专利名称：一种烷烃降解菌的单加氧酶基因及其编码蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种用于生物工程领域的酶及其编码基因，具体地说是涉及食烷菌烷烃单加氧酶基因及其编码蛋白。
背景技术：
烷烃的氧化过程最初是通过研究恶臭假单孢菌GPo1来说明的。这株菌株是以己烷作为唯一碳源和能源进行富集培养从土壤中分离得到的。Baptist等首先描述了恶臭假单孢菌中无细胞辛烷氧化作用的产物。他们利用纸层析法发现，在无细胞抽提物中，14C-辛烷被转化成了14C-辛脂。Coon及其同事随后鉴定和定性出了导致辛烷转化成辛醇的酶类，发现该酶由三种组分构成①红素氧还蛋白还原酶，它把电子从NADH传递给红素氧还蛋白；②红素氧还蛋白，它是一种铁硫电子传递蛋白；③烷烃单加氧酶，它将氧分子中的一个氧原子加到烷烃上使其氧化，另一个氧原子则得到从NADH经由①和②两个酶传递来的电子而被还原。
烷烃单加氧酶含有六条跨膜的α-螺旋区段，只有三个很短的环伸入周质中，它们在肽链上的位置大约是52、112和251。烷烃单加氧酶是少数几个通过多个亲水片断嵌入质膜的单加氧酶之一。其底物是水中溶解度很低的烷烃，底物必须通过质膜才能接触到酶。而这些亲水片断便是膜上接触底物的催化位点。Shanklin J对烷烃单加氧酶进行了穆斯鲍尔谱的研究发现它的谱型与那些含有双铁簇的蛋白和酶十分相似，其中包括一些催化烃氧化的酶。由此推出烷烃单加氧酶也含有双铁原子簇，且位于酶的活性位点上的。所有烷烃单加氧酶的氨基酸序列中都含有八个组氨酸的结构[HX3-4HX7-41(3 non-His)HX2-3(1 non-His)HHX61-189(40 non-His)HX2-3(1 non-His)HH]，它就是活性位点上双铁原子簇的配基。
在化工生产中，有机分子选择性催化氧化是最重要的技术过程。化学原材料主要是烃类物质，特别是来自天然气和原油的烷烃。由于它们的性质很不活泼，使之成为了化学工业中的制约因素。在实际生产过程中，使烷烃发生反应是很困难的。传统的氧化剂如铬酸盐、高锰酸盐等氧化效率很低，而且没有选择性。因此，发展高效的、选择性强的生物催化剂一直是研究的热点。烷烃单加氧酶除了能催化烷烃转化为烷醇外，还能在多种氧化反应中发挥作用。因此，其作为生物催化剂有广阔的前景。
另一方面，在全球范围内每年有1.7～8.8×106吨的石油污染物排入海洋。对海洋环境和海岸生态系统造成长期及恶劣的影响。烷烃是原油和石油产品中的一个主要成分。自然界中存在着许多能够利用烷烃作为碳源和能源的微生物。利用微生物降解作用来主动清除溢油的生物修复技术是当今一种非常重要的环境生物技术。前面已提到，烷烃单加氧酶是微生物降解烷烃过程中的第一步酶，因此其显得尤为重要。它使难溶的烷烃转变为溶解性高的醇，有利于本身及其它微生物的降解利用。食烷菌是海洋中一类非常重要的石油降解优势菌。其中，柴油食烷菌NO1A是一种分离自深海的食烷菌新种，它能够利用碳链长度5C～36C的直链烷烃作为唯一碳源。因此，柴油食烷菌的烷烃单加氧酶具有极高的研究和应用价值。至今尚未有与本发明主题有密切联系的文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种食烷菌烷烃单加氧酶基因及其编码蛋白。
本发明分离出的DNA分子，它包括一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码一种新的烷烃单加氧酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列能在中等严谨条件下与SEQ ID No.1中1-1183的核苷酸序列杂交。最佳地，该序列具有SEQ ID No.1中1-1183位的核苷酸序列。
本领域内的普通技术人员可以理解到，由其它烷烃降解微生物也有可能制得相似的烷烃单加氧酶。这些可表达与SEQ ID No.2所示的序列有70％以上相同性之蛋白质的烷烃单加氧酶基因及其编码蛋白，乃至其相关应用亦应视为属于本发明范围之内。
与已公布发表的烷烃单加氧酶的氨基酸序列相一致，发现在本发明所述的烷烃单加氧酶的氨基酸序列中有3个组氨酸结构域(HXXXH；HXXXHH；HXXHH)，以及一个第四结构域(NYXEHYG[L/M])。与已公布的伯克氏菌的烷烃单加氧酶的蛋白质相同性最高(62.9％)。本发明所述的烷烃单加氧酶底物范围较宽(5C～36C)，这些都表明本发明所述的是一个新的烷烃单加氧酶。
在本发明中，“分离的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。“严谨条件”是指杂交的条件，如温度和缓冲液成分等产生的杂交严谨程度的等级。
具体实施例方式
下列实施例旨在进一步阐明本发明，而不是对本发明之范围的限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，2001)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1制备柴油食烷菌NO1A的基因组DNA文库并分离其烷烃单加氧酶基因1、柴油食烷菌NO1A基因文库的构建基因文库(genomic library)是指用分子克隆手段，将提取的某种生物基因组DNA，随机酶切或机械剪切为一定长度的片断，再与适当的载体DNA连接后转移到受体细胞中而形成的各种片断的重组子克隆的总和。借助合适的探针，通过分子杂交等途径即能筛选到目的基因。一个完整的基因文库应囊括该生物基因组上的所有基因。而本发明所用的基因文库是经过富集的基因文库。即为了提高筛选得到目的基因的几率，先对完全酶切后的DNA片断进行Southern Blot分析，之后回收杂交信号附近的DNA片断与载体连接，转化入大肠杆菌受体细胞。本发明使用CTAB法提取柴油食烷菌NO1A的总DNA，用EcoRI和KpnI限制性内切酶将总DNA完全酶切后，0.7％琼脂糖凝胶电泳分离，用下述的PCR产物探针进行Southern Blot分析。得到的杂交信号分别在2.5Kbp和4.5Kbp左右。切胶回收相关大小的DNA片断后，回收的胶块用BBI EZ-10 Spin Column DNA GelExtraction Kit纯化。连接到载体pUC18的EcoRI和KpnI位点上，为确定染色体插入片断最适的连接条件，按载体和插入片断的不同比值(1∶1、1∶2和1∶3)设三个处理。将连接混合物在16度下过夜连接后，用热激法转化到宿主大肠杆菌DH5α中，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选含有重组质粒或pUC18的菌株。
2、PCR产物探针的制备通过比较相关基因核苷酸序列，设计出烷烃单加氧酶基因的高度兼并引物，分别是MonF(TCA AYA CMG SNC AYG ARC T)和MonR(CCG TARTGY TCN AYR TAR T)，经PCR得到长度为420bp产物。50μL反应体系中含有5μL 10×PCR buffer；4μL 2mM dNTPs；2μL 10μM引物；50ng模板和2U Taq酶。PCR程序95℃1min，52℃1.5min，72℃1min，30个循环，4℃暂存。PCR产物纯化后，沸水浴变性，用Roche DIGhigh Prime DNA labeling and Detection Starter kit II试剂盒标记探针。
3、柴油食烷菌NO1A烷烃单加氧酶基因的克隆用影印法将生长在培养基上的菌落转移到Schleicher & SchuellButterfly Unprinted Nytron Super Charge尼龙膜上，碱法裂解菌体，紫外交联法固定DNA。用前述的PCR产物探针进行菌落原位杂交。随后洗脱杂交膜上非特异结合的探针，添加抗体CSPD溶液进行免疫学检测。最后用X-光底片曝光显示杂交结果。
从两个富集后的基因文库中，杂交得到多个含目的基因的阳性重组菌。通过提取重组质粒，经PCR和酶切鉴定及测序分析，拼接后得到3855bp的DNA片断，包括891bp柴油食烷菌NO1A烷烃单加氧酶基因片断，以及其上游2964bp的DNA片断。
本发明利用反向PCR的方法获得柴油食烷菌NO1A烷烃单加氧酶基因的下游序列。反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段。本发明设计了两对反向PCR引物，分别是3754+(AGT TGC TGG AGGTGG TCA ATT ATC TCG AGC)和3573-(GTT TCT CCA GCG ACC AGGCGG ATT TAA G)；3774+(TAT CTC GAG CAC TAC GGC TTG TTA CGGCA)和3405-(AGA CAT AGC TTG GCC ATC CAT TTC TCG TG)。先用了限制性内切酶Esp I、Bbe I、Bgl I和Van91 I完全酶切总DNA，之后同样用Southern Blot分析。Bbe I和Esp I处理后的杂交信号分别在2.5Kbp和2.0Kbp左右，Bgl I和Van91 I处理的杂交信号均小于2.0Kbp。故选择Bbe I来处理总DNA。切胶回收纯化相关大小的DNA片断后，自身环化。环化反应中DNA的浓度保持在低于5ng/μL。以环化后的DNA为模板，先用第一对引物扩增。得到阳性条带后，取0.5μLPCR产物作为模板DNA，用第二对引物作巢式PCR验证。之后PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收用BBI EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit纯化。之后连接到TaKaRa pMD 18-T载体中，转化、蓝白筛选、菌落PCR验证后测序。获得柴油食烷菌NO1A烷烃单加氧酶基因的全长序列及其下游754bp的DNA片断。
实施例2柴油食烷菌NO1A烷烃单加氧酶基因的序列信息及同源性分析本发明新的柴油食烷菌烷烃单加氧酶基因的全长为1183bp，详细序列见SEQ ID No.1。根据全长DNA推导出烷烃单加氧酶的氨基酸序列，共393个氨基酸残基，分子量为45901道尔顿，等电点(PI)为8.46。详细序列见SEQ ID No.2。
将柴油食烷菌NO1A烷烃单加氧酶基因的全长序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现数据库中与它在核苷酸水平上相同性最高的是Burkholderia cepacia RR10的烷烃单加氧酶(AJ293306)，相同性为62.5％。在氨基酸水平上，也是与Burkholderia cepacia RR10的烷烃单加氧酶(CAC36356)最高，相同性为62.9％。
实施例3柴油食烷菌NO1A烷烃单加氧酶基因的异源表达及转基因菌株的烷烃降解能力测定1、柴油食烷菌NO1A烷烃单加氧酶基因的异源表达利用引物alkBF(ACG AAT ACA TAT GAA GAC CGT AAC CNde I)和alkBR(TCT ACA GAA GCT TCG TCC TTC CBamH I)克隆柴油食烷菌NO1A烷烃单加氧酶基因的全长序列，同时在其5’和3’端导入了两个酶切位点。PCR扩增的产物先连接到TaKaRa pMD18-T载体中，转化、蓝白筛选、菌落PCR验证后测序。之后提取重组质粒，用Nde I和BamH I双酶切后连接到质粒pCom8的Nde I和BamH I位点上。再将带有柴油食烷菌NO1A烷烃单加氧酶基因的质粒pCom8转化入E.coli DH10B中。
本发明是利用三亲接合法，以E.coli DH10B为供体菌、E.coliCC118(RK600)为协助菌，将柴油食烷菌NO1A烷烃单加氧酶基因转入烷烃单加氧酶基因敲除突变菌株P.putida GPo12(pGEc47ΔB)受体菌中。
将带有重组质粒的供体菌E.coli DH10B接种于含有10μg/mL庆大霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜；将受体菌P.putida GPo12(pGEc47ΔB)接种于无抗性的LB中28℃培养过夜；将协助菌E.coliCC118(RK600)接种子无抗性的LB中37℃培养过夜。收集供体菌，离心、重悬、用新鲜的LB培养基洗涤，去除液体中的抗生素成分。各取20μL三种菌液，混匀、离心、去除上清，重悬于20μL 10mM MgSO4溶液中。滴于LB平板上，自然晾干。30℃培养16小时。收获菌体重悬于5mL 10mMMgSO4溶液中。取200μL菌液涂布于含100μg/mL庆大霉素和12.5μg/mL四环素的LB琼脂培养基上。28℃培养至长出菌落。菌落PCR验证接合结果。
2、含柴油食烷菌NO1A烷烃单加氧酶基因的转基因菌株的烷烃降解能力测定无碳源人工海水培养基(MMC)NaCl＝24g/L；MgSO4·7H2O＝7.0g/L；NH4NO3＝1g/L；KCl＝0.7g/L；KH2PO4＝2.0g/L；Na2HPO4＝3.0g/L，pH7.4，灭菌后补加适量微量元素混合液。若是固体培养基，则添加1.5％(g/mL)的琼脂粉。
对于短链烷烃(C5～C10)的降解能力测定，将烷烃加入一盖子上预先戳有小孔的小Eppendoff管中，置于培养皿盖子的内侧。上述含柴油食烷菌NO1A烷烃单加氧酶基因的P.putida转基因菌株接种于MMC琼脂培养基上后，用封口膜密封培养皿。28℃培养3天，发现在链长从C5到C10的直链烷烃中，转基因菌株均有生长。
对于中长链烷烃(C12～C32)的降解能力测定，将上述转基因菌株直接接种与烷烃含量0.5％(v/v)的10mL MMC中。28℃、200r/min摇床培养4～5天。发现其在C12～C24有明显生长，而在大于C28和C32生长非常微弱。
序列信息SEQ ID No.1的信息(1)序列特征(A)长度1183bp(B)类型核酸(D)拓扑结构线性(2)分子类型DNA(3)序列描述SEQ ID No.11 ATGAAGACCG TAACCATGCA GACTCAATCA GGCGAAGTAC AAGAATGGCG GGACAGTCGC61 CGCTACCTTT GGTTGCTCAG CACTCTGACC ATGCTGTTGC CCCTGTTCAC GGTCTGGCTG121GCCAGCAGTA CCGGCTGGGC CGTGTTCTGG TGGTTTGGAT TCCTGTTCGT ATTCGGGGTG181ATCCCGCTGC TGGACATGCT GCTTGGCGAA GAGACCGAGA ATCCGCCGGA AGCGCTGGTG241CCGCGGTTGG AACAGGACCG GTATTACCGC TGGGCGGTGT ATGTGTGCCT GCCGTTTCTT301TATGGCGCCT TTATTTATGC CGCCTGGGTG GCCGCCACCT GGAGTCTGCC CTGGTACAGC361TATCTGGGGC TGGCGGTCTC CACGGGCTGC GCCACGGGTA TCGCCATCAA TACCGCCCAT421GAGATGGGGC ACAAGACCGA CCGCCACGAG AAATGGATGG CCAAGCTATG TCTCGCCCCG481GTGTTCTACG GGCACTTCTA TGTGGAACAC AATCGTGGGC ATCACGTCAG GGTGTCCACC541CCGGAGGATC CGGCATCTTC CCGGTTCGGC GAGACGTTCT GGGAGTTCCT GCCGCGCACC601GTGATCGGCA GCCTTAAATC CGCCTGGTCG CTGGAGAAAC AGCGACTGGA GCGGCAGGGA661CTTTCGGTGT GGAGCTGGCA GAACGACAAT CTGCAGGCCT GGGCACTGTC GGCGGTGCTT721TGGGGTGTCC TGATGCTGTG GTTGGGCTGG GCGGTGGTGC CGTTCCTGCT GATTCAGAGC781CTGTTCGGTT TTCAGTTGCT GGAGGTGGTC AATTATCTCG AGCACTACGG CTTGTTACGG841CAAAAAAAGG ACAATGGGCG TTATGAACGC TGTCTGCCGG AGCATTCCTG GAATTCGAAC901CGCCGGGTAA CCAATATTTT YCTCTACCAG TTGCAACGGC ATTCCGATCA TCACGCCTAC961CCCACGCGCA GCTATCAATC GCTGCGGCAT TTCGATGAAT CCCCCCAATT ACCGGGCGGA1021 TACGCATCGA TGATCCTGCT GGCGTGGGTA CCTCCGCTGT GGTTCAGGAT CATCGACCCG1081 ATGGTGGTGC GCCATTATCA AGGCGATATG AGCCGCGCCA ACATCAAACC GCGGATCCGG1141 GACGAGGTAT CGGCTCGGTA TGGTGGCCGG GAGCCGGTGA ACTSEQ ID No.2的信息(1)序列特征(A)长度393aa(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(2)分子类型多肽
(3)序列描述SEQ ID No.21 MKTVTMQTQS GEVQEWRDSR RYLWLLSTLT MLLPLFTVWL ASSTGWAVFW WFGFLFVFGV61IPLLDMLLGE ETENPPEALV PRLEQDRYYR WAVYVCLPFL YGAFIYAAWV AATWSLPWYS121 YLGLAVSTGC ATGIAINTAH EMGHKTDRHE KWMAKLCLAP VFYGHFYVEH NRGHHVRVST181 PEDPASSRFG ETFWEFLPRT VIGSLKSAWS LEKQRLERQG LSVWSWQNDN LQAWALSAVL241 WGVLMLWLGW AVVPFLLIQS LFGFQLLEVV NYLEHYGLLR QKKDNGRYER CLPEHSWNSN301 RRVTNIFLYQ LQRHSDHHAY PTRSYQSLRH FDESPQLPGG YASMILLAWV PPLWFRIIDP361 MVVRHYQGDM SRANIKPRIR DEVSARYGGR EPVN
权利要求
1.一种烷烃单加氧酶基因序列，其特征在于，分离出的DNA分子，它包括编码具有烷烃单加氧酶活性的多肽的核苷酸序列，而且所述核苷酸序列能在中等严谨条件下与SEQ ID No.1中1-1183的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的烷烃单加氧酶蛋白编码序列，其特征在于，所述的序列编码一种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或者所编码蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID No.2中所示的序列有至少70％相同性。
3.如权利要求1或2中所述的烷烃单加氧酶基因及其编码蛋白，其应用方式包括作为基因原件用于工程菌构建、单加氧酶的获取利用、或作为生物催化剂以烷烃类为底物合成新的化合物、或作为监测与标示的对象用于环境监测。
全文摘要
本发明提供了一种烷烃单加氧酶基因及其编码蛋白，属于生物工程和生物化工领域。它分离自一种能够降解碳链长度为5C～36C直链烷烃的食烷菌新种柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)。本发明在生物修复和生物催化方面具有很大的应用价值。
文档编号C12N9/02GK1900284SQ20051008615
公开日2007年1月24日 申请日期2005年7月22日 优先权日2005年7月22日
发明者邵宗泽, 刘陈立 申请人:国家海洋局第三海洋研究所