一种Peptaibols类抗菌肽及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明涉及一种抗菌肽及其制备方法和应用。将橘绿木霉发酵培养得到发酵液，再通过树脂吸附、溶剂萃取、以及减压浓缩等工艺获得抗菌肽。本发明方法制备的抗菌肽不仅对多种植物病原菌具有良好的拮抗和防治效果，同时不造成环境污染。当今，化学农药滥用产生的环境污染以及植物病原菌对多种化学农药产生抗药性的问题日益严重，对新型抗菌肽类杀菌剂的开发和利用，不仅能防治农业生产中的病、虫害，还降低了化学农药的使用量，保护了生态环境，具有广阔的应用前景。CGMCC No.872220140114
【专利说明】
一种Pepta i bo I s类抗菌肽及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种Peptaibols类抗菌肽及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 随着社会对环保的日益关注，生物农药已经被越来越多的人所关注和接受。木霉 菌由于其资源丰富、生长繁殖快、竞争机制多样化，对很多的病原真菌都具有良好的防治效 果，是国际上普遍应用的生防真菌，在植物病害防治领域占有非常重要的地位。产生抗生类 物质是木霉菌生防功能的重要机制之一，其产生的挥发性和非挥发性抗菌类次生代谢产物 多达几百种，按照化学结构分类，主要有以下六大类:聚酮类、氨基酸及其衍生物、含氮及杂 环化合物、萜烯类、留族类、羧酸衍生物。
[0003] Peptaibols是指一类由非核糖体肽合成酶(NRPSs)合成的富含α-氨基异丁酸Aib、 具烷基化的N-末端和羟基化的C-末端、具α-螺旋线性结构、对多种细菌和真菌等具有拮抗 作用的一类特殊的肽类抗生素的总称，其可与膜系统结合形成跨膜离子通道破坏膜系统而 具有广泛的抗菌活性。该类物质主要由木霉属（Trichoderma spp.)真菌及其相近的属产 生，并表现出了多样的生物学活性，可以促进儿茶酚的分泌、使线粒体氧化磷酸化的解偶 联、溶血活性、免疫抑制活性等。
[0004] 实现生物抗菌肽工业化生产的关键是低成本的大规模发酵和提取，这两者也是制 约生物抗菌肽市场竞争力的主要因素。近年来，国内外的研究者们一直致力于木霉菌中抗 菌肽的分离纯化和生物活性机理研究，而规模化的高效生产没有取得关键性突破。2006年 西班牙-葡萄牙农业研究中心Vizcaino JA等人报道了哈茨木霉菌（T.harzianum CECT 241 3)用液体发酵生产Peptaibols需14天。2007年宋晓妍等人报道了康宁木霉菌 (T.koningii SMF2)用固体培养方式培养3天产生Peptaibols，但是每公斤培养基仅能产 生146.20毫克的Trichokonin IV，产量较低。综上所述，目前从木霉菌中提取抗菌肽，不管 是液体发酵还是固体发酵，均存在效率低下的问题，离大规模生产差距较大。
[0005] 高效液相色谱法是是目前应用广泛的分离、分析、纯化有机化合物(包括能通过化 学反应转变为有机化合物的无机物)的有效方法之一。约有80 %已知的有机化合物，能用高 效液相色谱法分离、分析，而且由于此方法条件温和，不破坏样品，因此特别适合高沸点、难 气化挥发、热稳定性差的有机化合物和活性物质。利用该方法可准确得知样品中抗菌肽的 含量，可以用此解决生物抗菌肽的生产、分离提取工艺参数的改进及产品质量的控制问题。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种生产抗菌肽的橘绿木霉菌Trichoderma citrinoviride，该菌 株于2014年1月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址 为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.8722。 [0007]本发明的第一个目的是提供一种Peptaibols类抗菌肽的制备方法，具体包括以下 步骤：
[0008] 步骤1:菌株发酵培养
[0009] 将橘绿木霉菌接种到一级种子培养基中进行培养得到种子液，然后将种子液接种 到发酵培养基中进行深层发酵，发酵48-72h后得到发酵产物；
[00?0] 步骤2:Peptaibols类抗菌肽提取物的制备
[0011]将步骤1中得到的发酵产物进行离心过滤，滤液用大孔树脂吸附，最后用乙醇洗脱 并收集洗脱液，将洗脱液浓缩得到Peptaibols类抗菌肽提取物；
[0012]步骤3:Peptaibols类抗菌肽提取物的分离纯化
[0013] 将步骤2中处理得到的Peptaibols类抗菌肽提取物用甲醇溶解后，用滤膜过滤，然 后将滤液过反向制备柱得到Peptaibols类抗菌肽。
[0014] 优选的地，上述步骤1中一级种子培养基包括硝酸钠2-6g/L、磷酸氢二钾0.5-6g/ L、硫酸镁0 · 2-2g/L、氯化钾0 · 2-2g/L、硫酸亚铁0 · 005-0 · 015g/L、蔗糖20-60g/L和酵母提取 粉l-10g/L。
[0015] 更优选地，上述步骤1中一级种子培养基包括硝酸钠3g/L、磷酸氢二钾lg/L、硫酸 镁0.5g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸亚铁0.01g/L、蔗糖30g/L和酵母提取粉5g/L。
[0016] 优选地，上述步骤1中发酵培养基包括土豆粉12_35g/L、葡萄糖10_42g/L、 KH2PO4O · l_2g/L、FeS〇4〇 · 03-0 · 25mg/L、MnS〇4l_12mg/L和氨基酸l-8g/L。
[0017] 更优选地，上述步骤1中发酵培养基包括土豆粉20g/L、葡萄糖25g/L、KH2P〇4〇. 5g/ L、FeS〇4〇 · 15mg/L、MnS〇45 · Omg/L 和氛基酸 5g/L。
[0018] 优选地，上述步骤1中一级种子培养的培养条件是28-30°C，搅拌速度150r/min，通 气量 〇.8V/V，pH7.1。
[0019] 优选地，上述步骤1中一级种子培养时间为24-36h。
[0020] 优选地，上述步骤1中深层发酵的工艺参数为:温度28-35°C，搅拌转速140r/min， 通气量500L/min，罐压0.10~0.12Mpa，pH7.0，消泡剂含量为0.3 %。
[0021] 优选地，上述步骤2中大孔吸附树脂是中等极性大孔吸附树脂。
[0022] 更优选地，上述步骤2中大孔吸附树脂是HZ806。
[0023] 优选地，上述步骤2中乙醇洗脱分为两步，第一步：用20%乙醇洗脱去除杂质；第二 步:用50 %乙醇洗脱，并收集洗脱液浓缩得到抗菌肽提取物。
[0024]本发明的第二个目的是提供一种上述方法制备得到的一种Peptaibols抗菌肽。
[0025] 优选地，上述的抗菌肽是？6口七3：[13018类抗菌肽，其全序列为4;[13-413-4;[13-41&- Aib-Ala-Gln-Aib-Val-Aib-Gly-Leu-Aib-Pro-Val-Aib-Val-Gln-Gln-Fol，如SEQ NO:1所 示。该Peptaibols类抗菌肽稳定性强，在pH为2.0-11.0、温度为10-100°C条件下均能保持其 活性。
[0026]本发明的第三个目的是提供一种上述Peptaibols抗菌肽在制备防治植物病原菌 药物中的应用。
[0027]优选地，上述的植物病原菌包括:葡萄座腔菌、核盘菌、玉蜀黍丝核菌、新月弯孢霉 菌、瓜果腐霉菌、灰葡萄孢菌、茄链格孢菌、尖孢镰刀菌、草莓炭疽菌和稻梨孢菌。
[0028] 本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0029] (1)与传统技术不同的是，本发明在发酵前期通过添加外源添加物来提高橘绿木 霉菌发酵生产抗菌肽的能力，该方法操作简单，不增加额外的人工和设备，通过较低的附 加投入提高产物生成量，具有重大的经济效益；
[0030] (2)与传统方法相比，本发明采用大孔树脂吸附分离技术，所得提取物体积更小， 工艺操作简单，并且树脂可以反复使用，成本低，节约了大量的能耗、储藏和运输等费用；
[0031] (3)与传统方法生产的抗菌肽相比，本发明的发酵培养基生产的抗菌肽，具有更广 谱的抗菌活性、pH范围更广、耐热性能更好，生物效价更高，该抗菌肽不仅对多种植物病原 菌具有良好的拮抗和防治效果，同时不造成环境污染；
[0032] (4)传统方法生产抗菌肽的方法成本高，周期长，成为了制约生物抗菌肽市场竞争 力的主要因素，而本发明中的生产抗菌肽的方法，原料成本低廉，发酵周期很短，具有广阔 的应用前景。
【附图说明】
[0033]图1为实施例4中的对照品的高效液相色谱图；
[0034]图2为实施例4中的标准曲线。
【具体实施方式】
[0035] 下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明， 但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0036] 实施例1
[0037] 本实施例为菌株发酵培养，包括如下步骤：
[0038] 步骤a:首先配制50L液体培养基，装于75L发酵罐中，pH7.1，121°C灭菌20min，冷却 后备用。所述液体培养基包括15g硝酸钠3g/L、磷酸氢二钾lg/L、硫酸镁(MgS04 · 7H20) 0.5g/L、氯化钾0.5/L g、硫酸亚铁0.01g/L、蔗糖30g/L和酵母提取粉5g/L，以软化水补齐体 积到50L。121°C蒸汽灭菌20min，冷却至28 °C待用；
[0039]步骤b:按照微生物学常规培养方法，挑取少量保存于20%甘油管中的橘绿木霉菌 菌块接种于PDA平板表面，26°C培养四天，作为摇瓶发酵培养的菌种，待用；
[0040] 步骤C:在无菌操作条件下，刮取待用PDA平板表面木霉菌孢子，火焰接种到75L发 酵罐，发酵条件为:28-30°C，150rpm/min，无菌空气通气量35L/min，培养30小时；
[0041] 步骤d:按体积比2-10% (V/V)移种，到1000L发酵罐，进行深层发酵。其中，液体发 酵培养基中包括土豆粉 20g/L，葡萄糖 25g/L，KH2P040 · 5g/L、FeS040 · 15mg/L、MnS045 · Omg/ L、LA2063g/L和天冬酰胺5g/L，调节其PH至7.0，；发酵工艺参数为：温度29 °C，搅拌转速 140r/min，通气量500L/min，消泡剂0.3 %。发酵72h后得到发酵产物。
[0042] 实施例2
[0043]本实施例为Peptaibols类抗菌肽提取物的制备，包括如下步骤：
[0044] 步骤a:将上述深层发酵后的发酵产物进行离心过滤，得到500L滤液和150L菌丝 体；
[0045] 步骤b:将步骤a中所得滤液用20L大孔树脂HZ806进行吸附后，以40L 20%乙醇洗 脱去除杂质，再以40L 50%乙醇洗脱收集该浓度洗脱液；
[0046]步骤c:将所收集的洗脱液60°C减压浓缩得到淡黄色含该抗菌肽的固体提取物。
[0047] 实施例3
[0048]本实施例为Peptaibols类抗菌肽提取物的分离纯化，包括如下步骤：
[0049]步骤a:将含量为85 %的抗菌肽提取物用甲醇溶解，0.45um微孔滤膜过滤后，用反 相制备柱进行该抗菌肽纯品的制备。制备条件为:Agela Innoval 0DS-2制备柱(5um，21.2 X250mm)，流动相为甲醇:7义=4:1，流速为16ml/min，检测波长为210nm;
[0050]步骤b:收集保留时间为45min的组分，减压浓缩后既得纯品。
[0051 ] 实施例4
[0052]本实施例为发酵液和提取物中抗菌肽含量的测定，包括如下步骤：
[0053] (1)标准曲线的绘制
[0054]用电子分析天平准确称取抗菌肽纯品O.OlOg溶解于lml甲醇中，然后用容量瓶定 容至25ml，得到浓度为400ppm的储备液。测定时用甲醇将储备液分别稀释到100、50、25、 12.5、6.25ppm，共5个梯度。使用Agela的HP P050二元高压梯度栗，Agela的0DS-2分析柱 (Innoval 0DS-2，5um，4.6 X 250mm)和Agela UV2000D可变波长紫外检测器对该抗菌肽进行 高效液相分析，色谱条件为:流动相为乙腈:水=3:2，流速为lml/min，检测波长为210nm:在 该检测条件下，抗菌肽的保留时间为40min，峰半高宽为20.9s，色谱峰峰形对称性较好，对 照品的图谱如图1所示。按照以上色谱条件测定并绘制标准曲线，标准曲线如图2所示。
[0055] 2)本测定方法回收率、准确度和精密度的计算
[0056] 平行取3个空白样品，各加入定量的标准品，同样的色谱条件测定。回收率按照下 列公式计算：
[0057] (加标样品测定值-空白样品测定值)/实际加标量X 100%
[0058] 准确度为不同浓度的标准样品含量的测量值和实际值之间的标准偏差;精密度为 同一标准样品多次测定的变异系数，试验结果如表1所示。
[0059] 表1回收率、准确度和精密度的计算
[0060]
[0061 ] 3)发酵液中抗菌肽含量和精密度测定
[0062] 取2ml发酵液，加入6ml无水乙醇，震荡后8000r离心，取上清液，0.45um微孔滤膜过 滤后，取200ul滤液加入800ul甲醇，混匀，在相同色谱条件下测定提取物中抗菌肽的峰面 积，同一样品重复测定3次计算精密度，试验结果如表2所示。
[0063]表2发酵液中抗菌肽含量和精密度测定
[0065] 4)提取物中抗菌肽含量和精密度测定
[0066] 用电子分析天平准确称取粗提物0.010g，加入lml甲醇溶解后，定容至25ml， 0.45um微孔滤膜过滤，在相同色谱条件下测定提取物中抗菌肽的峰面积，同一样品重复测 定3次计算精密度，结果如表3所示。
[0067] 表3提取物中抗菌肽含量和精密度测定
[0069] 实施例5
[0070] 本实施例为抗菌肽对植物病原真菌的拮抗活性测试，包括如下步骤：
[0071 ] 步骤a:将抗菌肽纯品配制成一系列浓度（0 · lppm、0 · 5ppm、lppm、5ppm、lOppm、 40ppm、70ppm、lOOppm)，含药]培养基在121 °C、20min灭菌后制成不同浓度的直径为85mm 的含药平板；
[0072]步骤b:将生长于TOA平板的病原真菌用打孔器制成直径为0.5cm的菌饼，然后将它 们分别接入已冷却的上述含药平板中央，每个浓度每种病原接种3个平行，25°C恒温培养至 空白对照长满，用十字交叉法测量各处理菌落直径。
[0073] 根据公式，抑制率（％ )=[(对照皿菌落平均直径-处理皿菌落平均直径)/(对照皿 菌落平均直径_5)]X100,计算抑菌率，并利用SPSS19.0统计软件，求得IC50值及毒力回归 方程，结果如表4所示。
[0074] 结果如表4所示，该抗菌肽对所测试病原均具有较强的拮抗作用，其IC50值均在 50mg/L以下，尤其是对葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea和玉蜀泰丝核菌Rhizoctonia zeae，其 IC50 值分别为 3 · 3mg/L和 0 · 9mg/L。
[0075] 表4抗菌肽对不同病原真菌的抑制活性
[0078] 本发明的发酵培养基生产的抗菌肽，具有更广谱的抗菌活性、pH范围更广、耐热性 能更好，生物效价更高，该抗菌肽不仅对多种植物病原菌具有良好的拮抗和防治效果，同时 不造成环境污染，本实施例展现了抗菌肽在防治植物病害方面的广阔应用前景。
[0079] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种Peptaibols类抗菌肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤1:菌株发酵培养 将橘绿木霉菌接种到一级种子培养基中进行培养得到种子液，然后将种子液接种到发 酵培养基中进行深层发酵，发酵48-72h后得到发酵产物； 步骤2: Peptaibols类抗菌肽提取物的制备 将步骤1中得到的发酵产物进行离心过滤，滤液用大孔树脂吸附，最后用乙醇洗脱并收 集洗脱液，将洗脱液浓缩得到Peptaibols类抗菌肽提取物； 步骤3: Peptaibols类抗菌肽提取物的分离纯化 将步骤2中处理得到的Peptaibols类抗菌肽提取物用甲醇溶解后，用滤膜过滤，然后将 滤液过反向制备柱得到Peptaibols类抗菌肽。2. 根据权利要求1所述的Peptaibol s类抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述步骤1中 一级种子培养基包括硝酸钠2_6g/L、磷酸氢二钾0.5-6g/L、硫酸镁0.2-2g/L、氯化钾0.2-2g/L、硫酸亚铁0 · 005-0 · 015g/L、蔗糖20-60g/L和酵母提取粉l-10g/L。3. 根据权利要求1所述的Peptaibol s类抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述步骤1中 发酵培养基包括土豆粉 12_35g/L、葡萄糖l〇-42g/L、KH2P〇4〇 · l_2g/L、FeS〇4〇 · 03-0 · 25mg/L、 MnSCUl-12mg/L 和氨基酸 l_8g/L。4. 根据权利要求1所述的Peptaibol s类抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述步骤1中 一级种子培养的培养条件是28-30°C，搅拌速度150r/min，通气量0.8V/V，pH7.1。5. 根据权利要求1所述的Peptaibol s类抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述步骤1中 一级种子培养时间为24-36h。6. 根据权利要求1所述的Peptaibol s类抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述步骤1中 深层发酵的工艺参数为:温度28-35°C，搅拌转速140r/min，通气量500L/min，罐压0.10~ 0 · 12Mpa，pH7 · 0，消泡剂含量为0 · 3 %。7. 根据权利要求1所述的Peptaibol s类抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述步骤2中 大孔吸附树脂是中等极性大孔吸附树脂。8. 根据权利要求7所述的Peptaibol s类抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述步骤2中 大孔吸附树脂是HZ806。9. 根据权利要求1所述的Peptaibol s类抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述步骤2中 乙醇洗脱分为两步，第一步：用20 %乙醇洗脱去除杂质；第二步：用50 %乙醇洗脱，并收集洗 脱液浓缩得到Peptaibols类抗菌肽提取物。10. 根据权利要求1-9任意一项方法制备得到的Peptaibols类抗菌肽。11. 根据权利要求11所述的Peptaibol s类抗菌肽，其特征在于，所述的Peptaibols类抗 菌肽的全序列为 Aib-Ala-Aib-Ala-Aib-Ala-Gln-Aib-Val-Aib-Gly-Leu-Aib-Pro-Val-Aib-Val-Gln- Gln-Fol012. 根据权利要求10-11任意一项所述的Peptaibo I s类抗菌肽在制备防治植物病原菌 药物中的应用。13. 根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述植物病原菌包括:葡萄座腔菌、核盘 菌、玉蜀黍丝核菌、新月弯孢霉菌、瓜果腐霉菌、灰葡萄孢菌、茄链格孢菌、尖孢镰刀菌、草莓 炭疽菌和稻梨孢菌。
【文档编号】C07K1/34GK105950691SQ201610325923
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】陈娟, 旷文丰, 陈晨, 王承芳, 吴紫燕, 宋邦乐, 叶乃玮, 毛伟力
【申请人】上海万力华生物科技有限公司