专利名称：氢氧化细菌wmq-7及其分离方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及氢氧化细菌WMQ-7及其分离方法和应用，具体涉及一种不含吸氢酶的豆科植物根际土壤中分离培养出的氢氧化细菌恶臭假单胞菌i^Pseucbmorms putida)mQ-7 及其微生物制剂，该氢氧化细菌WMQ-7菌株于2011年3月8号保藏于武汉大学中国典型培养物中心，保藏编号为CCTCC M 2011060。
背景技术：
豆科作物的轮作、间作效益多被认为是来自豆科作物根部的残留氮的作用，而新近的研究表明氮肥并不能完全取代豆科作物的轮作效果，大约75%的增产效应还不能用已有的理论来解释。研究发现，不含吸氢酶(Without Uptake Hydrogenase，HUP —)的根瘤菌在固氮过程中释放的吐能够促进根际氢氧化细菌的生长，并进一步促进植物生长，即“氢肥理论”。即Hup_豆科根瘤在固氮过程中释放的H2可以通过改变豆科根瘤周围的特定土壤微生物种群——氢氧化细菌来促进植物的生长。最新研究表明，某些氢氧化细菌通过促进植物对矿质元素的吸收和利用、产生某种促进植物生长的代谢物、抑制有害病原菌等，直接或间接增进土壤肥力、增强植物抗病和抗干旱能力调控作物生长。氢氧化细菌是能够利用H2作为能源并同化CO2作为碳源的一类细菌，在自然界中氢氧化细菌的营养要求比较简单，而分离培养氢氧化细菌的培养基，需要特定的营养和条件，如以铵盐形式存在的氮元素、钠或钾的磷酸盐、硫酸镁、铁盐和钙盐。多年来人们一直致力于如何有效分离、纯化出氢氧化细菌，以便进行进一步的研究，但由于氢氧化细菌的生长需要消耗H2,导致菌株的分离工作极其困难，这是因为H2混合气体存在一定的安全隐患(H2 浓度> 5%易于爆炸)。培养设备、混合气体浓度、培养基的营养成分、温度、PH及盐浓度等都可能影响氢氧化细菌的生长。氢氧化细菌属于植物根际促生菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria, PGPR)，对农作物的增产具有重要作用，其研究价值已引起广泛重视。由于技术限制，至今未得到大面积推广应用。选择正确的氢氧化细菌的分离培养方法，构建完善的培养体系，是实现大规模菌种选育工作的基础，进一步制备出促进植物生长的氢氧化细菌制剂，是当前所面临的主要问题。因此，本发明的发明者在研究土壤微生物的同时，采用气体循环培养体系，模拟自然土壤环境，从豆科作物根际土壤中筛选出自然条件下的优良氢氧化细菌。分离鉴定了可定植于小麦植物根系内外的氢氧化细菌WMQ-7，并发现该菌株可替代豆科作物固氮过程中释放的氢气的作用，促进农作物生长，大幅度地减少土壤的退化和水系的污染，改善土壤肥力，促进农业的可持续发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种氢氧化细菌WMQ-7及含有氢氧化细菌WMQ-7或由其产生的次级代谢物的环境亲和性氢氧化细菌制剂。
本发明的另一目的是提供上述氢氧化细菌的分离方法。本发明的氢氧化细菌为恶臭假单胞菌G^ewi/offloaas putida)·-],已于2011年 3月8号在武汉大学中国典型培养物中心保藏，其保藏登记号为CCTCC M 2011060。在自然条件下，氢氧化细菌WMQ-7定植于植物根系内外，分泌植物生长促进物质， 并通过对植物病原菌的拮抗作用来抑制多种病原体的生长。本发明的氢氧化细菌WMQ-7为在的MSA培养基中培养的革兰式阴性杆状细菌。本发明的氢氧化细菌的分离培养方法首先是利用持续通H2的培养装置实现对土壤样品的富集，然后将其稀释涂布于MSA培养基平板，筛选能够以吐为能源并同化(X)2为唯一碳源的菌株，进而纯化并转接MSA培养基斜面，气相色谱检测菌株的吐消耗量，从而进一步筛选出吐消耗能力比较强的氢氧化细菌。而后经过实验室发酵，制备氢氧化细菌制剂不同剂型，最后分析氢氧化细菌制剂不同剂型对冬小麦促生效果。其鉴定特征如下 1、生理生化特征
WMQ-7菌株的生理生化特征显示在表1中。所述WMQ-7菌株呈短杆状，大小约0. 52μπι 0. 76μπι X 0. 84 μ m 1. 80 μ m，革
兰氏染色阴性。在MSA半固体培养基上观°C培养7 d可形成1.5 mm菌落，呈圆形、边缘不整齐，白色，表面光滑。
权利要求
1.一种氢氧化细菌WMQ-7，其特征在于该细菌为恶臭假单胞菌O^e^/offloaas putida) WMQ-7，保藏登记号为 CCTCC M 2011060。
2.根据权利要求1所述的氢氧化细菌WMQ-7，其特征在于氢氧化细菌WMQ-7的生态特征如下WMQ-7菌落特征在MSA半固体培养基上观°C培养7 d可形成1. 5 mm菌落，呈圆形、 边缘不整齐，白色，表面光滑；WMQ-7个体形态短杆状，大小约0. 52 μ m 0. 76 μ m X 0. 84 μ m 1. 80 μ m，一端丛生鞭毛，革兰氏染色阴性。
3.含有权利要求1所述的氢氧化细菌的固体菌剂。
4.权利要求3所述的氢氧化细菌固体菌剂的制备方法，其特征在于将新鲜的氢氧化细菌发酵液以草炭、泥炭土、米糠、菜园土、锯木屑或蒙脱土为吸附剂制成固体菌剂。
5.权利要求1所述的氢氧化细菌的制备方法，包括以下步骤(1)样品采集按常规方法采集生长旺盛且不含吸氢酶的结瘤豆科植物根际土壤；(2)土壤富集将采集的土壤样品置于持续通吐的培养装置，富集土壤中的氢氧化细菌；(3)菌种分离与纯化土壤稀释涂布于矿质盐培养基平板，置入密闭容器，室温倒置培养，待平板长出明显菌落，挑取单菌落用稀释涂布法进一步纯化；(4)菌种筛选气相色谱仪进行检测并筛选氢氧化细菌。
6.根据权利要求5所述的氢氧化细菌的制备方法，其特征在于其中步骤(1)所述的不含吸氢酶的豆科植物包括紫花苜蓿、大豆、紫云英和三叶草，根际土壤范围为距离根瘤5 mm 以内。
7.根据权利要求5所述的氢氧化细菌的制备方法，其特征在于，其中步骤(2)所述采集的根际土壤用16目的筛子过筛后与石英砂以体积比2:1混合，将混合土壤装入两端密闭的玻璃管中，H2流速为观0 mL/min，H2含量为4. 16 X 1(Γ4-2· 42 X 1(T3 mol/L的混合气体，富集土壤中的氢氧化细菌。
8.根据权利要求5所述的氢氧化细菌的制备方法，其特征在于，其中步骤(3)所述的矿质盐培养基=NaNO3 2. 0 g, KH2PO4 0. 14 g, K2HPO4 1. 2 g，酵母膏 0. 02 g, MgSO4 0. 5 g, Fe2 (SO4) 3 ·3Η20 0.01 g，KCl 0.5 g，琼脂 15 g，蒸馏水 1 L，pH 7-7. 2 ；取富集 1 个月的混合土壤与水混勻，以10_3-10_6梯度稀释涂布MSA培养基平板。
9.根据权利要求5所述的氢氧化细菌的制备方法，其特征在于，其中步骤(4)所述的气相色谱条件为内装5A分子筛的1 mX2 mm的色谱柱，载气为高纯度N2，流速20 mL/min, 进样口温度150 °C，检测器温度160 °C，检测温度40 °C。
10.权利要求1所述的氢氧化细菌在促进植物生长中应用。
全文摘要
本发明涉及一种氢氧化细菌恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)WMQ-7，已于2011年3月8号在武汉大学中国典型培养物中心保藏，其保藏登记号为CCTCC M 2011060；还涉及从不含吸氢酶的豆科植物根际土壤中分离培养出该氢氧化细菌的方法，首先是利用持续通H2的培养装置、矿质盐培养基实现对氢细菌的富集、分离和培养，并通过气相色谱法筛选具有较强氧化H2的菌株。以最优菌株在实验室发酵，制备氢细菌制剂。该生物制剂用于农业生产可以提高植物生长，提高产量，提高肥效和提高植物的抗逆能力。
文档编号C05F11/08GK102268391SQ201110191379
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月9日 优先权日2011年7月9日
发明者付博, 王卫卫, 蒙渊 申请人:西北大学