某种物质或促进木霉菌的生防抑菌作用，从而对病原菌的抑制率明显提高。本发明种衣剂与玉米种子按照不同比例进行配比，观察不同配比处理对玉米苗期土传病害的防治效果的影响，确定药种比。由下表可知，不同药种比包衣处理之间存在差异。对玉米苗期茎腐病和纹枯病均为药种比1:10的包衣处理防效最高，相对防效分别为78％和67.59％。木霉单独包衣不同剂量处理间防效差异较大，以药种比1:20时相对防效最高，防效与剂量相关性不强。其中种衣剂药种比1:10处理后纹枯病及茎腐病的病情指数远远低于对照和化学农药处理，分别为17.50和16.00，相对防效(67.59％)(78.00％)为最高。综合分析，木霉菌生物型种衣剂包衣处理后，可降低玉米苗期病情指数，最佳配比为1:10，为后期的生长和抗病能力奠定了良好的基础。注：处理①-③分别为种衣剂按1:10、1:20、1:40药种比包衣种子；④-⑥以木霉固体发酵物按1:10、1:20、1:40药种比包衣种子；⑦为化学农药恶霉灵；⑧空白对照(CK)。“-”为不存在。实施例41、平板菌种活化：将哈茨绿木霉SH2303接种于PDA培养皿中，28℃培养箱中倒置培养4-5天。PDA培养基：200g马铃薯蒸煮后过滤的上层汁液，20g葡萄糖，20g琼脂粉，纯净水定容至1L，分装至250mL三角瓶，121℃高压灭菌25min。2、一级菌种的制备：200g马铃薯，20g葡萄糖，纯净水1L，分装至250mL三角瓶，121℃高压灭菌25min。接入平板菌种，置于180r/min，28℃摇床中摇瓶培养5天，得到哈茨木霉SH2303液体发酵菌种。3、木霉菌液体发酵：玉米粉8kg、硫酸镁80g、硫酸亚铁1.2g、硫酸锰0.4g、硫酸锌0.32g、硫酸二氢钾0.61kg、硝酸钠0.23kg、硝酸铵176、氯化钙160g，水补足200L，装入300L发酵罐。培养基初始pH调节为4-5。121℃下高温灭菌40-60min。接入重量比为0.5％的木霉菌液体发酵菌种，发酵温度为28℃，发酵时间7天，即为最终木霉菌厚垣孢子发酵液。4、木霉菌生物种衣剂制备：木霉菌发酵液1L，壳聚糖4g，申嗪霉素1mg，腐殖酸0.6g，充分混合。上述混合液与14％(W/V)成膜剂混合，即为木霉菌生物种衣剂。5、对上述生物种衣剂进行货架期的测定。哈茨木霉菌厚垣孢子发酵液中最初含孢量为2.5×108CFU/mL，以不加壳聚糖为种衣剂对照。结果表明，壳聚糖在种衣剂中不仅可以对病原菌有抑制作用，作为一种糖类物质，保护剂的一种，为种衣剂中的木霉菌孢子提供持续营养成分，使其货架期延长，6个月后，孢子量可达1.56×108CFU/g，见图2。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。当前第1页1 2 3