专利名称：一种绿色木霉菌株及其代谢物的应用的制作方法
技术领域：
本发明特别涉及一种绿色木霉菌株及其代谢物的应用，属于微生物和农业领域。
背景技术：
花生(Arachis hypogaea L.)是我国重要的油料和经济作物，其种植面积和生产总量居世界前列，在国际上具有很强的竞争力。一直以来，花生特别容易受黄曲霉毒素污染，受污染后的花生不但产量和品质大大下降，还严重威胁人类的生命健康，因此如何合理有效地防治花生免受黄曲霉毒素污染是提高花生出口贸易的重要问题。黄曲霉(Aspergillus flavus)存在于霉变的花生中，在生长后期，黄曲霉产生次生代谢产物黄曲霉毒素(Aflatoxins)，对人体和畜禽的组织器官产生毒性伤害，诱发癌症。由于黄曲霉能在比较恶劣的环境下生长，因此控制黄曲霉及其毒素的污染比较困难。农业上防治真菌及其毒素对食品污染的主要途径是遵守良好的农业生产操作规范，选择抗真菌的优良品种，但由于黄曲霉毒素是一种次级代谢产物，其产生量受环境影响十分严重，所以田间的预防措施也不能完全避免黄曲霉毒素的污染。收获后储藏过程中采取措施，如化学防霉等可抑制或延缓微生物的生长，但防霉效果不是很理想，而且化学防霉剂对人和动物有诸多潜在的危害。由于黄曲霉毒素对热不敏感，100°c处理20h黄曲霉毒素都不会被破坏，巴氏消毒也不能去除毒素的污染，因此采取预防措施是避免黄曲霉毒素的最佳办法。但目前还缺少真正有效、经济、操作性强的防霉去毒措施，因此从安全的角度出发， 考虑利用微生物之间的拮抗作用，探索生物控制方法以预防真菌的生长与产毒具有重要意义。尽管目前已经筛选到的抗黄曲霉化合物有很多，但真正能够投入实践中应用的却很少，筛选出的微生物对黄曲霉的拮抗效果也不太理想，且成本较高，现急需寻找新的拮抗菌来抑制黄曲霉的生长。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种绿色木霉菌株。本发明的另一目的在于提供一种降低花生收获前黄曲霉毒素污染的制剂，该制剂含有上述绿色木霉菌株。本发明的再一目的在于提供所述降低花生收获前黄曲霉毒素污染的制剂的制备方法和应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种绿色木霉(Trichoderma viride)菌株，名称为绿色木霉GZ101，于2010年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC M 2010291。所述绿色木霉菌株应用于防治黄曲霉素的污染。一种降低花生收获前黄曲霉毒素污染的制剂，含有上述绿色木霉菌株的代谢物；所述降低花生收获前黄曲霉毒素污染的制剂的制备方法，包含以下步骤将绿色木霉菌株接种到PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)液体培养基中，进行发酵培养，发酵上清即为降低花生收获前黄曲霉毒素污染的制剂。所述的PDA液体培养基的组成为马铃薯200g，葡萄糖20g，pH6. 8，蒸馏水定容至 IOOOml ；所述的发酵条件可用现有技术中木霉的摇瓶发酵条件和发酵罐发酵条件，摇瓶发酵培养的条件优选为接种量IO5 IO7个孢子/IOOml培养基，28 30°C，200rmp摇菌培养 5 8天；所述制剂应用于降低花生收获前黄曲霉毒素污染，具体步骤包括将所述制剂直接喷洒于收获前2周的花生土壤中或是将所述制剂稀释或浓缩后喷洒于收获前2周的花生土壤中均可。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果本发明提供了一种能有效拮抗黄曲霉生长的绿色木霉菌株。该绿色木霉菌株的代谢物喷洒于花生种植土壤中，能有效地降低花生收获前黄曲霉毒素污染，降低率达97%。
图1是GZlOl制剂对黄曲霉毒素Bl的降解作用图。图2为GZlOl制剂对土壤黄曲霉种群数的影响图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1(1)绿色木霉菌株的分离及鉴定①分离土样取自广东省汕头市花生种植田土壤。称取土样10g，放入盛有IOOml无菌水的带有玻璃珠的三角瓶中，振荡摇勻IOmin使土和水充分混合。在无菌操作条件下，用移液枪从三角瓶中吸取lml，加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均勻，依此类推分别制成10-2、10_3、10-4不同稀释度的土壤溶液。②涂布培养及划线分离以10_2及10_3两个浓度的土壤稀释液作为涂布平板培养的对象，将其涂布在PDA (马铃薯葡萄糖琼脂)固体培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂 15g，pH6.8，蒸馏水定容至1000ml)上，每个样3个重复，28°C培养3天后，对平板中的微生物进行观察，用接种环挑取平板中长势旺盛的菌株进行划线分离，得到纯培养物。接着对纯培养进一步筛选利用牛津杯双层平板法将纯培养物的发酵液对黄曲霉进行抑菌活力的测定(所用的黄曲霉为黄曲霉GIM3. 17，购于中科院微生物所)，得到了不仅能抑制黄曲霉菌丝的生长，还能抑制黄曲霉孢子的萌发的黄曲霉拮抗菌GZ101。③菌株鉴定A、形态学鉴定平板上菌落形态特征将接种针经火焰灭菌并待冷却后，从斜面上挑取少量黄曲霉拮抗菌GZlOl菌体，接种于平板的中间位置，倒置于25°C培养7 14天，观察菌落特征。 结果表明，在察氏固体培养基上，生长较差，菌丝稀疏，培养7天后有稀疏的绿色产孢子丛束区，菌落反面无色；在麦芽汁固体培养基上生长快，培养7天后菌丝铺满整个平皿，最初为白色致密的基质菌丝，而后出现棉絮状气生菌丝，并形成密实产孢丛束区，常排成同心轮纹，黄绿色的产孢区，有辐射状沟纹，菌落反面无色；在PDA固体培养基上生长速度快，培养 7天后菌丝铺满整个平皿，最初为白色致密的基质菌丝，而后出现棉絮状气生菌丝，并形成密实产孢丛束区，常排成同心轮纹，深黄绿色至深蓝绿色的产孢区，菌落反面无色。显微镜下形态特征观察用解剖针从培养皿的菌落上，挑取少量黄曲霉拮抗菌 GZlOl菌体，置载玻片的水滴中，加盖盖玻片。于显微镜下观察其形态特征。发现其菌丝透明，壁光滑，有隔，直径1.5 8μπι，厚垣孢子间生于菌丝中或顶生于短侧枝上，多数为球形，少数为椭圆形，透明，壁光滑；分生孢子梗为菌丝的短侧枝，其上对生或互生分枝，分枝上继续分枝，形成二级、三级分枝，小梗瓶形成锥形，基部稍窄，中部较宽，从中部以上变窄成长颈，(8 12) X O. 5 3) μ m,分生孢子多数为球形，直径2. 5 4. 5 μ m，少数孢子为短倒卵形，(4 5) X (3. 5 4) μ m。根据以上培养特征及显微形态特征结果，查《真菌鉴定手册》及《真菌的形态和分类》可知，该菌与绿色木霉菌(Trichoderma viride)最相似。B、分子生物学方法进行鉴定黄曲霉拮抗菌GZlOl的DNA的提取将GZlOl菌株接种于PDA固体培养基中，28°C 恒温培养3 5天后，将菌丝转移至灭过菌的研钵中，用液氮将菌体迅速研磨成粉末后，用基因组提取试剂盒提取基因组DNA。PCR扩增以提取的DNA为模板，用真菌通用引物 ITSl (5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，)、IT S2(5，-GCTGCGTTCATCGATGC-3，)扩增 18S rDNA
基因。PCR反应体系为试剂体积2x PCR Master Mix5 μ L引物ITSl (浓度为 10 μ Μ)IyL引物ITSl (浓度为 10 μ Μ)IyL基因组DNA (浓度为 10ng/uL)5 μ L灭菌水定容至50 μ L反应条件94"C 5min ；940C Imin，56 lmin，72°C 2min(30 个循环)；72 °C 7min ；4°C 保存。将扩增条带回收后送往上海英俊公司测序，测序序列如下所示。将测得的18S rDNA基因序列在GenBank等国际核酸序列数据库内进行同源序列搜索(blast search)，找出该菌株与数据库中同源性最高的模式菌株或保藏于ATCC或DSM等国际菌种保藏中心的菌株。结合形态特征，确定黄曲霉拮抗菌GZlOl为绿色木霉菌(Trichoderma viride)。将该菌株命名为绿色木霉GZ101，于2010年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC M 2010291ο测序序列
权利要求
1.一种绿色木霉(Trichoderma viride)菌株，其特征在于该绿色木霉菌株名称为绿色木霉GZ101，于2010年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010291。
2.权利要求1所述绿色木霉菌株应用于防治黄曲霉素的污染。
3.一种降低花生收获前黄曲霉毒素污染的制剂，含有权利要求1所述绿色木霉菌株的代谢物。
4.权利要求3所述降低花生收获前黄曲霉毒素污染的制剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤将绿色木霉菌株接种到PDA液体培养基中，进行发酵培养，发酵上清即为降低花生收获前黄曲霉毒素污染的制剂。
5.权利要求3所述制剂应用于降低花生收获前黄曲霉毒素污染，其特征在于包括如下步骤将所述制剂喷洒于收获前2周的花生土壤中即可。
全文摘要
本发明公开了一种绿色木霉菌株及其代谢物的应用，属于微生物和农业领域。该绿色木霉菌株能有效拮抗黄曲霉生长，其名称为绿色木霉GZ101，于2010年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NOM 2010291。该绿色木霉菌株在PDA液体培养基中的发酵上清喷洒于花生种植土壤中，能有效地降低花生收获前黄曲霉毒素污染，降低率达97％，因此可应用该绿色木霉菌株的代谢物制备成降低花生收获前黄曲霉毒素污染的制剂。
文档编号C12N1/14GK102168019SQ20101058986
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者刘付香, 周桂元, 李少雄, 李玲, 梁炫强, 洪彦彬, 温世杰 申请人:广东省农业科学院作物研究所