一种溶藻减负复合生物制剂的制备方法

专利名称：一种溶藻减负复合生物制剂的制备方法
技术领域：
本发明属于环保生物工程领域，更具体涉及一种溶藻减负复合生物菌剂的制备方 法。该菌剂易于培养，适宜工业化生产，适用于降低富营养化水体、控制蓝藻水华爆发。
背景技术：
蓝藻是地球上最早出现的光合自养生物，在长期的进化过程中，这类生物发展了 一套独特的形态和生理生化机制，能够在各种不同生境中生衍，使其具有一定的竞争优势。 在环境条件适宜时，某些蓝藻能快速生长，当达到一定生物量时，这些藻类在水体表层大量 聚集，形成肉眼可见的藻类聚集物，即蓝藻水华。蓝藻水华引起的一系列环境和健康问题， 正受到全世界各国的高度重视。藻类过度繁殖是导致湖泊水环境恶化的关键环节，有害藻 类的过度增殖，尤其产毒素蓝藻给人类健康构成了潜在的威胁。针对我国湖泊面临的严重 富营养化及其灾害问题，在湖内污染源、流域点源与面源污染控制需要投入巨大资金且短 期内难以取得成效的情况下，探索浮游藻类生物量的控制、抑制“水华”发生、改善湖泊水 质的有效途径是非常必要的。藻类的控制技术可归结为物理方法、化学方法和生物方法。 物理方法主要是电磁场、机械除藻等，可作为蓝藻水华控制的辅助性措施，但处理能力有 限，局限于水处理工程应用。化学除藻的方法主要包括施用除草剂、杀藻剂及金属盐等。化 学药剂除藻技术虽有快速高效的优点，但会带来水体的二次污染问题，直接在作为饮用水 源的湖泊、水库等的应用受到限制或必须慎用。生物学控藻技术是利用藻类的天敌及其产 生的生长抑制物质对藻类的生长、繁殖进行抑制，从而达到控制藻类数量、防治富营养化 带来的各种危害，目前正处在研究发展的初期阶段。溶藻细菌(algae-lysing bacteria)
，作为水生生态系统生物种群结构和功能的重要组成部分，对维持藻的生物量平衡具有非 常重要的作用。溶藻细菌，作为水华防治的生物，已经引起越来越多人的关注。我国已经 成为水华的多发国度，其造成的环境和经济问题日益引起重视，寻求有效的水华防治途径 势在必行。复合微生物制剂是由多种有益微生物组合成，能促进水体中有机污染物分解，降 低B0D、C0D，净化水质等高效。本发明采用溶藻菌和复合微生物制剂相结合，制成的溶藻减 负复合生物制剂，喷施在湖泊、水库及河道等富营养化水体后，能调整水体生态环境，能效 地降低富营养化水体的营养成分；增加水体的溶氧量，促进水体中氮、磷、有机污染物的 分解，降低B0D、C0D，净化水质，消除环境恶臭；保持水体的生态平衡；从而达到控制富营 养化湖泊蓝藻水华发生的目的。

发明内容
本发明的目的是在于提供了一种溶藻减负复合生物菌剂的制备方法，方法易行， 操作简便，降低了富营养化水体，控制了蓝藻水华爆发。该菌剂易于培养，成本底，适宜工厂
化生产。为了达到上述的目的，本发明采取溶藻菌和减负复合菌分别生产，混合应用的技 术措施是1、菌种来源
A溶藻菌为专利菌种(专利号ZL2004100U9324，菌种名为肠杆菌；拉丁文是 Enterobacteriaceae. sp，保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为M204010。) B减负生物制剂是由多种复合微生物组成，主要是以乳酸菌类、光合菌类、酵母菌类、 丝状菌类、革兰氏阳性放线菌类等复合在同一种液体中以活性状态共同存在。一种溶藻减负复合生物菌剂的制备方法，其步骤是
其主要构思是:A、I级、II级菌种实验室培养；B、III级种子(母液扩大培养)；C、规模化 生产。、I、II级菌种(实验室)培养
(1)培养基
①溶藻菌培养基
牛肉膏l-5g、 蛋白胨8-12g、氯化钠3-7g、水1000ml、琼脂1. 5-2. 5%、 pH=7. 0-7. 8
②减负复合菌剂培养基
红糖 80-120g、磷酸氢二钾 0. 01-0. 05g、硫酸镁和 0. 01-0. 03g、水 1000ml、 pH=6. 8-7. 4
(2)I级种子培养(试管斜面培养)
①无菌室消毒接种应在无菌室内的超净工作台上进行，接种前将无菌室内和超净工 作台内的紫外灯同时打开，灭菌lh。②接种试管、平板和三角瓶接种应在超净工作台内进行。③培养菌种接种后应放在培养架上或生物培养箱内培养，温度控制在 25- °C。II级种子培养(三角瓶液体培养)
①无菌室消毒同I级种子培养中的第一步①；
②接种试管、平板和三角瓶接种应在超净工作台内进行，操作人员必须穿戴消毒过 的工作服和工作帽，接种前手先用体积分数75%的酒精消毒后再开始操作，接种针或环必 须在酒精灯上烧红3次，才能进行接种，将试管斜面或在培养皿平板培养好的I级菌种，用 接种针和接种环，将菌种转接到三角瓶液体中，操作时接种物在酒精灯的火焰边进行，接种 完毕后立即用棉塞将试管封口或立即盖上三角瓶；
③培养a、溶藻菌II级菌种接种后应放在恒温摇床上振动培养，温度控制在 25-29°C，如没有恒温摇床可以培养架上或生物培养箱内培养，每天应摇动2-3次为宜。B、 减负复合菌剂II级菌种接种后室温(20-25°C以下相同)静置培养。④II级菌种培养约5-7天后即可生长好，即可进行III级种子(母液扩大)培养。、III级种子(母液扩大培养)
(1)溶藻菌III级种子(母液扩大培养)
①培养基配制先用40-60°C的温水将牛肉膏、蛋白胨分别溶化，加干净的井水，然后 加入氯化钠，其中按每升牛肉膏l-5g、蛋白胨8-12g、氯化钠3-7g的比列在混合器中搅拌均 勻，再分别装入25L的清洗干净的塑料壶中。②接种待本步骤第一步①培养基融化后，冷却到^_31°C，再加入250_350mL II级溶藻菌菌种，然后把接种好的菌水塑料壶用棉塞或牛皮纸包扎。③发酵在壶口插上通气和出气管各一支，在观_321条件下通气发酵培养。一 般5-7天后发酵完成，可以作为规模化生产的种子。减负复合菌剂III级种子(母液扩大培养)
①培养基配制先烧开10000ml的水(温度控制在90-100°C)，加800_1200g的红糖， 把红糖融化开，把红糖里面的有害菌消除。然后分别加0. 1-0. 3g硫酸镁和0. 2-0. 4g磷酸 氢二钾。②接种待本步骤第一步①培养基融化后，冷却到^-31°C，然后接种IOOOg II级 减负复合菌剂菌种。③发酵后把IOOOOg的菌水整体装进一个大塑料壶或者其他的容器中，要密封 发酵，不能漏气。不要装的太满，在发酵过程中会产生气体，装满容易涨破塑料壶。6-8天 后，温度低于15°C要多发酵4-5天，使发酵时间达到10 13天。打开瓶口，有气体产生。 闻到酸甜闻到就证明发酵成功。C、规模化生产方法
(1)培养基
①溶藻菌培养基
牛肉膏 1000-2000g 蛋白胨 4000-6000g 氯化钠 3000_7000g 水 1 m3 pH=7. 0-7. 8
②减负复合菌剂培养基
红糖 400000-600000g 磷酸氢二钾 1000_5000g 硫酸镁 1000-3000g 水 10m3。 pH=6. 8-7. 4
(2)溶藻菌规模化发酵生产
先用40-60°C的温水，将牛肉膏、蛋白胨分别溶化，然后加入氯化钠，其中分别 以每方牛肉膏1000-2000g、蛋白胨4000-6000g和氯化钠3000_7000g的量在混合器中搅拌 均勻，再放入I-IOm3的培养池中，加溶藻菌III级种子(母液)0. 1-lm3，然后加井水至l_10m3， 最后用塑料薄膜密封，28-32°C发酵培养。一般6-8天后即可。减负复合菌剂规模化发酵生产
先用开水(温度控制在90-100°C)将400000-600000g红糖溶化，加井水500L，然后以 每10 m3加入红糖400000-600000g，硫酸镁1000-3000g和磷酸氢二钾1000_5000g的量， 在混合器中搅拌均勻，再放入10-20 m3的培养池中，加溶藻减负复合菌Ι-aii3，然后加井水 至10-20m3，最后用塑料薄膜密封，28-32°C发酵培养。一般6_8天后即可。溶藻减负复合生物制剂配比与包装
1)将发酵生产好的溶藻菌和减负复合菌按照3 7的比例混合。然后进行收获与包装。2)产品用50L_lm3塑料桶包装。贴上带有产品说明书和生产日期的标签。3)抽样对产品按照企业标准进行检查，检查合格后贴上检验合格证。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果
方法易行，操作简单，无污染，安全性高。细菌溶解蓝藻是位于实际应用的前沿。相比 杀蓝藻的如硫酸铜等化学物质具有明显的优点。使用细菌清除蓝藻不会带来第二次污染。在较大的水体中形成一种新的生态平衡。溶藻减负复合生物菌剂制按1/10000浓度喷洒在 蓝藻爆发初期的湖泊、水库及河道等富营养化水体后，能调整水体生态环境，能效地降低富 营养化水体的营养成分；增加水体的溶氧量，促进水体中氮、磷、有机污染物的分解，降低 BOD, COD,净化水质，消除环境恶臭；保持水体的生态平衡；从而达到控制富营养化湖泊等 水体蓝藻水华发生的目的。本发明溶藻减负复合生物菌剂易于培养，成本底，适宜工厂化生 产。对水体无污染。具有环境、社会效益。


图1为一种溶藻减负复合生物菌剂的制备方法方框示意图
其中溶藻菌原种A、减负复合菌菌种B、I 一III级种子(溶藻菌)C、I 一III级种子(减 负复合菌)D、发酵池大规模生产E、发酵池大规模生产F、溶藻减负复合生物制剂G、富营养 化湖泊应用或其他水体应用H。
具体实施例方式I、II级菌种(实验室)培养
菌种分为母种(I级种)、原种(II级种)。I级菌种将纯菌丝体或孢子在试管培养基中繁殖而成.可以繁殖原种，也适宜 菌种保藏。II级菌种母种菌丝在固体培养基上繁殖而成.这一过程增强菌丝对培养环境的 适应性，又起到扩繁的作用.
1)培养基 ①溶藻菌培养基
牛肉膏l-5g 蛋白胨8-12g 氯化钠3-7g 水IOOOml琼脂1. 5-2% pH= pH=7. 0-7. 8
②减负复合菌剂培养基
红糖 80-120g 磷酸氢二钾 0.01-0. 05g 硫酸镁和 0. 01-0. 03g 水 1000ml pH=6. 8-7. 4
一种溶藻减负复合生物菌剂的制备方法，其步骤是 溶藻菌原种A
①称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏l_5g、蛋白胨8-12g、氯化钠3-7g 放入烧杯中。牛肉膏l_5g常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水(40°C 600C ) 500mL溶化后倒入烧杯。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。②溶化在上述步骤①的烧杯中可先加入少于500 mL的水量，用玻棒搅勻， 然后，在石棉网上加热500°C使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积 1000mL。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热到大概300°C溶 化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。③调pH至7. 6在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH 偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入lmol/L NaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值， 直至PH达7. 6。反之，则用lmol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。④分装将配制的培养基分装入试管内，分装过程中注意不要使培养基沾在管 口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。试管装量不超过管高的1/5。⑤加塞培养基分装完毕后，在试管口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养 基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。⑥包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭 菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。⑦灭菌灭菌在菌种的培养中，是十分重要的一个环节。溶藻菌种转接、溶藻菌 培养基制备，任何一个环节都必须使用灭菌的器械，否则都会造成杂菌污染。培养所需要的 三角瓶、试管、培养皿，灭菌前洗净，三角瓶可以用牛皮纸内衬粗滤纸来包住瓶口，用棉线缠 紧；或者自做棉塞，外部再加上牛皮纸包住；试管必须和棉塞或者试管塞一起用牛皮纸包 好灭菌。培养皿可以5-10个一起用牛皮纸包好灭菌。移液管、滴管、接种环都可以分别用 牛皮纸包好，在高压灭菌锅内，以1.05kg/cm2 (15磅/英寸2)，121. 3°C，30分钟高压蒸汽 灭菌。所有灭菌后的器皿、培养基只能在超净台上打开使用。将上述培养基如因特殊情况 不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。⑧搁置斜面将灭菌的试管培养基冷至50°C左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁 置的斜面长度以不超过试管总长的三分之一为宜。⑨无菌检查将灭菌的培养基放入37°C的温室中培养24— 48小时，以检查灭菌 是否彻底。得到无菌的溶藻菌培养基。
减负复合菌菌种B:
减负复合菌是一种新型的复合微生物制剂，呈棕色半透明液体，PH值在3. 5 4. 5之 间，不含任何有害物质，无毒副作用，不污染环境。主要是乳酸菌类、光合菌类、酵母菌类、丝 状菌类、革兰氏阳性放线菌类等复合在同一种液体中以活性状态共同存在。目前世界上已 有一百多个国家和地区，在生活垃圾、污水处理、治理河流和湖泊甚至日常生活、保健医疗 等领域广泛应用。它可以降低水体富营养，抑制腐败病原菌的滋生，消除环境恶臭，净化水 质，循环利用资源等等。I 一III级种子(溶藻菌)C I级种子培养(试管斜面培养)
①无菌室消毒接种应在无菌室内的超净工作台上进行，接种前将无菌室内和超净工 作台内的紫外灯同时打开，灭菌lh。②接种试管、平板和三角瓶接种应在超净工作台内进行，操作人员必须穿戴消 毒过的工作服和工作帽，接种前手先用体积分数75%的酒精消毒后再开始操作。接种针或 环必须在酒精灯上烧红3次，才能进行接种；用接种针和接种环，将菌种挑到斜面试管和平 板上划线接种，操作时接种物应在酒精灯的火焰边进行。接种完毕后立即用棉塞将试管封 口或立即盖上培养皿盖。③培养菌种接种后应放在培养架上或生物培养箱内培养，温度控制在25_29°C， 每天应摇动2-3次为宜。菌种要定期更换，(试管)斜面和平板三个月换一次；液体试管或 小三角瓶夏季保种20天左右，冬季一个月换一次培养基。II级种子培养(三角瓶液体培养)①无菌室消毒接种应在无菌室内的超净工作台上进行，接种前将无菌室内和超 净工作台内的紫外灯同时打开，灭菌lh。②接种试管、平板和三角瓶接种应在超净工作台内进行，操作人员必须穿戴消 毒过的工作服和工作帽，接种前手先用体积分数75%的酒精消毒后再开始操作。接种针或 环必须在酒精灯上烧红3次，才能进行接种。将试管斜面或在培养皿平板培养好的I级菌 种，用接种针和接种环，将菌种转接到三角瓶液体中。操作时接种物应在酒精灯的火焰边进 行，接种完毕后立即用棉塞将试管封口或立即盖上三角瓶。③培养II级菌种接种后应放在恒温摇床上振动培养，温度控制在25-29°C，如 没有恒温摇床可以培养架上或生物培养箱内培养，每天应摇动2-3次为宜。④II级菌种培养约5-7天后即可生长好，生长好的II级菌种可以进行III级种子 (母液扩大)培养。
III级种子(母液扩大培养)
①先用温水(40°C-6(TC)将牛肉膏、蛋白胨、氯化钠分别溶化，按照IOOOml井水加入 l_5g牛肉膏、8-12g蛋白胨、3-7g氯化钠的比例进行配置，在Im3的混合器中搅拌均勻，再 分装入25L的清洗干净的塑料壶中。②待上述培养基融化后，冷却到四_311，在再加入250— 350ml溶藻菌菌种。③然后把接种好的菌水塑料壶用棉塞或牛皮纸包扎，在壶口插上通气和出气管 各一支，在条件下通气发酵培养。④条件适宜时一般5天左右发酵完成，可以作为规模化生产的种子。I 一III级种子(减负复合菌剂)D I级种子培养
1)培养工具的消毒方法
1.加热消毒法利用高温杀死微生物的方法。(1)直接灼烧此法可直接把微生物烧死，灭菌彻底，但只适用于小型金属或玻璃 工具的消毒。(2)煮沸消毒一般煮沸5 10分钟，适用于小型容器、工具的消毒。(3)烘干箱消毒亦称为恒温干燥箱消毒法。2.化学药品消毒法适用在批量培养中，大型容器、工具、玻璃钢水槽和水泥池中。(1)酒精体积分数为75%的酒精常用于中、小型容器的消毒。用纱布蘸酒精在容 器、工具的表面涂抹，10-12分钟后，清水冲洗即可。(2)高锰酸钾按300ppm配成高锰酸钾溶液，把洗刷洁净的容器、工具放在溶液中 浸泡5-6分钟，取出，再用清水冲洗2次 3次即可。)培养方法
培育室及用具暗室一间。5L的塑料桶(最好用红色)、量筒、PH试纸。原料复合菌种、培养基。复合菌培养液配制比例复合菌种培养基水=10 1 :90。生产工艺流程
(1)将塑料桶、量筒等用具经灭菌消毒处理备用。(2)在每个桶中放入培养基，倒入无菌的35°温水(深井水)，搅拌直到融化，然后加入复合菌种搅拌1-5分钟，其中加入培养基、无菌水和复合菌种的重量比为1:90:10，最 后盖上桶盖、半密封；将桶置于暗室内让其在半密封状态下发酵。(3)室温保持在25—35°C，发酵进行到第2天时，将桶摇晃或用经消毒的塑料棒搅 拌2-5分钟。第三天时水面会出现泡沫，再搅拌2-5分钟促进有益微生物的生成；第8天 时，泡沫慢慢消失，水面浮起一片白色的悬浮物；到第10天时，发酵结束。(4)复合菌种在25— 35°C之间，8-10天即成；在15_25°C之间，13-15天即成， 15°C以下需17-19天才成，培育的复合菌符合以下规定方可使用①其颜色为棕或黄褐色； (有较浓的甜酸味或酸味；⑧用量筒取少量倒人矿泉水瓶中，拧紧瓶盖并摇晃几下，产生 大量泡沫；④测试PH值在3. 5以下
II级种子培养
取上述一级复合菌种一级种子活菌制剂10g、红糖IOOg (红糖先用温度控制在 90-100°C的热开水溶化)，加入IOOOg无菌的井水中。注(先把水加热到90-100° C后加 入红塘，而后继续加热5分钟。冷却到40° C时加入一级种子)，密闭发酵(35° C—37° C 温度)3-5天，打开容器口闻到有酸甜味即活化成功。可以作为液体III级菌种使用。III级种子(母液扩大培养)
①先用开水(温度控制在90-100°C)10L，加IOOOg的红糖，把红糖融化开，把红糖里面 的有害菌消除。然后分别加入0. 01-0. 03g硫酸镁和0. 01-0. 05g磷酸氢二钾。②待上述培养基融化后，冷却到^_31°C，在再加入IOOOg减负复合菌种。③然后把IOOOOg的菌水整体装进一个大塑料壶或者其他的容器中，要密封发 酵，不能漏气。不要装的太满，在发酵过程中会产生气体，装满容易涨破塑料壶。④发酵7-12天左右，如果温度低于15°C要多发酵几天，大概15天，打开瓶口，有 气体产生。闻到酸甜闻到就证明发酵成功。⑤发酵成功后的菌液如果一次不能大量的使用完，就用小瓶子分装密封保存。使 用一瓶打开一瓶。⑥菌种的储存减负复合菌要求常温避光条件下，25度左右保存最为适宜。底部 稍有沉淀或浮有些微白沫均属正常，若出现腐臭即已变质，勿用。发酵池大规模生产E、发酵池大规模生产F
1)培养基
①溶藻菌培养基
牛肉膏 1000-2000g 蛋白胨 4000-6000g 氯化钠 3000_7000g 水 1 m3 pH=7. 0-7. 8
②减负复合菌剂培养基
红糖 400000-600000g 磷酸氢二钾 1000_5000g 硫酸镁 1000-3000g 水 IOm3 pH=6. 8-7. 4
2)溶藻菌规模化发酵生产
先用40°C -60°C的温水将牛肉膏、蛋白胨分别溶化，加井水500L，然后加入 氯化钠，其中牛肉膏、蛋白胨和氯化钠以每方分别1000-2000g、4000-6000g、3000-7000g在 混合器中搅拌均勻，再放入10 m3的培养池中，加溶藻菌III级种子(母液)lm3，然后加井水至 IOm3,最后用塑料薄膜密封，28-32 V发酵培养。一般7天左右即可。
步骤1原料准备牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、干净的水(深井水)
步骤2 发酵池10m3 ；配制(消毒液跟整个容积比)5% “84”消毒液，喷洒在发酵池壁 和底部，24h后，用干净的深井水清洗发酵池。然后把发酵池灌入50-70%干净的深井水。步骤3 培养基配制①取0. 8-1 m3干净的深井水加热融化氯化钠；②取5L干 净的温水(40°C -60°C)水2份，分别溶化牛肉膏和蛋白胨；③溶化后营养液分别倒进步骤2 中的发酵池内。步骤4 接种溶藻菌种水按1 :10比例加入发酵池中，均勻搅拌菌液，同时用 干净的深井水加入到发酵池中IOm3刻度，然后用塑料薄膜密封发酵池。步骤5温度控制在观一321之间发酵7天左右。如果温度在23— 25°C之间，发 酵时间为12天。(这五步就是整个溶藻菌剂的生产过程)。)减负复合菌剂规模化发酵生产
先用开水(温度控制在90-10(TC)将红糖溶化，加井水500L，加入硫酸镁和磷酸氢二 钾，其中以每IOm3加入红糖500000g，硫酸镁1000_3000g和磷酸氢二钾1000_5000g的量， 在混合器中搅拌均勻在混合器中搅拌均勻，再放入IOm3的培养池中，加减负复合菌lm3’，再 加井水至10 m3刻度，其中减负复合菌主要菌种包括芽孢菌、酵母菌、乳酸菌等有益菌类。， 然后加井水至10m3，最后用塑料薄膜密封，28-32°C发酵培养。一般7天左右即可。步骤1 原料准备红糖400000-600000g，硫酸镁1000-3000g，磷酸氢二钾 1000-5000g,无菌干净的水(深井水)水IOm3
步骤2发酵池10-15 m3 ；配制5% (消毒液跟整个容积比)“84”消毒液，喷洒在发酵 池壁和底部，24h后，用干净的深井水清洗发酵池。然后把发酵池灌入50-70%干净的深井 水。步骤3 培养基配制①取0. 8-lm3干净的深井水加热融化400000-600000g红 糖，②取IOL干净的深井水2份，分别溶化硫酸镁1000-3000g，磷酸二氢钾1000-5000g ；③ 溶化后营养液分别倒进步骤2中的发酵池内。步骤4 接种减负复合菌菌种水按1 :10比例加入发酵池中，均勻搅拌菌液， 同时用干净的深井水加入到发酵池中IOm3刻度，然后用塑料薄膜密封发酵池。(说明如果 是15 m3的发酵池，营养液和菌种增加1. 5倍。)
步骤5温度控制在观一321之间发酵7天左右。如果温度在23—25°C之间，发酵时 间为12天。步骤6 5天后打开容器测试PH值，PH值在3.5 — 5范围内，即发酵成功，也可以 取些发酵原液口尝，酸香后即发酵成功。一般发酵时间为7天后效果更好。(这六步就是整 个减负复合菌剂的生产过程)
溶藻减负复合生物制剂G :
4)溶藻减负复合生物制剂配比与包装
1)将发酵生产好的溶藻菌和减负复合菌按照3 7的比例混合。然后进行收获与包装。2)产品用50L塑料桶包装。将采收泵排气阀打开，注入发酵好的溶菌减负复合生 物制剂产品到包装桶内，发酵液注到50L刻度时关闭阀门，立即将桶盖盖上拧紧。3)用抹布檫干包装桶上的发酵液，贴上带有产品说明书和生产日期的标签。4)抽样对产品按照企业标准进行检查，检查合格后贴上检验合格证。
富营养化湖泊应用或其他水体应用H 5)应用
溶藻减负复合生物制剂主要用于控制富营养化水体中，水华蓝藻的发生。1)细菌的喷洒成品按照一定浓度(1/10000)喷洒在蓝藻发生的湖泊、水库、河 道、池塘等富营养化水体中。2监控建立的监控条件和标准为是蓝藻水体的颜色的变化，叶绿素含量下降，蓝 藻优势度减少，水体富营养化程度降低、水体的透明度上升。用途说明本发明与现有的除藻技术相比，具有以下优点方法容易，操作简单， 无污染，安全性高。细菌溶解蓝藻是位于实际应用的前言。相比杀蓝藻的如硫酸铜等化学 物质具有明显的优点。使用细菌清除蓝藻不会带来第二次污染。在较大的水体中形成一种 新的生态平衡。
权利要求
1. 一种溶藻减负复合生物菌剂的制备方法，其步骤是A、I、II级菌种培养(1)培养基①溶藻菌培养基牛肉膏l-5g、 蛋白胨8-12g、氯化钠3-7g、水1000ml、琼脂1. 5-2. 5%、 pH=7. 0-7. 8 ；②减负复合菌剂培养基红糖 80-120g、磷酸氢二钾 0. 01-0. 05g、硫酸镁和 0. 01-0. 03g、水 1000ml、 pH=6. 8-7. 4 ；(2)I级种子培养①无菌室消毒接种应在无菌室内的超净工作台上进行，接种前将无菌室内和超净工 作台内的紫外灯同时打开，灭菌；②接种试管、平板和三角瓶接种应在超净工作台内进行；③培养菌种接种后应放在培养架上或生物培养箱内培养，温度控制在；(3)II级种子培养①无菌室消毒同I级种子培养中的第一步①；②接种试管、平板和三角瓶接种应在超净工作台内进行，操作人员必须穿戴消毒 过的工作服和工作帽，接种前手用体积分数75%的酒精消毒后再开始操作，接种针或环必 须在酒精灯上烧红3次，进行接种，将试管斜面或在培养皿平板培养好的I级菌种，用接种 针和接种环，将菌种转接到三角瓶液体中，操作时接种物在酒精灯的火焰边进行，接种完毕 后立即用棉塞将试管封口或立即盖上三角瓶；③培养a、溶藻菌II级菌种接种后应放在恒温摇床上振动培养，温度控制在 25-29°C，每天摇动2-3次；B、减负复合菌剂II级菌种接种后室温静置培养；④II级菌种培养5-7天后，进行III级种子培养；B、III级种子(1)、溶藻菌III级种子①培养基配制先用40-60°C的温水将牛肉膏、蛋白胨分别溶化，加井水，然后加入氯 化钠，其中按每升分别将牛肉膏、蛋白胨、氯化钠的比列在混合器中搅拌均勻，再分别装入 25L的清洗干净的塑料壶中；②接种待本步骤第一步①培养基融化后，冷却到^_31°C，再加入250-350mLII级溶 藻菌菌种，然后把接种好的菌水塑料壶用棉塞或牛皮纸包扎；③发酵在壶口插上通气和出气管各一支，在观_321条件下通气发酵培养，5-7天后 发酵完成，生产种子；(2),减负复合菌剂III级种子①培养基配制先烧开10000ml的水，温度在90-100°C，加IOOOg的红糖，把红糖融化 开，把红糖里面的有害菌消除，然后分别加入0. 01-0. 03g硫酸镁和0. 01-0. 05g磷酸氢二 钾；②接种待本步骤第一步①培养基融化后，冷却到^_31°C，然后接种IOOOgII级减负 复合菌剂菌种；③发酵后把IOOOOg的菌水整体装进容器中，密封发酵，6-8天后，打开瓶口，闻到酸 甜发酵成功；C、规模化生产方法(1)培养基①溶藻菌培养基牛肉膏1000-2000g 蛋白胨4000-6000g 氯化钠②减负复合菌剂培养基 红糖 400000-60000g、磷酸氢二钾 1000-5000g、(2)溶藻菌规模化发酵生产 先用40 60°C的温水，将牛肉膏、蛋白胨分别溶化，然后加入氯化钠，其中牛肉膏、蛋白胨和氯化钠以每方分别1000-2000g、4000-6000g、3000-7000g在混合器中搅拌均 勻，再放入I-IOm3的培养池中，加溶藻菌III级种子0. I-Im3,然后加井水至l_10m3，最后用塑 料薄膜密封，28-32°C发酵培养；(3)减负复合菌剂规模化发酵生产先用开水，温度控制在90-100°C，将红糖溶化，加井水500L，然后按每10 m3加入红糖， 硫酸镁和磷酸氢二钾的量，在混合器中搅拌均勻，再放入10-20m3的培养池中，加溶藻减 负复合菌l_2m3，然后加井水至10-20m3，最后用塑料薄膜密封，28-32°C发酵培养；(4)溶藻减负复合生物制剂配比与包装1)将发酵生产好的溶藻菌和减负复合菌按照3 7的比例混合；2)产品用50L-lm3塑料桶包装；3)抽样对产品按照企业标准进行检查，检查合格后贴上检验合格证。3000-7000g 水 Im3 pH=7. 5 ； 硫酸镁 1000-3000g 、水 IOm3 ；
全文摘要
本发明公开了一种溶藻减负复合生物菌剂的制备方法，其步骤A、Ⅰ、Ⅱ级菌种培养(1)培养基；(2)Ⅰ级种子培养；(3)Ⅱ级种子培养；B、Ⅲ级种子(1)、溶藻菌Ⅲ级种子(2)、减负复合菌剂Ⅲ级种子C、规模化生产方法(1)培养基(2)溶藻菌规模化发酵生产；(3)减负复合菌剂规模化发酵生产；(4)溶藻减负复合生物制剂配比与包装。方法易行，操作简便，降低了富营养化水体，控制了蓝藻水华爆发。该菌剂易于培养，成本低，适宜工厂化生产。本发明溶藻减负复合生物菌剂易于培养，成本低，适宜工厂化生产。对水体无污染。具有环境、社会效益。
文档编号C12N1/16GK102115725SQ20101058895
公开日2011年7月6日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者刘军, 刘彬彬, 刘浩, 唐智伟, 赵冰, 项娇 申请人:武汉昌宝环保工程有限公司