专利名称：一株降解金霉素的木霉菌lj245的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株能降解金霉素的木霉菌LJ245,属于微生物技术领域。
背景技术：
金霉素为广谱型抗生素，主产我国。在金霉素发酵生产过程中会产生大量金霉素菌渣和废水。菌渣中因含有金霉素残留等原因，被国家列入《国家危险废物名录》，只能采用焚烧和填埋方法处置。焚烧需耗费大量能源，而且燃烧气体有可能造成二次污染。填埋则需要占用大量土地，且存在着抗生素物质发生渗露的潜在风险，对环境及人类健康构成潜在危害。废水中残留的金霉素，若排入周边水体和土壤，会对水体和土壤中的多种微生物产生抑制作用，破坏水体生态环境，影响土壤的养分循环，甚至有可能诱导出耐药性菌及耐药基因。因此，金霉素废弃物中抗生素残留的去除问题已成为我国环境热点问题之一，也是金霉素生产企业亟待解决的棘手问题。利用生物降解金霉素残留是一种高效、快速、经济、安全和具有良好应用前景的一种污染处理方法。目前，国内外对金霉素高效降解菌株的筛选与利用高效菌株降解金霉素残留的研究刚刚起步，报导极少。2005年，何瑜利用筛选得到一株红曲霉B3菌株对金霉素生产废水进行了降解率研究，在以金霉素为唯一碳源条件下，其降解率为10%左右；在添加其它碳源和最适条件下培养，其对金霉素的降解率可达到51. 5%。本专利涉及的菌株 LJ245为哈茨木霉(Hypocrea lixii),而有关哈茨木霉Hypocrea Iixii具有降解金霉素功能的研究，国内外尚未见到报导。
发明内容
本发明的目的在于提供一株金霉素降解菌株LJ245。本发明所提供的金霉素降解菌株LJ245,为哈茨木霉(Hypocrea lixii)。该菌株于 2012年2月14日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)， 保藏号CGMCC No. 5753。该菌株rDNA-ITS全序列如下CCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAAC60
TGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCC120
GGAGGACCAACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTATAATCTGAGCCT180
TCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTT240
GGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTC300
AGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCT360
GTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCT420
GCCTCTTGGCGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCG480
CAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACT540
TCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA598 上述rDNA-ITS序列全长598个核苷酸。
本发明中的菌株LJ245的菌落形态为菌株LJ245在马丁氏平板培养基上生长快，菌丝层较厚，呈白色柔毛状，平坦，初期为白色，后期因产生分生孢子而呈黄绿色，产孢区常排列成同心轮纹状。菌丝透明，有隔， 分生孢子梗由菌丝直立生出，无色，分生孢子球形。本发明中的菌株LJ245可以在以金霉素为唯一碳源的培养基中生长，尤其是在金霉素浓度为O. Olg/L-5. 00g/L的低、中浓度条件下生长较好，可最大限度降低金霉素残留量；菌株LJ245在以金霉素唯一碳源且金霉素含量为4. Og/L的液体培养基中培养,该菌株对金霉素的降解率可达35. 19%。本发明中的菌株LJ245对金霉素生产废水中的金霉素有很好的去除效果，接种菌株LJ245于金霉素生产废水中培养4天，废水中金霉素去除率比对照提高了 36. 38%。本发明中的菌株LJ245接种到pH约为2. O的新鲜菌渣中，能快速生长，耐酸性能高，在室温条件下，对菌渣中金霉素的降解率可达到50. 09%。本发明的有益效果菌株LJ245具有降解菌渣与废水中残留金霉素的作用，可应用于金霉素生产企业废弃物的处理，也可望应用于金霉素污染环境的生物修复。特别是菌株LJ245在金霉素为唯一碳源且金霉素浓度为O. 01g/L的低浓度条件下能够很好生长，对最大限度地降低金霉素残留具有重要作用。菌株LJ245使用方便，还可作为金霉素降解菌剂的制备原料。
图I为金霉素降解菌株LJ245的基因组DNA凝胶电泳图(从左向右第一泳道为 Marker，第二泳道、第三泳道为LJ245的基因组DNA)；图2为金霉素降解菌株LJ245的rDNA-ITS片段PCR产物凝胶电泳图(从左向右第一泳道为Marker，第二泳道为LJ245的ITS序列的PCR产物)；图3为金霉素降解菌株LJ245的菌落形态图；图4为金霉素降解菌株LJ245的显微形态图。
具体实施例方式实施例I—、一株金霉素降解菌株LJ245的筛选方法I、材料准备菌样品来源采自金霉素生产企业含活性污泥的废水。培养基无机盐固体培养基(NH4)2S04 2. 0g, K2HPO4 O. 5g，KH2PO4 O. 5g，MgSO4 · 7H200. 5g， NaCl 0. 2g, CaCl2 0. IgjFeSO4 0. 01g,EDTA 0. 015g，琼脂 13g，葡萄糖 2g/L，溶于 1000ml 蒸懼水中。115 °C湿热灭菌20min后,添加2. Og/L金霉素。马丁氏培养基蛋白胨6g，葡萄糖 10g，KH2PO4 I. 0g, MgSO4 · 7H20 0. 5g，溶于 1000ml蒸懼水中。115°C湿热灭菌20min。活性测定培养基(NH4)2S042. 0g, K2HPO4O. 5g, KH2PO4O. 5g, MgSO4 · 7H20 0. 5g, NaCl
0.2g, CaCl2O. lg, FeSO4O. Olg, EDTA 0. 015g，溶于 1000ml 蒸馏水中。115°C湿热灭菌 20min后，添加4g/L金霉素。2、实验仪器与设备岛津LC-20A高效液相色谱仪，UNICO UV-2600A紫外可见光分光光度计，Mettler Toledo ML204 分析天平、Mettler Toledo pH 计、YT-CJ-IND 超净工作台、HZQ-F160 全温振荡培养箱、TG16-W高速离心机、YX-280D手提式压力蒸汽灭菌器、Nicon Eclipse 80i荧光显微镜、DNA Engine PCR仪、DcodeTM变性梯度凝胶电泳仪、DHP-9082电热恒温培养箱、 BOSCH冰箱、Champ Gel-3200凝胶成像系统等。3、菌株筛选操作步骤如下I)菌株分离与纯化 采用平板划线法进行分离与纯化。吸取400 μ L含活性污泥废水样，涂布于无机盐固体培养基平板上，置于28-30°C条件下遮光培养2-7天，得到不同菌落。然后，挑起单菌落，在无机盐固体培养基上划线进一步分离与纯化。此步骤重复1-2次，直至得到单一菌落。2)初筛将步骤I)得到单一菌落依次在以金霉素为唯一碳源的无机盐培养基平板上划线，28-30°C，培养2-6天。保存能够生长的菌株。3)复筛将步骤2)得到菌株接入马丁氏培养基中进行活化培养，然后将活化的菌液按2% 的接种量转接到的活性测定培养基中，28-300C，170r/min震荡暗培养，第3天和6天用高效液相色谱法测定各菌株对金霉素的降解率，获得了降解率较高菌株LJ245。二、金霉素降解菌株LJ245的分子生物学鉴定鉴定步骤如下I、基因组DNA的提取菌丝体DNA的提取采用CTAB法，具体方法如下I)菌种活化配制马铃薯汁培养基，分装高压灭菌，吸取500 μ L甘油管中保藏菌种至三角瓶中，28°C，170r/min培养24h。再将活化菌种转移至新培养基中28°C，170r/min 培养48h。2)将步骤I)培养的菌球放入研钵中用液氮充分研磨，将研磨后的粉末转入新的
I.5ml EP 管中，加 600 μ I 65°C 的 CTAB 于水浴锅中 65°C保温 15_30min。3)向EP管中加等体积(600 μ I)氯仿/异戊醇混合液(24 I)，使之充分混匀， 4°C, 10000r/min离心5min,取上清液至新EP管中。4)向上清中加入1/10体积的3M NaAc和2. 5倍体积的无水乙醇，-20 V沉淀 IOmin0 4°C，10000r/min 离心 5min,弃上清。5) 70%冰乙醇(或无水乙醇)500 μ I洗涤DNA2-3次(洗涤时轻转EP管)，倒置晾干，加入100 μ I I X TE溶解。6)用I %琼脂糖凝胶电泳检测。7)凝胶成像系统观测，照相。图I为菌株LJ245基因组DNA的凝胶电泳图(从左向右第一泳道为Marker，第二泳道、第三泳道为LJ245的基因组DNA)。-20°C或_70°C保存提取的DNA。2、ITS区序列扩增「采用通用引物ITSl和ITS4，对菌株LJ245的rDNA基因的ITS片段进行PCR 扩增。PCR扩增序列采用50 μ L反应体系Mix 25yL，引物ITSl(10mmol/L)lyL，引物 ITS4 (IOmmoI/L) I μ L,模板(约 25mmol/L) 2 μ L, ddH20 21 μ L。PCR 反应条件为94 °C 预热 5min，94 °C 30S, 55 °C 45S, 72 °C Imin，循环 30 次， 72°C IOmin0扩增后的PCR产物通过I %琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶成像系统照相。图 2为金霉素降解菌株LJ245的rDNA-ITS片段PCR产物凝胶电泳图(从左向右第一泳道为 LJ245的ITS序列的PCR产物，第二泳道为Marker)；3、ITS区序列的测定将扩增的ITS序列送北京诺赛基因组研究中心测序，得到菌株LJ245的ITS全序列如下CCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAAC60
TGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCC120
GGAGGACCAACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTATAATCTGAGCCT180
TCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTT240
GGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTC300
AGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCT360
GTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCT420
GCCTCTTGGCGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCG480
CAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACT540
TCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA598三、菌落形态特征观察菌株LJ245在马丁氏平板培养基上生长快，30°C培养三天，菌丝可铺满整个平板， 菌丝层较厚，呈白色柔毛状，平坦，后期产孢子，孢子为黄绿色，产孢区排列成同心轮纹状， 菌落背面白色。显微镜观察菌丝透明，有隔，菌丝分枝多且不规则，整体像树枝，菌丝间相互交叉覆盖。分生孢子梗由菌丝直立生出，无色，孢子梗瓶形，基部细，中间膨大。分生孢子球形。金霉素降解菌株LJ245菌落形态和显微形态见图3和图4。四、菌株LJ245鉴定为一种新功能菌株将测序结果与NCBI中的GenBank进行Blast比对,得到菌株LJ245与Hypocrea lixii的ITS序列的同源性为100%。根据菌株LJ245ITS序列分析结果以及形态特征，将其鉴定为哈茨木霉(Hypocrea lixii)。该菌株已于2012年2月14日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，保藏号CGMCC No. 5753，保藏日期为2012年2月14 日。目前，国内外尚没有文献报导Hypocrea Iixii具有降解金霉素的功能。因此，LJ245为一种新功能菌株。实施例2菌株LJ245对金霉素为唯一碳源的利用与降解实验制备以金霉素为唯一碳源且金霉素浓度分别为O. 01g/L,0. 05g/L,0. 10g/L, O. 50g/L，5. OOg/L, 10. OOg/L, 15. OOg/L的无机盐固体培养基。挑取LJ245菌落少许，在无机盐固体培养基平板上划线，置于30°C条件下避光培养2-6天。经观察得知，在培养第2 天，在金霉素浓度为O. 01g/L, O. 05g/L, O. lg/L，O. 5g/L和5. Og/L的培养基平板上长出了菌丝，且生长良好。说明菌株LJ245可以对极低浓度O. O lg/L至中浓度5. Og/L金霉素起到较好的利用与降解效果。菌株LJ245能够利用低浓度乃至贫营养级浓度的金霉素，可以最大限度地降低金霉素残留量。将菌株LJ245接入以金霉素为唯一碳源且金霉素含量为4. Og/L的无机盐液体培养基中，进行摇瓶培养，定时取样测定培养液中金霉素含量。测定方法为，取ImL培养液,加入5mL的甲醇，8000r/min离心5min,取上清液用22 μ m的滤膜过滤,通过高效液相色谱仪测定和计算得知LJ245对金霉素的降解率可达35. 19%。实施例3 菌株LJ245对金霉素废水处理实验用马丁氏培养基对菌株LJ245进行活化培养，然后按照1%的接种量加入金霉素企业生产废水中，并以不接种微生物的原废水作为对照，分别置于28°C，170r/min的摇床中培养4天，测定废水中金霉素的残留量。经测定得知，接种菌株LJ245对金霉素去除率比对照提高了 36. 38%。实施例4
菌株LJ245对金霉素菌渣处理实验
I)菌渣处理
用马丁氏培养基活化菌株LJ245，按3%的接种量接种到菌渣中，室温条件下进行暗培养。
2)菌渣中金霉素提取与测定
准确称取上述处理后的菌渣少许，用提取液充分提取。提取液组成为丙酮盐酸
溶液(4mol/L):水=13 : I : 6。提取液经8000r/min离心5min后,取上清液,用22 μ m 的滤膜过滤后，用高效液相色谱仪测定滤液中金霉素含量，LJ245在第5天对金霉素的降解率为 50. 09%。
权利要求
1.一株降解金霉素的木霉菌LJ245，其特征在于通过基因组DNA提取、rDNA-ITS序列扩增与比对，菌株LJ245为哈茨木霉(Hypocrea lixii)，CGMCCNo. 5753。
2.根据权利要求I所述的一株降解金霉素的木霉菌LJ245，其特征在于菌株LJ245的菌落形态为菌丝层较厚，呈白色柔毛状，平坦，初期为白色，后期因产生分生孢子而呈黄绿色，产孢区常排列成同心轮纹状；菌丝透明，有隔，分生孢子梗由菌丝直立生出，无色，分生孢子球形。
3.根据权利要求I所述的一株降解金霉素的木霉菌LJ245的基因，其特征在于ITS序列全长598个核苷酸，菌株的ITS全序列如下CCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAAC60TGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCC120GGAGGACCAACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTATAATCTGAGCCT180TCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTT240GGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTC300AGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCT360GTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCT420GCCTCTTGGCGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCG480CAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACT540TCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA598上述rDNA-ITS序列全长598个核苷酸。
4.根据权利要求3所述的一株降解金霉素的木霉菌LJ245的基因，其特征在于采用 BLAST分析法，对菌株LJ245的rDNA-ITS基因序列与GenBank数据库比较分析发现，菌株 LJ245 与 Hypocrea Iixii 的同源性为 100%
5.根据权利要求I所述的一株降解金霉素的木霉菌LJ245的应用，其特征在于该菌株LJ245用于金霉素的降解中。
6.根据权利要求5所述的一株降解金霉素的木霉菌LJ245的应用，其特征在于将菌株接种于以金霉素为唯一碳源的液体培养基中，其对金霉素的降解率达到35. 19%。
7.根据权利要求5所述的一株降解金霉素的木霉菌LJ245的应用，其特征在于菌株 LJ245对金霉素生产废水中的金霉素有很好的去除效果，接种菌株LJ245于金霉素生产废水中培养4天，废水中金霉素去除率比对照提高了 36. 38%。
8.根据权利要求5所述的一株金霉素降解菌株LJ245的应用，其特征在于将菌株接种在pH为2. O的新鲜菌渣中，在室温条件下，其对菌渣中金霉素的降解率达到50. 09%。
全文摘要
本发明涉及一株能降解金霉素的木霉菌LJ245，属于微生物技术领域。经rDNA-ITS全序列测定，该菌株为哈茨木霉(Hypocrea lixii)，保藏编号为CGMCC No.5753。该菌株生长快，菌丝呈白色柔毛状，后期因产生分生孢子而呈黄绿色；显微观察菌丝有隔，分生孢子梗由菌丝直立生出，无色，分生孢子球形。菌株LJ245具有降解菌渣与废水中残留金霉素的作用，可应用于金霉素生产企业废弃物的处理，也可望应用于金霉素污染环境的生物修复，特别是在金霉素为唯一碳源，且金霉素浓度为0.01g/L的低浓度条件下仍然能够很好生长，对最大限度地降低金霉素残留具有重要作用。同时，该菌株使用方便，还可作为金霉素降解菌剂的制备原料。
文档编号C12N15/11GK102604841SQ20121004993
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月29日 优先权日2012年2月29日
发明者张晴雯, 张爱平, 李艳菊, 杨世琦, 杨正礼, 肖思颖 申请人:中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所, 北京理工大学