专利名称：一株绿色木霉菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株绿色木霉菌及其应用。
背景技术：
香蕉枯萎病又称香蕉巴拿马病、黄叶病，是破坏维管束导致植株死亡的毁灭性病害，其病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)。尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种(F0C4)在亚洲和非洲的部分国家以及澳大利亚发生为害，严重威胁世界第一大香蕉种植品种Cavendi sh的生存。Cavendi sh香蕉于20世纪60年代取代当时大蜜哈而成为世界香蕉第一品种，后者则由于香蕉枯萎病菌I号小种的为害而导致绝产。因而，F0C4的出现和蔓延，引起各香蕉种植国家的高度关注。F0C4几乎能侵染所有香蕉种类，如Cavendish、大蜜哈、矮香蕉、棱指蕉,危害最大。·目前对枯萎病的防治还没有一种有效的化学农药，而且长期使用化学农药对环境和人类健康造成严重威胁。与化学防治法相比，利用拮抗菌防治植物病害具有对环境友好、成本低、病原菌不易产生抗药性等优点，是未来病害防治的方向。近年来，人们越来越重视木霉作为生防菌应用于香蕉栽培的研究，2010年6月吴琳的硕士学位论文《拮抗香蕉枯萎病的木霉菌株的分离、筛选及应用》公开了对拮抗尖孢镰刀菌古巴专化型拮抗效果较好的木霉96株，其中木霉T-C2对尖孢镰刀菌古巴专化型的拮抗效果最好。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供一株绿色木霉菌。本发明所提供的绿色木霉菌是绿色木霉(Trichodermaviride) H06,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 6229。该菌种已于2012年06月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。本发明的绿色木霉(Trichodermaviride)H06CGMCC No. 6229在PDA培养基上菌落生长迅速，呈不定型棉絮状或致密丛束状，其表面的颜色多呈绿色。菌丝有隔分枝，厚垣孢子有或无。分生孢子梗是菌丝的短侧枝，侧枝上对称或互生分枝，形成二级和三级分枝，分枝角度为锐角或近于直角，在分枝末端形成瓶状小梗。分生孢子多为卵圆形，无色或绿色，簇生于小梗顶端。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种杀菌剂。本发明所提供的杀菌剂，它的活性成分是上述绿色木霉(Trichoderma viride)H06 CGMCC No. 6229。所述绿色木霉(Trichoderma viride)H06 CGMCC No. 6229具体可为分生抱子或/和菌丝体。所述杀菌剂具体可用于防治由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf.sp. cubense)引起的植物病害。所述植物病害具体可为香蕉枯萎病。
本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种制备上述杀菌剂的方法。本发明所提供的制备杀菌剂的方法，包括在固体培养基中培养绿色木霉(Trichoderma viride) H06CGMCC No. 6229的步骤；所述固体培养基由如下物质制成600质量份玉米粉、160质量份小麦麸皮、240质量份稻壳、I质量份MgS04、l质量份KCl和200质量份水。其中，培养分为如下三个阶段a阶段在温度为25°C、空气相对湿度为95% (体积百分含量)和不通气的条件下培养；时间为2d ；b阶段然后在温度为28°C、空气相对湿度为80% (体积百分含量)和通气比为O. 5的条件下培养；时间为2d; c阶段然后在温度为29°C、空气相对湿度为40% (体积百分含量)和通气比为I的条件下培养；时间为2d。所述通气比为每分钟内通过发酵培养基的空气体积与发酵培养基的体积比(V /
V· min)。实验证明，绿色木霉(Trichodermaviride) HO6CGMCC No. 6229对由尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种(F0C4)引起的香蕉枯萎病的防治效果可达88%,绿色木霉(Trichodermaviride) H06CGMCC No. 6229培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。分类命名绿色木霉(Trichodermaviride)菌株编号H06保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称CGMCC地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号保藏日期2012年06月15日保藏中心登记入册编号CGMCC No. 6229下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的木霉T-C2 (吴琳的硕士学位论文《拮抗香蕉枯萎病的木霉菌株的分离、筛选及应用》)，公众可从中国热带农业科学院环境与植物保护研究所获得。下述实施例中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Fusarium oxysporumf. sp. cubense race 4，F0C4) B2 菌株(F0C4-B2)(齐兴柱，杨腊英，黄俊生· F0C4 的 2 个过氧化氢酶基因的克隆与表达分析.及其引起的香蕉苗活性氧迸发研究中国农学通报2012，28(15) : 163-169，公众可从中国热带农业科学院环境与植物保护研究所获得。实施例I、绿色木霉(Trichoderma viride) H06CGMCC No. 6229 的分离及鉴定I、绿色木霉(Trichoderma viride) H06CGMCC No. 6229 的分离I)菌株的分离筛选步骤如下从中国海南省香蕉种植地选择枯萎病重发田中发病田块的香蕉植株，采集根部土样。把土壤样本风干，过筛后称取IOg放入装有90mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，充分振荡，静置5min后，按梯度浓度法稀至1X10_2、1X10_3、1X10_4。各梯度稀释液取IOOul涂布于孟加拉红分离培养基上。28°C恒温培养4-5d，根据菌落形态、菌丝丰富程度和产孢量等特征挑取有代表性的单菌落纯化，纯化后转入孟加拉红斜面培养基保存，作为待测菌株。2)菌株的对峙培养复筛菌株筛选用大板筛选，木霉生长速度比较快，很快占优势，所以这个步骤要病原菌的孢子浓度高达IO8CFU/皿而木霉的孢子浓度IO6CFU/皿即可。对峙培养将大板筛出的理想菌株与病原菌做对峙培养，即将木霉和尖孢镰刀菌点接在平板两边缘，相距5cm-6cm，倒置放入28°C恒温培养箱中培养，重复3次，以仅接种尖孢镰刀菌菌株为对照，定期观察木霉对其抑制作用，并记录菌落生长半径及相互作用情况，同时做木霉和尖孢镰刀菌的纯培养试验并记录菌落满皿时间。经过该对峙培养得到绿色木 霉(Trichoderma viride) H06 CGMCC No. 6229。2、绿色木霉(Trichoderma viride) H06 CGMCC No. 6229 的鉴定(I)形态学鉴定绿色木霉(Trichodermaviride)H06 CGMCC No. 6229 在 PDA 培养基上菌落生长迅速，呈不定型棉絮状或致密丛束状，其表面的颜色多呈绿色。菌丝有隔分枝，厚垣孢子有或无。分生孢子梗是菌丝的短侧枝，侧枝上对称或互生分枝，形成二级和三级分枝，分枝角度为锐角或近于直角，在分枝末端形成瓶状小梗。分生孢子多为卵圆形，无色或绿色，簇生于小梗顶端。(2)分子鉴定用于扩增绿色木霉(Trichodermaviride) H06CGMCC No. 6229ITS 序列的上下游引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，分别为ITS4 5，-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，和 ITS6 :5 ’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ’。以绿色木霉(Trichoderma viride) H06 CGMCC No. 6229 的基因组 DNA 为模板，利用引物 ITS4 及 ITS6进行PCR扩增。PCR反应产物采用DNA回收试剂盒(AXYGEN公司)回收纯化后，与T-载体(Takara PMD-19T)连接，转化感受态细胞，然后在含有Amp、IPTG、X_Gal的平板土进行蓝白斑筛选，并进行菌落PCR筛选出重组质粒。经验证为目的片段的阳性克隆送至宝生物工程(大连)有限公司进行测序。测序结果通过检索Genbank(http : / / www.nebi.nlm.nih.gov / Blast / ),采用BLAST进行序列一致性比较。对所测得的ITS序列与GenBank中已知序列比对，结果表明，与该菌株ITS序列最为接近的为绿色木霉(Trichoderma viride),其ITS序列同源性为99%。绿色木霉(Tri choderma viride)H06已于2012年06月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 6229。实施例2、绿色木霉(Trichoderma viride) H06 CGMCC No. 6229对尖抱键刀菌古巴专化型4号小种(F0C4)菌丝的拮抗作用供试菌株绿色木霉(Trichodermaviride) H06CGMCC No. 6229 和木霉 T-C2。采用平板对峙法，测试绿色木霉(Trichoderma viride)H06CGMCC No. 6229和木霉T-C2对F0C4-B2的拮抗作用。实验设三个处理，分别为木霉H06组、木霉T-C2组和对照组。木霉H06 组的处理方法如下将木霉(Trichoderma viride)H06CGMCC No. 6229 和F0C4-B2同时点接在PDA培养基两边缘，相距5cm_6cm，倒置放入28°C恒温培养箱中培养，重复3次，定期观察绿色木霉(Trichoderma viride) H06CGMCC No. 6229对其抑制作用，并记录菌落生长半径及相互作用情况。木霉T-C2 组的处理方法除将绿色木霉(Trichoderma viride)H06CGMCC No. 6229替换为木霉T-C2外，其它与木霉H06组的处理方法完全相同。对照组的处理方法除了只接种F0C4-B2不接种其它微生物外，其它与木霉H06组的处理方法完全相同。 测试项目及记载标准如下接种后7d测量上述三个处理中F0C4-B2的直线生长距离，以及木霉H06组和木霉T-C2组中木霉的直线生长距离按以下公式计算抑菌率抑菌率(%)= (dCK-dB) X100/dCK其中dCK:对照组接种7d后F0C4-B2的直线生长距离，单位是cm;dB:木霉H06组或木霉T-C2组接种7d后F0C4-B2的直线生长距离，单位是cm;dT:木霉H06组或木霉T_C2组接种7d后的木霉直线生长距离,单位是cm;结果如表I所不,结果表明绿色木霉(Trichoderma viride) H06 CGMCC No. 6229对F0C4-B2的抑菌率为83. 8%，木霉T-C2对F0C4-B2的抑菌率为70. 0%。表I.平板对峙法实验结果
编号dTdBdCK抑菌率(％)
对照组8
木霉 H06 组 θΓδO~8^8
木霉 T-C2 组 5Λ2Λ~700实施例3、绿色木霉(Trichoderma viride) H06CGMCC No. 6229 菌剂的制备木霉菌种绿色木霉(Trichodermaviride) H06CGMCC No. 6229 和木霉 T-C2I、一级平板菌种培养将分离纯化的木霉菌种接种于PDA培养基平板，放入28°C培养箱，培养3 5天，待菌丝长满平板并产孢时，转入摇瓶培养；每1000ml PDA培养基由如下物质制成马铃薯200g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，琼脂20g，用水将培养基定容至1000mL。其配制方法如下将切成小块的去皮土豆煮沸20分钟，然后用纱布过滤，在滤液中，按上述配方加入其他成分，用水定容至1000mL，121°C湿热灭菌半小时得到培养基。2、液体种子培养在1000ml三角瓶中，装入400ml的液体种子培养基，接入平板菌种，接种量为每IOOOrnl三角瓶接种1/6培养好的一级平板菌种(培养皿规格90mm)，接种后置于恒温摇床(28°C, 140转/分)培养3 5天。每IOOOml液体种子培养基按照如下方法配制玉米粉4g，蛋白胨3g，硫酸铵2g，磷酸二氢钾4g，硫酸镁3g，二水氯化钙3g，吐温O. 2ml，酵母浸膏O. 5g,用水将培养基定容至IOOOmL, 121° C高压灭菌30分钟，待冷却至40°C后接种。3、液体发酵生产取50升机械搅拌发酵罐，装入35升液体培养基，按5%接种量(体积比)进行接种；培养条件为温度28°C，通入空气，通气量为IOL min，保压O. 03Mpa，转速为140rpm，培养65小时，然后放罐，此时发酵液中出现大量菌丝及液生孢子，发酵液较粘稠。每IOOOml液体培养基按照如下方法配制豆饼粉15g,玉米粉15g和IOOOml水，PH自然；121。C高压灭菌30分钟，待冷却至40°C后接种。
·
4、固体发酵生产固体培养料按照如下方法配制600质量份玉米粉、160质量份麸皮(小麦最外层的表皮)、240质量份稻壳、I质量份MgS04、l质量份KC1、200质量份水；pH自然，121°C蒸汽灭菌60分钟。在经甲醛和高锰酸钾薰蒸灭菌的无菌房子内接种。将步骤3得到的发酵产物与固体培养料混合均匀，接种量为30% (即步骤3得到的发酵产物与固体培养料体积比为30:70)。接种后，将混匀后的混合物装于浅盘中，各装入量疏松度和深度一致，然后按如下阶段培养a阶段在温度为25°C、空气相对湿度为95% (体积百分含量)和不通气的条件下培养；时间为2d ;期间用塑料薄膜覆盖以保持湿度；该阶段菌丝生长阶段，要求低温高湿；b阶段在温度为28 V、空气相对湿度为80% (体积百分含量)和通气比为O. 5的条件下培养；时间为2d ;期间改用灭过菌的报纸覆盖以保持湿度；该阶段开始形成孢子，要求高温中湿；c阶段在温度为29°C、空气相对湿度为40% (体积百分含量)和通气比为I的条件下培养；时间为2d ;期间不需要覆盖；该阶段菌要求高温低湿；所述通气比为每分钟内通过发酵培养基的空气体积与发酵培养基的体积比(V /
V· min)。上述培养过程中，a阶段不能翻料，b和c阶段要经常进行翻料。5、发酵产物的干燥干燥处理用抽湿机干燥处理，时间约2d，得到固体菌剂。其中，抽湿的标准为湿度计恒定在30%的室内湿度保持ld，固体菌剂含水量10%。结果表明绿色木霉(Trichoderma viride)H06 CGMCC No. 6229固体菌剂的抱子含量为5. 16X IO9Cfu/克菌剂，木霉T-C2固体菌剂的孢子含量为I. 15X IO9Cfu/克菌剂。实施例4、盆栽防治香蕉枯萎病试验供试菌剂实施例3制备的绿色木霉(Trichoderma viride) HO6 CGMCCNo. 6229固体菌剂(孢子含量为5. 16 X IO9Cfu/克菌剂)，木霉T-C2固体菌剂(孢子含量为
I.15 X IO9Cfu/ 克菌剂)。供试的香蕉苗为巴西蕉幼苗，由中国热带农业科学院组培中心提供。
盆栽设计实验设三个处理，分别为木霉H06组、木霉T-C2组和对照组。木霉H06组的处理方法如下将20盆(5片叶)巴西蕉幼苗(I株/盆)每盆的土壤中均施入IOOml绿色木霉(Trichoderma viride) HO6CGMCC No. 6229孢子悬液(用水悬浮实施例3制备的绿色木霉(Trichoderma viride) H06CGMCC No. 6229固体菌剂使绿色木霉(Trichoderma viride) H06CGMCC No. 6229 的含量为 107CFU/ml )，三天后，每盆的土壤中均施入100ml F0C4-B2孢子悬液(用水悬浮F0C4-B2孢子使F0C4-B2孢子的含量为IO6CFU/ml )，之后在温室大棚里常温培养，50天后，调查香蕉发病情况及病情指数。木霉T-C2组的处理方法如下将20盆(5片叶)巴西蕉幼苗(I株/盆)每盆的土壤中均施入IOOml木霉T-C2组孢子悬液(用水悬浮实施例3制备的木霉T-C2固体菌剂使木霉T-C2的含量为107CFU/ml)，三天后，每盆的土壤中均施入100ml F0C4-B2孢子悬液(用水悬浮F0C4-B2孢子使F0C4-B2孢子的含量为106CFU/ml )，之后在温室大棚里常温培养，50 天后，调查香蕉发病情况及病情指数。对照组的处理方法如下将20盆苗龄与上述木霉H06组施入F0C4-B2时相同的巴西蕉幼苗(I株/盆)每盆的土壤中均施入IOOml尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种B2菌株(F0C4-B2)孢子悬液(用水悬浮F0C4-B2孢子使F0C4-B2孢子的含量为106CFU/ml)，之后在温室大棚里常温培养，50天后，调查香蕉发病情况及病情指数。结果如表2所不,说明绿色木霉(Trichoderma viride)H06CGMCC No. 6229对香蕉枯萎病具有很好的防病效果。将香蕉枯萎病分为以下5个标准O级植株无枯黄症状。I级植株下部叶片出现轻微的枯黄症状，嫩叶完好，少部分根系轻微褐变，茎部出现水溃状褐变。2级植株下部叶片出现明显的枯黄症状，但嫩叶完好，根系出现褐变，茎部和假茎部出现水溃状褐变。3级整个植株出现枯黄症状，根系褐变腐烂，茎部和假茎部褐变连片，少数叶柄出现红褐。4级植株出现枯萎死亡症状，根系严重褐变腐烂。
病情指数: immmmmmwm χ蘭％
总数X域高级代表值
防病效果=(对麗_情指數-处HfWjjfiD X 100%
对照病情指数表2、木霉菌剂对香蕉枯萎病的防治效果
权利要求
1.绿色木霉(Trichodermaviride),其特征在于所述绿色木霉(Trichodermaviride)的菌株号为H06，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为 CGMCC No. 6229。
2.权利要求I所述的绿色木霉(Trichodermaviride)在生产分生孢子和/或菌丝体中的应用。
3.一种杀菌剂,它的活性成分是权利要求I所述的绿色木霉(Trichoderma viride)。
4.根据权利要求3所述的杀菌剂,其特征在于所述绿色木霉(Trichodermaviride)为分生孢子或/和菌丝体。
5.根据权利要求3或4所述的杀菌剂，其特征在于所述杀菌剂用于防治由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)引起的植物病害。
6.根据权利要求5所述的杀菌剂，其特征在于所述植物病害为香蕉枯萎病。
7.权利要求I所述的绿色木霉(Trichodermaviride)在制备植物杀菌剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述植物杀菌剂的靶标菌为尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于所述植物杀菌剂用于防治香蕉枯萎病。
10.制备权利要求3或4所述杀菌剂的方法，包括在固体培养基中培养权利要求I所述的绿色木霉的步骤；所述固体培养基由如下物质制成600质量份玉米粉、160质量份麸皮、240质量份稻壳、I质量份MgS04、I质量份KCl和200质量份水。
全文摘要
本发明公开了一株绿色木霉菌及其应用。本发明所提供的绿色木霉菌是所述绿色木霉(Trichoderma viride)H06，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.6229。本发明的绿色木霉(Trichoderma viride)H06CGMCC No.6229对由尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种(FOC4)引起的香蕉枯萎病的防治效果可达88%，绿色木霉(Trichoderma viride)H06CGMCC No.6229培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
文档编号C12N3/00GK102839131SQ201210323738
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月5日 优先权日2012年9月5日
发明者黄俊生, 梁昌聪, 杨腊英, 吴 琳, 王亚 申请人:中国热带农业科学院环境与植物保护研究所