一种发酵制备d-泛解酸内酯的方法

一种发酵制备d-泛解酸内酯的方法
【专利摘要】一种发酵制备D?泛解酸内酯的方法，所述步骤包含：(1) 在培养基中培养尖孢镰孢菌；(2) 将培养后的尖孢镰孢菌与底物混合，水解得到D?泛解酸；(3) 内酯化步骤(2)的D?泛解酸，即得；其中，所述培养基为：甘油1?10%、蛋白胨0.2?2%、酵母膏0.2?2%、玉米浆0.5?5%、螺旋藻多糖0.05?0.2%、甘氨酸0.1?1%、其余为水。
【专利说明】
一种发酵制备D-泛解酸内酯的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物化工领域，更具体的说是涉及一种发酵制备D-泛解酸内酯的方 法。
【背景技术】
[0002] 泛酸，又称遍多酸、维生素 B5,广泛存在于生物界中，是动物体内合成辅酶A的主要 原料，其主要作用是参与糖、脂肪和蛋白质的代谢。人体缺乏泛酸会引起肌肉酸痛或痉挛、 肾上腺机能不足和减退、注意力不集中、手脚麻木、便秘、精力缺乏、轻微锻炼后即筋疲力 尽、忧虑、紧张以及磨牙等症状。泛酸以其特有的生化功能广泛应用于医药、饲料和食品等 领域。其活性成分为D-构型的右旋泛酸，但因泛酸不稳定，其工业应用通常使用稳定性好的 衍生物。目前比较有效、且广为利用的泛酸系列产品是泛酸钙、泛醇、泛硫乙胺等。
[0003] D-泛酸钙是泛酸系列产品中产量最大的一种，也是泛酸最主要的商品形式，广泛 应用于饲料、医药、食品工业中。D-泛酸钙作为辅酶A的组成物质参与调节蛋白质、糖和脂肪 的代谢，改善毛发色泽并预防疾病。特别是家禽家畜及鱼科类动物的生长发育、脂肪的合成 和分解，都不可缺少对泛酸钙的需求。缺乏泛酸会导致家禽、家畜生长迟缓，生殖机能发生 障碍，适应性降低。
[0004] D-泛解酸内酯(D-PL)，是合成D-泛酸系列产品重要的手型中间体。DL-泛解酸内酯 的拆分方法大都是采用化学方法拆分，其缺点是拆分剂昂贵，成本高、分离困难。微生物酶 法拆分，即将合成的中间体DL-泛解酸内酯或其类似物，用特异性酶拆分，得到D-PL，再进一 步合成泛酸系列产品。该方法经济实用，环境友好。尽管现在微生物酶法拆分DL-泛解酸内 酯取得了一些成果，但是在实际应用中仍旧有些问题需要解决，比如发酵过程中产酶速度 较慢、较少;酶在低pH值下不稳定等问题。
[0005] 针对这一问题，本发明提供了 一种发酵制备D-泛解酸内酯的方法。

【发明内容】

[0006] 针对上述问题，本发明提供了一种发酵制备D-泛解酸内酯的方法，所述步骤包含： (1) 在培养基中培养尖孢镰孢菌； (2) 将培养后的尖孢镰孢菌与底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶内酯化步骤⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培养基为:甘油1-10%、蛋白胨〇. 2-2%、酵母膏0.2-2%、玉米浆0.5-5%、螺旋藻多糖 0 · 05-0 · 2%、甘氨酸0 · 1-1%、其余为水。
[0007] 作为本发明的一种实施方式，所述培养基为:甘油1.5%、蛋白胨0.8%、酵母膏1.1%、 玉米浆2.5%、螺旋藻多糖0.1%、甘氨酸0.8%、溶剂为水。
[0008] 作为本发明的一种实施方式，所述培养条件为pH 4-9,在20-40°C、100-300 rpm下 培养0.5-7天。
[0009] 作为本发明的一种实施方式，所述培养条件为pH 4-7,在26-29°C、100-300 rpm下 培养0.5-3天。
[0010] 作为本发明的一种实施方式，所述步骤(2)固定化的步骤为:称取聚乙烯醇和海藻 酸钠并与水混合，水浴加热并搅拌至完全溶化，然后静置冷却至室温，得到聚乙烯醇-海藻 酸钠混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液中加入添加剂，再加入所述湿菌体，混合均 匀，得到菌体混合溶液;用注射器将菌体混合液滴加到交联剂溶液中，浸泡1-3小时，取出， 用去离子水洗涤，即可。
[0011] 作为本发明的一种实施方式，所述聚乙烯醇的含量为1-10%，海藻酸钠的含量为1-10%〇
[0012] 作为本发明的一种实施方式，所述添加剂为硅藻土、活性炭、贝壳粉、石灰粉一种 或几种。
[0013] 作为本发明的一种实施方式，所述交联剂溶液为含有氯化钙和/或硝酸钙和/或氯 化铝的饱和硼酸溶液;所述湿菌体加入量为2-20%。
[0014] 作为本发明的一种实施方式，步骤(2)的水解条件为：用pH 6.0-9.0的Tris-HCl缓 冲液配制5-50%的DL-泛解酸内酯溶液;然后加入微生物菌株和10-50mmol CaCl2。
[0015] 作为本发明的一种实施方式，所述步骤还包括，内酯化D-泛解酸后经提取得到D-泛解酸内酯，其中内酯化和提取条件为:分别用乙酸乙酯萃取3次，分离出含D-泛解酸的水 相;水相用盐酸进行内酯化反应，脱色，过滤;滤液用乙酸乙酯萃取提取有机相，蒸馏回收， 得到D-泛解酸内酯。
【具体实施方式】
[0016] 参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发 明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通 技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
[0017]如本文所用术语"由…制备"与"包含"同义。本文中所用的术语"包含"、"包括"、 "具有"、"含有"或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合 物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或 此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
[0018] 连接词"由…组成"排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此 短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常 规杂质除外。当短语"由…组成"出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时， 其仅限定在该子句中描述的要素;其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
[0019] 当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优 选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围 下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开 了范围"1至5"时，所描述的范围应被解释为包括范围"1至4"、"1至3"、"1至2"、"1至2和4至 5"、"1至3和5"等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端 值和在该范围内的所有整数和分数。
[0020] 单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。"任选的"或者"任意 一种"是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和 事件不发生的情形。
[0021] 说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体 数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相 应的，用"大约"、"约"等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似 用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以 组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。
[0022] 此外，本发明要素或组分前的不定冠词"一种"和"一个"对要素或组分的数量要求 (即出现次数)无限制性。因此"一个"或"一种"应被解读为包括一个或至少一个，并且单数 形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
[0023] "聚合物"意指通过聚合相同或不同类型的单体所制备的聚合化合物。通用术语 "聚合物"包含术语"均聚物"、"共聚物"、"三元共聚物"与"共聚体"。
[0024] "共聚体"意指通过聚合至少两种不同单体制备的聚合物。通用术语"共聚体"包括 术语"共聚物"（其一般用以指由两种不同单体制备的聚合物)与术语"三元共聚物"（其一般 用以指由三种不同单体制备的聚合物）。其亦包含通过聚合四或更多种单体而制造的聚合 物。"共混物"意指两种或两种以上聚合物通过物理的或化学的方法共同混合而形成的聚合 物。
[0025] 针对上述问题，本发明提供了一种发酵制备D-泛解酸内酯的方法，所述步骤包含： (1) 在培养基中培养尖孢镰孢菌； (2) 将培养后的尖孢镰孢菌与底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶内酯化步骤⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培养基为:甘油1-10%、蛋白胨〇. 2-2%、酵母膏0.2-2%、玉米浆0.5-5%、螺旋藻多糖 0 · 05-0 · 2%、甘氨酸0 · 1-1%、其余为水。
[0026]甘油:指丙三醇，无色味甜澄明黏稠液体。无臭。有暖甜味。含量为1-10%。
[0027]蛋白胨：蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄 色的粉剂，具有肉香的特殊气息。蛋白质经酸、碱或蛋白酶分解后也可形成蛋白胨。蛋白胨 富含有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类。它可以作为微生物培养基的主要原料，在抗 生素、医药工业、发酵工业、生化制品及微生物学科研等领域中的用量均很大，可以用来治 疗消化道疾病；不同的生物体需要特定的氨基酸和多肽，因此存在着各种蛋白胨，一般来 说，用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白（酪蛋白、肉类）、植物蛋白（豆类）、微生物蛋白（酵 母)等三种。能为微生物提供C源、N源、生长因子等营养物质。含量为0.2-2%。
[0028]酵母膏：指酵母浸膏，酵母浸膏富含完全蛋白质，均衡的必需氨基酸以及B族维生 素、核苷酸、微量元素等，是最为理想的生物培养基原料和发酵工业中的主要原料，其功效 与8倍的酵母相当，可以大大提高菌种的生产速率及发酵产品得率。酵母浸膏从原料来源可 分为面包酵母浸膏、啤酒酵母(酿造啤酒的副产物)和假丝酵母。含量为0.2-2%。
[0029]玉米浆：制造玉米淀粉须将玉米粒先用亚硫酸浸泡，浸泡液浓缩即制成黄褐色的 液体，叫玉米浆。玉米浆中含有丰富的可溶性蛋白、生长素和一些前体物质，含大约40%~ 50%固体物质。味道:微咸。在玉米浸泡过程中若长有乳酸菌和酵母菌，则提高玉米浆的质 量;若长有腐败性细菌则降低玉米浆的质量。玉米浆是微生物生长很普遍应用的有机氮源。 含量为0.5-5%。
[0030]螺旋藻多糖:属于蓝藻多糖类。从螺旋藻提取出的生理活性多糖，无 毒。
[0031 ]螺旋藻多糖的提取:提取螺旋藻多糖时先将螺旋藻干粉进行破壁处理，用低极性 溶剂去亲脂性成分，经热水抽提或碱液冷抽提，取上清液浓缩，乙醇醇析后离心、干燥得螺 旋藻粗多糖。螺旋藻中蛋白质约占细胞干重的60-70%，因此提取螺旋藻多糖关键是有效地 去除蛋白质。目前，去蛋白质的方法主要有以下几种 :Sevag法、泡沫分离技术、三氯乙酸法、 加热浓缩法、酶法。Sevag法是去蛋白质的经典方法，通常只适用于除少量蛋白，而且必须重 复多次。TCA法去蛋白能缩短流程，多糖损失率降低，有利于后继纯化。用酶法降解蛋白质能 提高多糖粗产品的得率。含量为〇. 05-0.2%。
[0032]甘氨酸:又名氨基乙酸。含量为0.1-1%。
[0033]作为本发明的一种实施方式，培养条件为pH 4-9,在20-40°C、100-300 rpm下培养 0.5-7 天。
[0034]作为本发明的一种实施方式，所述培养基为:甘油1.5%、蛋白胨0.8%、酵母膏1.1%、 玉米浆2.5%、螺旋藻多糖0.1%、甘氨酸0.8%、溶剂为水。
[0035]作为本发明的一种优选方式，所述培养条件为pH 4-7,在26-29°C、100-300 rpm下 培养0.5-3天。
[0036] 泛酸 泛酸，又称遍多酸、维生素 B5,广泛存在于生物界中，是动物体内合成辅酶A的主要原 料，其主要作用是参与糖、脂肪和蛋白质的代谢。人体缺乏泛酸会引起肌肉酸痛或痉挛、肾 上腺机能不足和减退、注意力不集中、手脚麻木、便秘、精力缺乏、轻微锻炼后即筋疲力尽、 忧虑、紧张以及磨牙等症状。泛酸以其特有的生化功能广泛应用于医药、饲料和食品等领 域。其活性成分为D-构型的右旋泛酸，但因泛酸不稳定，其工业应用通常使用稳定性好的衍 生物。目前比较有效、且广为利用的泛酸系列产品是泛酸钙、泛醇、泛硫乙胺等。
[0037] D-泛酸钙是泛酸系列产品中产量最大的一种，也是泛酸最主要的商品形式，广泛 应用于饲料、医药、食品工业中。D-泛酸钙作为辅酶A的组成物质参与调节蛋白质、糖和脂肪 的代谢，改善毛发色泽并预防疾病。特别是家禽家畜及鱼科类动物的生长发育、脂肪的合成 和分解，都不可缺少对泛酸钙的需求。缺乏泛酸会导致家禽、家畜生长迟缓，生殖机能发生 障碍，适应性降低。
[0038] D-泛醇，又名维生素原B5 泛醇进入人体内能转化为泛酸，进而合成辅酶A，促进 人体蛋白质、脂肪、糖类的代谢，保护皮肤表面的勃膜和毛发光泽，防止疾病的发生，缺乏D-泛醇就会导致皮肤病变及生理障碍。D-泛酸极不稳定，其商品形式的固体D-泛酸钙在应用 范围受到很大的限制，而D-泛醇是以液体的形式存在的等效物，能弥补D-泛酸钙应用领域 的不足。
[0039] D-泛硫乙胺又名潘特生，泛硫乙胺是双分子泛酰硫基乙胺的一种化合物，是辅酶A 的组成成分。
[0040] D-泛解酸内酯(D-PL)，是合成D-泛酸系列产品重要的手型中间体。DL-泛解酸内酯 的拆分方法大都是采用化学方法拆分，用手型拆分剂(手型胺、奎宁化合物、二甲马钱子碱 等）拆分DL-PL，其缺点是拆分剂昂贵，成本高、分离困难。
[0041 ]国内采用物理方法诱导结晶法拆分泛酸钙。
[0042]生物法制备D-PL主要包括直接发酵法和微生物酶法拆分两种方法。
[0043] 直接用微生物发酵法的主要问题是产量低。
[0044] 微生物酶法拆分，即将合成的中间体DL-泛解酸内酯或其类似物，用特异性酶拆 分，得到D-PL，再进一步合成泛酸系列产品。该方法经济实用，环境友好。
[0045] 微生物酶法拆分有以下几个路线：不对称还原酮基泛解酸内酯路线、不对称氧化 和还原两步酶法转化消旋泛解酸内酯、选择性水解DL-PL。
[0046] 本发明微生物酶法拆分的机理是用立体专一性D-内酯水解酶水解D-泛解酸内酯， 得到D-泛解酸，再经过内酯化反应生成D-泛解酸内酯。未水解部分经过消旋化可反复使用。
[0047] 产D-泛解酸内酯水解酶的微生物种属广泛，主要有以下几种:镰孢霉菌属、赤霉菌 属、粘帚霉菌属、黑曲霉属、青霉属、根霉属、以及短梗霉属等属丝状真菌。
[0048]本发明中选用的尖孢镰孢菌作为微生物菌株，本发明的微生物菌株已经在中国普 通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为CGMCC 3.1784diT#SSFUSariUm oxysporum〇
[0049] 尖孢镰孢菌 尖孢镰孢菌，亦称尖孢镰刀菌，尖孢镰刀菌是一类既可侵染植物又可在土壤内生存的 兼性寄生真菌。和其它植物病原菌一样，存在着种下分化，可侵染许多植物寄主，具有多种 专化型。在PDA平板上培养，菌落突起絮状，菌丝白色质密。菌落粉白色，浅粉色至肉色，略带 有紫色，由于大量孢子生成而呈粉质。菌落高3~5mm，小型分生孢子着生于单生瓶梗上，常 在瓶梗顶端聚成球团，单胞，卵形;大型分生孢子镰刀形，少许弯曲，多数为3隔。厚垣孢子尖 生或顶生，球形。
[0050] 本发明提供了 一种发酵制备D-泛解酸内酯的方法，所述步骤包含： (1) 在培养基中培养尖孢镰孢菌； (2) 将培养后的尖孢镰孢菌与底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶内酯化步骤⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培养基为:甘油1-10%、蛋白胨〇. 2-2%、酵母膏0.2-2%、玉米浆0.5-5%、螺旋藻多糖 0 · 05-0 · 2%、甘氨酸0 · 1-1%、其余为水。
[0051] 培养条件为pH 4-7,在26-2%~、100-300 rpm下培养0.5-3天。
[0052] 菌体的固定化 菌体的固定化是指固定化菌体产生的酶。所谓的固定化酶是指采用有机或无机固定材 料作为载体，将酶包埋起来或束缚、限制于载体的表面和微孔中，使其仍具有催化活性，并 可回收及重复利用的酶化学方法与技术。与游离酶相比固定化酶具有以下的优点：（1)采用 过滤或离心的方法极易与反应液分开，使酶可长期地反复地分批操作或装柱连续反应；（2) 酶的稳定性有改进；（3)酶反应过程能严格控制；（4)由于酶不混入产物溶液中，产物纯化可 以精简；（5)酶的使用效率提高，成本降低。
[0053]常用的酶的固定化方法： 吸附法 (1)物理吸附法 这种方法是将酶蛋白通过范德华力等弱相互作用，吸附到不溶于水的载体表面上而使 酶固定化。此法与前述的离子结合法比较，酶蛋白的活性中心不易受破坏，酶的高级结构变 化也不明显，从载体对酶的适应性来看，这个方法是好的，但其缺点是酶与载体的相互作用 较弱，因而被吸附的酶极易从载体表面上脱落下来。炭，多孔玻璃，酸性白土，漂白土，高岭 土，矾土，硅胶，膨润土，氟磷灰石等无机载体外，也可利用淀粉，谷蛋白这类生物大分子。
[0054] (2)离子吸附法 此法是通过离子效应，将酶固定到具有离子交换基团的非水溶性载体上。能用于离子 结合法的载体，除具有离子交换基团的多糖类以外，聚电解质，如离子交换树脂等合成高分 子衍生物也可用作载体。离子结合法与前述的共价结合法比较，操作更加简便，处理条件比 较温和，而且酶的高级结构和活性中心的氨基酸很少发生变性，因而可以得到较高活性的 固定化酶。但这种方法与共价结合等化学方法比较，载体和酶的结合是依靠库仑相互作用， 因而不够牢固，易受所使用的缓冲溶液限制和反应溶液pH值影响。在溶液离子强度较高的 情况下，由于去屏蔽效应，会使酶从载体上脱落下来。
[0055] 包埋法 (1)凝胶包埋法 将酶包埋在交联的不溶性凝胶的空隙中的方法。操作时，首先将酶和单聚物混合，然后 加入引发剂使单聚物发生聚合，从而制成凝胶固定化酶。交联聚丙烯酰胺凝胶包埋法是首 先被采用的包埋技术。用此法固定的酶有:胰蛋酶、木瓜蛋白酶、P-淀粉酶、后来又有研究者 用此法固定了过氧化氢酶、胰凝乳蛋白酶、β-葡萄糖苷酶。
[0056] (2)微囊包埋法 共价结合法 共价结合法是指酶分子的功能团和载体表面上的反应基团之间以共价键的方式相互 连接，形成固定化酶。常用载体包括天然高分子(纤维素、琼脂糖、淀粉、葡萄糖凝胶、胶原及 衍生物等）、合成高聚物(尼龙、多聚氨基酸、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等）。此法的优点是 酶与载体间连接牢固，即使使用高底物浓度或离子强度的溶液进行反应，也不会导致酶和 载体的分离。因此具有良好的稳定性及重复使用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定 化方法。
[0057]交联法 交联法是采用双功能团试剂或多功能团试剂进行酶分子之间的交联，使酶分子和双功 能试剂或多功能团试剂之叫形成共价键，得到交联网状结构。除了酶分子之间发生交联外， 还存在一定的分子内交联，根据使用条件和添加材料的不同，可制备不同物理性质的固定 化酶。常用交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺、Ν，Ν-亚甲基双丙烯酰胺等。此法的优点是酶之 间连接牢固，具有良好的稳定性及重复使用性，缺点是有时难以很好的控制反应条件，反应 剧烈时，常常引起酶蛋白的高级结构发生变化，并导致活性中心受到破坏，从而难于保证每 次都能制得高活力的样品。
[0058]本发明中，所用固定化的方法是包埋法。
[0059]步骤为:称取聚乙烯醇和海藻酸钠并与水混合，水浴加热并搅拌至完全溶化，然后 静置冷却至室温，得到聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液中加 入添加剂，再加入所述湿菌体，混合均匀，得到菌体混合溶液；用注射器将菌体混合液滴加 至|J交联剂溶液中，浸泡1-3小时，取出，用去离子水洗涤，即可。
[0060] 作为一种实施方式，所述聚乙烯醇的含量为1-10%，海藻酸钠的含量为1-10%。
[0061] 作为一种实施方式，所述添加剂为硅藻土、活性炭、贝壳粉、石灰粉一种或几种。
[0062]作为一种实施方式，所述交联剂溶液为含有氯化钙和/或硝酸钙和/或氯化铝的饱 和硼酸溶液。
[0063]作为一种实施方式，所述湿菌体加入量为2-20%。
[0064] 水解 将湿菌体或者固定化的菌丝体作为生物催化剂和DL-泛解酸内酯底物混合，水解生成 的D-泛解酸。
[0065] DL-泛解酸内酯底物为DL-泛解酸内酯溶液和pH 6.0-9.0的Tris-HCl缓冲液混合， 配制成5-50% DL-泛解酸内酯底物。
[0066] 称取上述清洗后的菌体或者固定化后的菌体，加入到已经混合均匀的5-50% DL-泛解酸内酯底物和10-50mmol CaCl2,于20-40°C振荡反应0.1-40小时，搅拌转速120_ 200r pm /m i η，滤去菌丝。在2 0 °C，用1 dm的试管测试反应液的旋光值。
[0067]其中，菌体的加入量为以每lg的DL-泛解酸内酯底物加入0.25-1.5g的菌体，例如： 2g的DL-泛解酸内酯底物加入0.5-3g的菌体。
[0068] 阴性对照组:将菌体加入到不加 DL-泛解酸内酯底物中，相同方法测定旋光值，用 以观察菌体自身是否产生具有旋光的物质。
[0069] 提取 本发明中，DL-泛解酸内酯经水解后，得到D-泛解酸。然后将D-泛解酸进行内酯化得到 D-泛解酸内酯，然后进行萃取、脱色、浓缩、结晶，得到纯D-泛解酸内酯。具体步骤为： 将经过水解后的酶解液，分别用乙酸乙酯萃取数次，分离出含D-泛解酸的水相;将含有 D-泛解酸的水相用盐酸进行内酯化反应，调pH至1.0-1.4,然后加入活性炭脱色，过滤;滤液 再用乙酸乙酯萃取提取有机相，有机相蒸馏回收溶剂，得到纯D-泛解酸内酯。
[0070] 生物量与酶活的测定方法 生物量测定：取发酵液10mL，过滤收集菌丝体，105 °C烘干2h，测定干重2次，计算平均 值，即为发酵液的生物量，以g · Γ1，计。
[0071] 酶活定义:一定条件下，每分钟水解1 ymolD-泛解酸内酯成D-泛解酸的酶量定义 为1个酶活力单位(IU)。
[0072]酶活测定：取10mL发酵液中滤出的菌丝体，加入含有20g · I/1的泛解酸内酯的 Tris-HCl (ρΗ7·5)缓冲液5mL，28°C摇床200 r · min-1反应1小时，过滤除去菌体，滤液用注 射用水稀释50倍，0.45μπι微孔滤膜过滤，取滤液进样。HPLC测定泛解酸生成量，并计算每升 发酵液或每克干菌体的酶活力单位。
[0073] 本发明的发酵制备D-泛解酸内酯的方法，采用的发酵培养中，所述培养基中加入 少量的螺旋藻多糖和甘氨酸;并且发现螺旋藻多糖和甘氨酸的加入可以明显提高的细菌的 产酶量和产酶速度，甚至可以提高酶在低pH值下的稳定性。
[0074] 下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用 于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员 根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0075] 另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售的。
[0076] 测试： 1.酶活测定：取10mL发酵液中滤出的菌丝体，加入含有20g · I/1的泛解酸内酯的 Tris-HCl (ρΗ7·5)缓冲液5mL，28°C摇床200 r ·π?η-1反应0.5小时，过滤除去菌体，滤液用 注射用水稀释50倍，0.45μπι微孔滤膜过滤，取滤液进样。HPLC测定泛解酸生成量，并计算每 升发酵液或每克干菌体的酶活力单位。
[0077] 2.产酶时间：分别在培养 1211、2411、3611、4811、6011、7211、8411、9611、10811、12011取样， 利用高效液相色谱来测定生物量和酶活，确认出产酶时间，以样品能够产酶速率达到7.1 g/L的时间为标准，进行检测。
[0078] 5天内未达到:指在培养的120h内产酶速率均未达到7.1 g/L。
[0079] 3.相对酶活：以未处理的酶液活性为100%为标准计算。
[0080] 4.酶转化率：以完全没有和尖孢镰孢菌接触的底物的转化率为0,以此为标准计 算。
[0081 ]其中高效液相色谱的检测条件： 色谱柱：〇丨&111〇118；[11]\1〇18柱（25〇1]1111\4.61]1111，5以111)，流动相：4:13=9:1(其中4为乙臆-KH 2P〇4溶液（0.02mol · L-用lmol · L-^CL调节溶液的pH值至3.00，B为纯乙腈），流速 lmL · mirT1，检测波长:215nm，柱温:25°C。在此条件下，泛解酸和泛解酸内酯的保留时间分 别为4. Omin和 7 · 5min。
[0082]实施例1: 一种发酵制备D-泛解酸内酯的方法，所述步骤包含： (1) 在培养基中培养尖孢镰孢菌； (2) 将培养后的尖孢镰孢菌与底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶内酯化步骤⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培养基为:甘油1%、蛋白胨〇. 2%、酵母膏0.2%、玉米浆0.5%、螺旋藻多糖0.05%、甘氨 酸0.1%、其余为水； 发酵培养的条件为:pH 7,在30°C、200 rpm下培养5天； 固定化的步骤为:称取聚乙烯醇和海藻酸钠并与水混合，水浴加热并搅拌至完全溶化， 然后静置冷却至室温，得到聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液 中加入添加剂，再加入所述湿菌体，混合均匀，得到菌体混合溶液；用注射器将菌体混合液 滴加到交联剂溶液中，浸泡2小时，取出，用去离子水洗涤，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量为2%，海藻酸钠的含量为2%; 所述添加剂为硅藻土、活性炭、贝壳粉、石灰粉； 所述交联剂溶液为含有氯化钙和硝酸钙和氯化铝的饱和硼酸溶液； 所述湿菌体加入量为2%; 所述水解条件为：用pH 7的Tris-HCl缓冲液配制的DL-泛解酸内酯溶液;然后加入微生 物菌株和lOmmol CaCl2; 所述内酯化和提取的步骤为:分别用乙酸乙酯萃取3次，分离出含D-泛解酸的水相;水 相用盐酸进行内酯化反应，脱色，过滤;滤液用乙酸乙酯萃取提取有机相，蒸馏回收，得到D-泛解酸内酯。
[0084]实施例2: -种发酵制备D-泛解酸内酯的方法，所述步骤包含： (1) 在培养基中培养尖孢镰孢菌； (2) 将培养后的尖孢镰孢菌与底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶内酯化步骤⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培养基为:甘油10%、蛋白胨2%、酵母膏2%、玉米浆5%、螺旋藻多糖0.2%、甘氨酸1%、 其余为水； 发酵培养的条件为:pH 7,在30°C、200 rpm下培养5天； 固定化的步骤为:称取聚乙烯醇和海藻酸钠并与水混合，水浴加热并搅拌至完全溶化， 然后静置冷却至室温，得到聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液 中加入添加剂，再加入所述湿菌体，混合均匀，得到菌体混合溶液；用注射器将菌体混合液 滴加到交联剂溶液中，浸泡2小时，取出，用去离子水洗涤，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量为2%，海藻酸钠的含量为1.75%; 所述添加剂为硅藻土、活性炭、贝壳粉、石灰粉； 所述交联剂溶液为含有氯化钙和硝酸钙和氯化铝的饱和硼酸溶液； 所述湿菌体加入量为20%; 所述水解条件为：用pH 7的Tris-HCl缓冲液配制50%的DL-泛解酸内酯溶液;然后加入 微生物菌株和50mmol CaCl2; 所述内酯化和提取的步骤为:分别用乙酸乙酯萃取3次，分离出含D-泛解酸的水相;水 相用盐酸进行内酯化反应，脱色，过滤;滤液用乙酸乙酯萃取提取有机相，蒸馏回收，得到D-泛解酸内酯。
[0086]实施例3: -种发酵制备D-泛解酸内酯的方法，所述步骤包含： (1) 在培养基中培养尖孢镰孢菌； (2) 将培养后的尖孢镰孢菌与底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶内酯化步骤⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述微生物菌株为尖孢镰孢菌； 所述培养基为:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米浆3%、螺旋藻多糖0.1%、甘氨酸0.5%、 其余为水； 发酵培养的条件为:pH 7,在30°C、200 rpm下培养5天； 固定化的步骤为:称取聚乙烯醇和海藻酸钠并与水混合，水浴加热并搅拌至完全溶化， 然后静置冷却至室温，得到聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液 中加入添加剂，再加入所述湿菌体，混合均匀，得到菌体混合溶液；用注射器将菌体混合液 滴加到交联剂溶液中，浸泡2小时，取出，用去离子水洗涤，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量为2%，海藻酸钠的含量为1.5%; 所述添加剂为硅藻土、活性炭、贝壳粉、石灰粉； 所述交联剂溶液为含有氯化钙和硝酸钙和氯化铝的饱和硼酸溶液； 所述湿菌体加入量为10%; 所述水解条件为：用pH 7.0的Tris-HCl缓冲液配制25%的DL-泛解酸内酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述内酯化和提取的步骤为:分别用乙酸乙酯萃取3次，分离出含D-泛解酸的水相;水 相用盐酸进行内酯化反应，脱色，过滤;滤液用乙酸乙酯萃取提取有机相，蒸馏回收，得到D-泛解酸内酯。
[0088]实施例4: 一种发酵制备D-泛解酸内酯的方法，所述步骤包含： (1) 在培养基中培养尖孢镰孢菌； (2) 将培养后的尖孢镰孢菌与底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶内酯化步骤⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述微生物菌株为尖孢镰孢菌； 所述培养基为：甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米浆3%、螺旋藻多糖0.05%、甘氨酸 0.05%、其余为水； 发酵培养的条件为:pH 7.0,在30°C、200 rpm下培养5天； 固定化的步骤为:称取聚乙烯醇和海藻酸钠并与水混合，水浴加热至完全溶化，然后静 置冷却至45°C，得到聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液中加入 添加剂，再加入所述湿菌体，混合均匀，得到菌体混合溶液；用注射器将菌体混合液滴加到 交联剂溶液中，浸泡2小时，取出，用去离子水洗涤，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量为1.5%，海藻酸钠的含量为2%; 所述添加剂为硅藻土、活性炭、贝壳粉、石灰粉； 所述交联剂溶液为含有氯化钙和硝酸钙和氯化铝的饱和硼酸溶液； 所述湿菌体加入量为10%; 所述水解条件为：用pH 7的Tris-HCl缓冲液配制25%的DL-泛解酸内酯溶液;然后加入 微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述内酯化和提取的步骤为:分别用乙酸乙酯萃取3次，分离出含D-泛解酸的水相;水 相用盐酸进行内酯化反应，脱色，过滤;滤液用乙酸乙酯萃取提取有机相，蒸馏回收，得到D-泛解酸内酯。
[0090]实施例5: -种发酵制备D-泛解酸内酯的方法，所述步骤包含： (1) 在培养基中培养尖孢镰孢菌； (2) 将培养后的尖孢镰孢菌与底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶内酯化步骤⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培养基为:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米浆3%、螺旋藻多糖0.3%、甘氨酸1.5%、 其余为水； 发酵培养的条件为:pH 7,在30°C、200 rpm下培养5天； 固定化的步骤为:称取聚乙烯醇和海藻酸钠并与水混合，水浴加热至完全溶化，然后静 置冷却至45°C，得到聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液中加入 添加剂，再加入所述湿菌体，混合均匀，得到菌体混合溶液；用注射器将菌体混合液滴加到 交联剂溶液中，浸泡2小时，取出，用去离子水洗涤，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量为1.5%，海藻酸钠的含量为3%; 所述添加剂为硅藻土、活性炭、贝壳粉、石灰粉； 所述交联剂溶液为含有氯化钙和硝酸钙和氯化铝的饱和硼酸溶液； 所述湿菌体加入量为10%; 所述水解条件为：用pH 7.0的Tris-HCl缓冲液配制25%的DL-泛解酸内酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述内酯化和提取的步骤为:分别用乙酸乙酯萃取3次，分离出含D-泛解酸的水相;水 相用盐酸进行内酯化反应，脱色，过滤;滤液用乙酸乙酯萃取提取有机相，蒸馏回收，得到D-泛解酸内酯。
[0092]实施例6: -种发酵制备D-泛解酸内酯的方法，所述步骤包含： (1) 在培养基中培养尖孢镰孢菌； (2) 将培养后的尖孢镰孢菌与底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶内酯化步骤⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培养基为:甘油50%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米浆3%、螺旋藻多糖0.1%、其余为水； 发酵培养的条件为:pH 7,在30°C、200 rpm下培养5天； 固定化的步骤为:称取聚乙烯醇和海藻酸钠并与水混合，水浴加热并搅拌至完全溶化， 然后静置冷却至室温，得到聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液 中加入添加剂，再加入所述湿菌体，混合均匀，得到菌体混合溶液；用注射器将菌体混合液 滴加到交联剂溶液中，浸泡2小时，取出，用去离子水洗涤，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量为0.5%，海藻酸钠的含量为3%; 所述添加剂为硅藻土、活性炭、贝壳粉、石灰粉一种或几种； 所述交联剂溶液为含有氯化钙和/或硝酸钙和/或氯化铝的饱和硼酸溶液； 所述湿菌体加入量为10%; 所述水解条件为：用pH 7的Tris-HCl缓冲液配制25%的DL-泛解酸内酯溶液;然后加入 微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述内酯化和提取的步骤为:分别用乙酸乙酯萃取3次，分离出含D-泛解酸的水相;水 相用盐酸进行内酯化反应，脱色，过滤;滤液用乙酸乙酯萃取提取有机相，蒸馏回收，得到D-泛解酸内酯。
[0094]实施例7: -种发酵制备D-泛解酸内酯的方法，所述步骤包含： (1) 在培养基中培养尖孢镰孢菌； (2) 将培养后的尖孢镰孢菌与底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶内酯化步骤⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培养基为:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米浆3%、甘氨酸0.5%、其余为水； 发酵培养的条件为:pH 7,在30°C、200 rpm下培养5天； 固定化的步骤为:称取聚乙烯醇和海藻酸钠并与水混合，水浴加热并搅拌至完全溶化， 然后静置冷却至室温，得到聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液 中加入添加剂，再加入所述湿菌体，混合均匀，得到菌体混合溶液；用注射器将菌体混合液 滴加到交联剂溶液中，浸泡2小时，取出，用去离子水洗涤，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量为3%，海藻酸钠的含量为3%; 所述添加剂为硅藻土、活性炭、贝壳粉、石灰粉一种或几种； 所述交联剂溶液为含有氯化钙和/或硝酸钙和/或氯化铝的饱和硼酸溶液； 所述湿菌体加入量为10%; 所述水解条件为：用pH 7.0的Tris-HCl缓冲液配制25%的DL-泛解酸内酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述内酯化和提取的步骤为:分别用乙酸乙酯萃取3次，分离出含D-泛解酸的水相;水 相用盐酸进行内酯化反应，脱色，过滤;滤液用乙酸乙酯萃取提取有机相，蒸馏回收，得到D-泛解酸内酯。
[0096]实施例8: -种发酵制备D-泛解酸内酯的方法，所述步骤包含： (1) 在培养基中培养尖孢镰孢菌； (2) 将培养后的尖孢镰孢菌与底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶内酯化步骤⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培养基为:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米浆3%、其余为水； 发酵培养的条件为:pH 7,在30°C、200 rpm下培养5天； 固定化的步骤为:称取聚乙烯醇和海藻酸钠并与水混合，水浴加热至完全溶化，然后静 置冷却至45°C，得到聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液中加入 添加剂，再加入所述湿菌体，混合均匀，得到菌体混合溶液；用注射器将菌体混合液滴加到 交联剂溶液中，浸泡2小时，取出，用去离子水洗涤，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量为0.5%，海藻酸钠的含量为2%; 所述添加剂为硅藻土、活性炭、贝壳粉、石灰粉； 所述交联剂溶液为含有氯化钙和硝酸钙和氯化铝的饱和硼酸溶液； 所述湿菌体加入量为10%; 所述水解条件为：用pH 7.0的Tris-HCl缓冲液配制25%的DL-泛解酸内酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述内酯化和提取的步骤为:分别用乙酸乙酯萃取3次，分离出含D-泛解酸的水相;水 相用盐酸进行内酯化反应，脱色，过滤;滤液用乙酸乙酯萃取提取有机相，蒸馏回收，得到D-泛解酸内酯。
[0098]实施例9: 一种发酵制备D-泛解酸内酯的方法，所述步骤包含： (1) 在培养基中培养尖孢镰孢菌； (2) 将培养后的尖孢镰孢菌与底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶内酯化步骤⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培养基为:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米浆3%、螺旋藻多糖0.1%、甘氨酸0.5%、 其余为水； 发酵培养的条件为:pH 4.0,在30°C、200 rpm下培养5天； 固定化的步骤为:称取聚乙烯醇和海藻酸钠并与水混合，水浴加热至完全溶化，然后静 置冷却至45°C，得到聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液中加入 添加剂，再加入所述湿菌体，混合均匀，得到菌体混合溶液；用注射器将菌体混合液滴加到 交联剂溶液中，浸泡2小时，取出，用去离子水洗涤，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量为1%，海藻酸钠的含量为1%; 所述添加剂为硅藻土、活性炭、贝壳粉、石灰粉； 所述交联剂溶液为含有氯化钙和硝酸钙和氯化铝的饱和硼酸溶液； 所述湿菌体加入量为10%; 所述水解条件为：用pH 4.0的Tris-HCl缓冲液配制25%的DL-泛解酸内酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述内酯化和提取的步骤为:分别用乙酸乙酯萃取3次，分离出含D-泛解酸的水相;水 相用盐酸进行内酯化反应，脱色，过滤;滤液用乙酸乙酯萃取提取有机相，蒸馏回收，得到D-泛解酸内酯。
[0100]实施例10. -种发酵制备D-泛解酸内酯的方法，所述步骤包含： (1) 在培养基中培养尖孢镰孢菌； (2) 将培养后的尖孢镰孢菌与底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶内酯化步骤⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培养基为:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米浆3%、螺旋藻多糖0.1%、甘氨酸0.5%、 其余为水； 发酵培养的条件为:pH 9,在30°C、200 rpm下培养5天； 固定化的步骤为:称取聚乙烯醇和海藻酸钠并与水混合，水浴加热至完全溶化，然后静 置冷却至45°C，得到聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液中加入 添加剂，再加入所述湿菌体，混合均匀，得到菌体混合溶液；用注射器将菌体混合液滴加到 交联剂溶液中，浸泡2小时，取出，用去离子水洗涤，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量为3%，海藻酸钠的含量为2%; 所述添加剂为硅藻土、活性炭、贝壳粉、石灰粉； 所述交联剂溶液为含有氯化钙和硝酸钙和氯化铝的饱和硼酸溶液； 所述湿菌体加入量为10%; 所述水解条件为：用pH 9.0的Tris-HCl缓冲液配制25%的DL-泛解酸内酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述内酯化和提取的步骤为:分别用乙酸乙酯萃取3次，分离出含D-泛解酸的水相;水 相用盐酸进行内酯化反应，脱色，过滤;滤液用乙酸乙酯萃取提取有机相，蒸馏回收，得到D-泛解酸内酯。
[0102]实施例11: 一种发酵制备D-泛解酸内酯的方法，所述步骤包含： (1) 在培养基中培养尖孢镰孢菌； (2) 将培养后的尖孢镰孢菌与底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶内酯化步骤⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培养基为:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米浆3%、其余为水； 发酵培养的条件为:pH 4,在30°C、200 rpm下培养5天； 固定化的步骤为:称取聚乙烯醇和海藻酸钠并与水混合，水浴加热至完全溶化，然后静 置冷却至45°C，得到聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液中加入 添加剂，再加入所述湿菌体，混合均匀，得到菌体混合溶液；用注射器将菌体混合液滴加到 交联剂溶液中，浸泡2小时，取出，用去离子水洗涤，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量为8%，海藻酸钠的含量为2%; 所述添加剂为硅藻土、活性炭、贝壳粉、石灰粉一种或几种； 所述交联剂溶液为含有氯化钙和/或硝酸钙和/或氯化铝的饱和硼酸溶液； 所述湿菌体加入量为10%; 所述水解条件为：用pH 6.0的Tris-HCl缓冲液配制25%的DL-泛解酸内酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述内酯化和提取的步骤为:分别用乙酸乙酯萃取3次，分离出含D-泛解酸的水相;水 相用盐酸进行内酯化反应，脱色，过滤;滤液用乙酸乙酯萃取提取有机相，蒸馏回收，得到D-泛解酸内酯。
[0104]实施例12:-种发酵制备D-泛解酸内酯的方法，所述步骤包含： (1) 在培养基中培养尖孢镰孢菌； (2) 将培养后的尖孢镰孢菌与底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶内酯化步骤⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培养基为:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米浆3%、其余为水； 发酵培养的条件为:pH 9,在30°C、200 rpm下培养5天； 固定化的步骤为:称取聚乙烯醇和海藻酸钠并与水混合，水浴加热并搅拌至完全溶化， 然后静置冷却至室温，得到聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液 中加入添加剂，再加入所述湿菌体，混合均匀，得到菌体混合溶液；用注射器将菌体混合液 滴加到交联剂溶液中，浸泡2小时，取出，用去离子水洗涤，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量为10%，海藻酸钠的含量为10%; 所述添加剂为硅藻土、活性炭、贝壳粉、石灰粉一种或几种； 所述交联剂溶液为含有氯化钙和/或硝酸钙和/或氯化铝的饱和硼酸溶液； 所述湿菌体加入量为10%; 所述水解条件为：用pH 9.0的Tris-HCl缓冲液配制5-50%的DL-泛解酸内酯溶液;然后 加入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述内酯化和提取的步骤为:分别用乙酸乙酯萃取3次，分离出含D-泛解酸的水相;水 相用盐酸进行内酯化反应，脱色，过滤;滤液用乙酸乙酯萃取提取有机相，蒸馏回收，得到D-泛解酸内酯。
[0106]实施例13:-种发酵制备D-泛解酸内酯的方法，所述步骤包含： (1) 在培养基中培养尖孢镰孢菌； (2) 将培养后的尖孢镰孢菌与底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶内酯化步骤⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培养基为:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米浆3%、螺旋藻多糖0.1%、其余为水； 发酵培养的条件为:pH 4,在30°C、200 rpm下培养5天； 固定化的步骤为:称取聚乙烯醇和海藻酸钠并与水混合，水浴加热并搅拌至完全溶化， 然后静置冷却至室温，得到聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液 中加入添加剂，再加入所述湿菌体，混合均匀，得到菌体混合溶液；用注射器将菌体混合液 滴加到交联剂溶液中，浸泡2小时，取出，用去离子水洗涤，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量为5%，海藻酸钠的含量为3%; 所述添加剂为硅藻土、活性炭、贝壳粉、石灰粉一种或几种； 所述交联剂溶液为含有氯化钙和/或硝酸钙和/或氯化铝的饱和硼酸溶液； 所述湿菌体加入量为10%; 所述水解条件为：用pH 6.0的Tris-HCl缓冲液配制25%的DL-泛解酸内酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述内酯化和提取的步骤为:分别用乙酸乙酯萃取3次，分离出含D-泛解酸的水相;水 相用盐酸进行内酯化反应，脱色，过滤;滤液用乙酸乙酯萃取提取有机相，蒸馏回收，得到D-泛解酸内酯。
[0108]实施例14: 一种发酵制备D-泛解酸内酯的方法，所述步骤包含： (1) 在培养基中培养尖孢镰孢菌； (2) 将培养后的尖孢镰孢菌与底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶内酯化步骤⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培养基为:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米浆3%、螺旋藻多糖0.1%、其余为水； 发酵培养的条件为:pH 9,在30°C、200 rpm下培养5天； 固定化的步骤为:称取聚乙烯醇和海藻酸钠并与水混合，水浴加热并搅拌至完全溶化， 然后静置冷却至室温，得到聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液 中加入添加剂，再加入所述湿菌体，混合均匀，得到菌体混合溶液；用注射器将菌体混合液 滴加到交联剂溶液中，浸泡2小时，取出，用去离子水洗涤，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量为5%，海藻酸钠的含量为5%; 所述添加剂为硅藻土、活性炭、贝壳粉、石灰粉一种或几种； 所述交联剂溶液为含有氯化钙和/或硝酸钙和/或氯化铝的饱和硼酸溶液； 所述湿菌体加入量为10%; 所述水解条件为：用pH 9.0的Tris-HCl缓冲液配制25%的DL-泛解酸内酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述内酯化和提取的步骤为:分别用乙酸乙酯萃取3次，分离出含D-泛解酸的水相;水 相用盐酸进行内酯化反应，脱色，过滤;滤液用乙酸乙酯萃取提取有机相，蒸馏回收，得到D-泛解酸内酯。
[0110]实施例15: -种发酵制备D-泛解酸内酯的方法，所述步骤包含： (1) 在培养基中培养尖孢镰孢菌； (2) 将培养后的尖孢镰孢菌与底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶内酯化步骤⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培养基为:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米浆3%、甘氨酸0.5%、其余为水； 发酵培养的条件为:pH 4,在30°C、200 rpm下培养5天； 固定化的步骤为:称取聚乙烯醇和海藻酸钠并与水混合，水浴加热并搅拌至完全溶化， 然后静置冷却至室温，得到聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液 中加入添加剂，再加入所述湿菌体，混合均匀，得到菌体混合溶液；用注射器将菌体混合液 滴加到交联剂溶液中，浸泡2小时，取出，用去离子水洗涤，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量为2%，海藻酸钠的含量为3%; 所述添加剂为硅藻土、活性炭、贝壳粉、石灰粉； 所述交联剂溶液为含有氯化钙和硝酸钙和氯化铝的饱和硼酸溶液； 所述湿菌体加入量为10%; 所述水解条件为：用pH 6.0的Tris-HCl缓冲液配制25%的DL-泛解酸内酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述内酯化和提取的步骤为:分别用乙酸乙酯萃取3次，分离出含D-泛解酸的水相;水 相用盐酸进行内酯化反应，脱色，过滤;滤液用乙酸乙酯萃取提取有机相，蒸馏回收，得到D-泛解酸内酯。
[0112]实施例16: -种发酵制备D-泛解酸内酯的方法，所述步骤包含： (1) 在培养基中培养尖孢镰孢菌； (2) 将培养后的尖孢镰孢菌与底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶内酯化步骤⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培养基为:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米浆3%、甘氨酸0.5%、其余为水； 发酵培养的条件为:pH 9,在30°C、200 rpm下培养5天； 固定化的步骤为:称取聚乙烯醇和海藻酸钠并与水混合，水浴加热并搅拌至完全溶化， 然后静置冷却至室温，得到聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液 中加入添加剂，再加入所述湿菌体，混合均匀，得到菌体混合溶液；用注射器将菌体混合液 滴加到交联剂溶液中，浸泡2小时，取出，用去离子水洗涤，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量为3%，海藻酸钠的含量为5%; 所述添加剂为硅藻土、活性炭、贝壳粉、石灰粉； 所述交联剂溶液为含有氯化钙和硝酸钙和氯化铝的饱和硼酸溶液； 所述湿菌体加入量为10%; 所述水解条件为：用pH 9.0的Tris-HCl缓冲液配制25%的DL-泛解酸内酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述内酯化和提取的步骤为:分别用乙酸乙酯萃取3次，分离出含D-泛解酸的水相;水 相用盐酸进行内酯化反应，脱色，过滤;滤液用乙酸乙酯萃取提取有机相，蒸馏回收，得到D-泛解酸内酯。
[0114] 以上数据可以看出，与不使用特定量螺旋藻多糖和甘氨酸的培养基培养的尖孢镰 孢菌的产酶速率和酶活性相比，本发明培养得到的尖孢镰孢菌的产酶可以在低pH下稳定， 且产酶速率快，因此提供了本发明的有益技术效果。
[0115] 前述的实例仅是说明性的，用于解释本公开的特征的一些特征。所附的权利要求 旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例 的组合的选择的实施方式的说明。因此，
【申请人】的用意是所附的权利要求不被说明本发明 的特征的示例的选择限制。而且在科技上的进步将形成由于语言表达的不准确的原因而未 被目前考虑的可能的等同物或子替换，且这些变化也应在可能的情况下被解释为被所附的 权利要求覆盖。
【主权项】
1. 一种发酵制备D-泛解酸内酯的方法，其特征在于，所述步骤包含： (1) 在培养基中培养尖孢镰孢菌； (2) 将培养后的尖孢镰孢菌与底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶内酯化步骤⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培养基为：甘油1-10%、蛋白胨〇. 2-2%、酵母膏0.2-2%、玉米浆0.5-5%、螺旋藻多糖 0 · 05-0 · 2%、甘氨酸0 · 1-1%、其余为水。2. 根据权利要求1所述的发酵制备D-泛解酸内酯的方法，其特征在于，所述培养基为： 甘油1.5%、蛋白胨0.8%、酵母膏1.1%、玉米浆2.5%、螺旋藻多糖0.1%、甘氨酸0.8%、溶剂为水。3. 根据权利要求1所述的发酵制备D-泛解酸内酯的方法，其特征在于，所述培养条件为 pH 4-9,在20-40 °C、100-300 rpm下培养0.5-7天。4. 根据权利要求1所述的发酵制备D-泛解酸内酯的方法，其特征在于，所述培养条件为 pH 4-7,在26-29°C、100-300 rpm下培养0.5-3天。5. 根据权利要求1所述的发酵制备D-泛解酸内酯的方法，其特征在于，所述步骤(2)固 定化的步骤为:称取聚乙烯醇和海藻酸钠并与水混合，水浴加热并搅拌至完全溶化，然后静 置冷却至室温，得到聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液中加入 添加剂，再加入所述湿菌体，混合均匀，得到菌体混合溶液；用注射器将菌体混合液滴加到 交联剂溶液中，浸泡1-3小时，取出，用去离子水洗涤，即可。6. 根据权利要求5所述的发酵制备D-泛解酸内酯的方法，其特征在于，所述聚乙烯醇的 含量为1_1〇%，海藻酸钠的含量为1 _1〇%。7. 根据权利要求5所述的发酵制备D-泛解酸内酯的方法，其特征在于，所述添加剂为硅 藻土、活性炭、贝壳粉、石灰粉一种或几种。8. 根据权利要求5所述的发酵制备D-泛解酸内酯的方法，其特征在于，所述交联剂溶液 为含有氯化钙和/或硝酸钙和/或氯化铝的饱和硼酸溶液;所述湿菌体加入量为2-20%。9. 根据权利要求1所述的发酵制备D-泛解酸内酯的方法，其特征在于，步骤(2)的水解 条件为：用pH 6.0-9.0的Tris-HCl缓冲液配制5-50%的DL-泛解酸内酯溶液;然后加入微生 物菌株和 10_50mmol CaCl2。10. 根据权利要求1所述的发酵制备D-泛解酸内酯的方法，其特征在于，所述步骤还包 括，内酯化D-泛解酸后经提取得到D-泛解酸内酯，其中内酯化和提取条件为:分别用乙酸乙 酯萃取3次，分离出含D-泛解酸的水相;水相用盐酸进行内酯化反应，脱色，过滤;滤液用乙 酸乙酯萃取提取有机相，蒸馏回收，得到D-泛解酸内酯。
【文档编号】C12P17/04GK105950679SQ201610361405
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】周中平, 张秋华, 张海峰
【申请人】兄弟科技股份有限公司