一株具有乙酸乙酯降解能力的绿色木霉菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株具有乙酸乙酯降解能力 的绿色木霉菌（Trichoderma viride)LW_l，及其在降解乙酸乙醋、苯、甲苯、氯苯、α-薇稀 或二氯甲烷中的应用。
【背景技术】
[0002] 乙酸乙酯（分子式：CH3CO2CH2CH 3)是一种常见的有机溶剂，在印刷、胶粘剂等生产 企业和工业过程中广泛使用。乙酸乙酯挥发性强，对眼睛、皮肤、粘膜和上呼吸道有刺激性， 长时间接触对人有麻醉作用，可致头晕和头痛。因此寻找有效防治乙酸乙酯污染的对策刻 不容缓，对人类健康和环境保护具有重大意义。
[0003] 生物法处理乙酸乙酯污染以其简单高效、能耗低、费用低、无二次污染等特点越来 越受到重视。与以细菌为核心的生物工艺相比，丝状真菌由于所产生的菌丝体容易捕捉气 相中的疏水性污染物，同时又具备耐低PH值和适应干燥环境等特性，日益成为VOCs生物过 滤技术中新的研宄热点。大量研宄表明从环境中分离筛选高效降解乙酸乙酯等VOCs的真 菌，仍然是消除环境中该类污染物的重要方法之一。
[0004] 木霉菌属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目，粘孢菌类，是一类普遍存在的真菌。绿色 木霉在自然界分布广泛，常腐生于木材、种子及植物残体上。绿色木霉能产生多种具有生物 活性的酶系，如：纤维素酶、几丁质酶、木聚糖酶等，目前主要用于植物病理生物防治中。
[0005] 专利号为200810027399. 7,专利名称为"绿色木霉Hl在降解甲醛中的应用"的中 国专利中公开了一种绿色木霉Hl在降解甲醛中的应用同时提供了绿色木霉Hl在降解甲醛 的应用中的相关数据。但在该专利中报道了该绿色木霉只能降解甲醛或者在其他常见碳源 (葡萄糖、蔗糖等）存在的条件下降解甲醛，对于其他工业常见的污染物是否具有降解能力 并未提及。本发明提及的乙酸乙酯和甲醛属于两类物质，结构迥异，降解甲醛的绿色木霉无 法降解乙酸乙酯。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中的不足而提供一种高效、耐受能力 强的具有乙酸乙酯降解能力的绿色木霉菌及其应用。
[0007] 本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：该具有乙酸乙酯降解能力的绿色木 霉菌（Trichoderma viride)LW-l，其保藏编号为CCTCC N0:M2014176。保藏于中国典型培 养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072,保藏日期：2014年5月3日。
[0008] 本发明所述的具有乙酸乙醋降解能力的绿色木霉菌（Trichoderma viride)LW_l， 其菌落特征为子座为半球形、扁碟状或盾状，直径1. 5-7_，表面绿色，内部近白色。
[0009] 本发明所述的具有乙酸乙醋降解能力的绿色木霉菌（Trichoderma viride)LW_l 在降解乙酸乙酯、苯、甲苯、氯苯、α-蒎烯或二氯甲烷中的应用。该菌株LW-I能降解初始 浓度0?600mg/L的乙酸乙酯，最终降解产物为C0 2、H2O和细胞生物量，其去除率大约为 100%，即可以完全降解乙酸乙酯。该降解菌的发现对工业废气中乙酸乙酯的高效净化具有 重要意义。该菌株LW-I还可降解其他工业常见有机污染物，尤其是苯、甲苯、1-氯苯、二氯 甲烧等。
[0010] 本发明所述的对工业常见有机污染物的降解优选在30°C、pH = 4. 87条件下进行。 上述条件下降解的好处是绿色木霉活性较大，能在较短时间内完全利用乙酸乙酯等工业常 见的污染物。
[0011] 本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明中的绿色木霉（Trichoderma viride)LW-I取自废水处理单元，对于VOCs类有机污染物，尤其是乙酸乙酯具有较好地降 解效果，可以较为完全地把乙酸乙酯转化为C0 2、H20、细胞生物量等无害物质；同时，该菌株 也能不同程度地降解苯、甲苯、氯苯等工业常见的污染物，因而在工业废气废水的生物净化 中具有广阔的应用前景。
[0012] 本发明所述的绿色木霉能将乙酸乙酯完全降解为无机物（H20和C02)和细胞生物 质，实现完全矿化，且对于乙酸乙酯的耐受浓度高达600mg/L。因此，该绿色木霉对于工业常 见污染物（如乙酸乙酯等）具有高效的降解能力，且能承受较高浓度的污染物。
【附图说明】
[0013] 图1为绿色木霉（Trichoderma viride) LW-I的乳酸酷棉兰染色照片。
[0014] 图2为绿色木霉（Trichoderma viride) LW-I在PDA培养基上菌落形态照片。
[0015] 图3为绿色木霉（Trichoderma viride)LW-I的系统发育树图。
[0016] 图4为绿色木霉（Trichoderma viride)LW-I在不同初始浓度的乙酸乙醋条件下 的降解效果图。
[0017] 图5为绿色木霉（Trichoderma viride) LW-I在不同pH条件下对乙酸乙醋的降解 效果图。
[0018] 图6为绿色木霉（Trichoderma viride) LW-I在不同pH条件下的生物量变化。
[0019]
【具体实施方式】
[0020] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0021] 实施例1 :绿色木霉（Trichoderma viride)LW-I的分离、纯化及其鉴定。
[0022] L 绿色木霉（Trichoderma viride)LW-1 的分离及纯化。
[0023] 绿色木霉（Trichoderma viride)LW-I是从浙江杭州市某污水处理厂曝气池中的 活性污泥中驯化、分离得到的一株真菌。具体步骤如下：取浙江杭州市某污水处理厂曝气 池中的活性污泥。自来水淘洗五次后，空曝48h，尽量去除残留的有机物。配制无机盐培养 液，以乙酸乙酯为唯一碳源对活性污泥进行定向驯化，每3d更换新鲜无机盐培养液，40d左 右即可分离。
[0024] 配制乙酸乙醋初始浓度为50mg/L无机盐培养基，配制方法如下：KH2PO 4O. 45g， Na2HPO4O. 47g，（NH4)2S042. 0g，MgSO4 · 7H20 0· 5g，无水 CaCl2O. 01g，微量元素（MnSO4 · H2O 0· 001g，ZnSO4 · 7H20 0· 001g，FeSO4O. 001g，CuSO4 · 5Η200· OOlg)，蒸馏水，IOOOmL ;pH = 3 ? 6,分装于250mL的密封盐水瓶（50mL/个），110°C灭菌40min。
[0025] 从驯化瓶中取50ml上清液进行离心，将沉淀下来的污泥加入到装有50ml的无机 盐培养基（已灭菌）的盐水瓶中，并且添加链霉素〇. 〇〇3g，庆大霉素0. 001g。盖上瓶塞后 加入乙酸乙酯（浓度为50mg/L)。放置在30°C，160rpm的摇床中培养。隔一段时间观察盐 水瓶中菌体生长情况，之后在已降解完全的盐水瓶中取5mL菌悬液到装有新鲜的50mL的无 机盐培养基的瓶中，仍添加链霉素〇. 〇〇3g，庆大霉素0. 001g。盖上瓶塞后加入乙酸乙酯（浓 度为100mg/L)。将培养瓶置于30°C，160rpm的摇床中培养。培养一定时间后，再取5ml菌 悬液到装有新鲜的50ml的无机盐培养基的瓶中，添加链霉素0. 003g，庆大霉素0. 001g。盖 上瓶塞后加入乙酸乙酯（浓度为200mg/L)。置于摇床中培养。
[0026] 取2ml混合菌液，涂布于含有乙酸乙酯的固体无机盐培养基上，连续划线分离， 最终获得纯化菌株，接种到PDA斜面培养基中，在4°C的冰箱中保存。
[0027] 2.绿色木霉（Trichoderma viride) LW-1 的鉴定。
[0028] 通过真菌ITS序列分析，确定菌株为绿色木霉（Trichoderma viride)。具体步骤 如下：PCR扩增反应体系见表1，PCR扩增的反应条件为95°C预变性5min，95°C变性30s， 55°C退火 30s，72°C延伸 40s，循环 32 次；72°C延伸 10min，10°C保存。
[0029] 表I :ITS序列PCR扩增反应体系
【主权项】
1. 一株具有乙酸乙醋降解能力的绿色木霉菌（7>icAoofe/ma n>i￡/e)LW-l，其保藏编号 为 CCTCC NO: M2014176。
2. 根据权利要求1所述的具有乙酸乙醋降解能力的绿色木霉菌（ w>iife)LW-l，其特征在于：其菌落特征为子座为半球形、扁碟状或盾状，直径I. 5-7mm，表 面绿色，内部近白色。
3. 权利要求1所述的具有乙酸乙醋降解能力的绿色木霉菌（ririofe) LW-I在降解乙酸乙醋、苯、甲苯、氯苯、α-蒎烯或二氯甲烷中的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的降解在30°C、pH= 4. 87条件下进 行。
【专利摘要】本发明涉及一种具有乙酸乙酯降解能力的绿色木霉菌(<i>Trichoderma</i><i>？viride</i>)LW-1，其保藏编号为CCTCC？NO:？M2014176。以及该绿色木霉菌(<i>Trichoderma</i><i>？viride</i>)LW-1在降解乙酸乙酯、苯、甲苯、氯苯、α-蒎烯或二氯甲烷中的应用。本发明对目标污染物高效降解、耐受能力强。CCTCC NO：M201417620140503
【IPC分类】C02F101-34, C02F101-32, C02F101-36, B01D53-84, C02F3-34, C12N1-14, B01D53-72, C12R1-885
【公开号】CN104560728
【申请号】CN201410813740
【发明人】成卓韦, 陈建孟, 於建明, 陆李超
【申请人】浙江工业大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月24日