专利名称：一种以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法
技术领域：
本发明涉及污染土壌生物修复技术领域，具体的说是ー种以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法。
背景技术：
多环芳经(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是指ー类由 2 个或 2 个以上苯环以线状、角状或成簇形式构成的独特的持久性有机污染物。很多PAHs会在生物体内积累通过细胞毒性、遗传毒性和免疫毒性对生物体产生致癌、致崎、致突变作用，对自然界生物安全和人类健康构成巨大威胁.美国环保局在20世纪80年代已将16种不带分支的 PAHs列入优先污染物名单中，我国也把PAHs列入环境污染物的黑名单中。因此，对PAHs污染土壤进行修复是ー项十分迫切的任务。微生物降解多环芳烃具有环保高效廉价的特点，被公认为是去除环境中多环芳烃的重要途径之一，通过从土著微生物群落中筛选高效PAHs降解菌株并接种回原位污染土壤中，达到修复污染土壌的目的。其中，高效降解菌的筛选是进行有效生物修复的技术关键。传统PAHs降解功能菌的筛选往往带有一定的盲目性和随机性，工作量大，费时费力，且成本高。开发ー种快速，高效的筛选方法迫在眉睫，类似的研究方法也为其他功能微生物资源的开发提供借鉴。
发明内容
本发明目的在于提供ー种以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 ー种以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法
1)富集培养，采用逐步提高多环芳烃浓度的方法对以多环芳烃为底物的降解菌进行富
集培养；
2)分筛培养取步骤1)中富集培养液稀释IO1-IO7后，涂布于山梨醇固体培养基中，置于观_32で恒温培养箱中培养1-3周，挑取具有降解圈的单菌落分別点种于含多环芳烃的牛肉膏蛋白胨培养基中，置于观_32で恒温培养箱中培养1-2周；
3)成膜法快速筛选降解菌将步骤2、中生长的菌株点种于带有多环芳烃膜的无机盐固体培养基上，置于观-32で恒温培养箱中培养1-3周，能够生长的菌株即为能够以多环芳烃为唯一碳源的降解菌株。所述步骤1)富集培养将菌样接种于含多环芳烃的液体无机盐培养基中进行转接培养，每次转接培养条件为置于28-32°C恒温摇床上180r · mirT1培养30天，共转接 4-5次，转接量按体积百分比计每次培养液10%接种于含多环芳烃逐渐增加的50ml液体无机盐培养基中，待用；其中含多环芳烃的液体无机盐培养基中多环芳烃首次加入量100 mg ·じ1，而后以每次增加100 mg ·じ1的速度逐渐增加。
所述多环芳烃是首先溶于丙酮的，按质量体积比(g.mr1)为1:1000将多环芳烃溶于丙酮中，制成1000 rng ·じ1的母液。所述含多环芳烃的牛肉膏蛋白胨培养基中的多环芳烃是溶于ニ甲基亚砜的，按质量体积比(g.mr1)为1:500将多环芳烃溶于ニ甲基亚砜中，制成2000啤·じ1的母液。所述山梨醇固体培养基为每升山梨醇无机盐培养基中加入Iml维生素母液。所述山梨醇无机盐培养基为每升液体无机盐培养基中加入9g山梨醇，0. 5g酵母粉和按培养基总重的2%的琼脂条；所述维生素母液配方为对氨基苯甲酸200mg，生物素200mg，叶酸200mg，畑酸200mg，泛酸钙lOOmg，维生素B6 lOOmg，核黄素lOOmg，硫胺素lOOmg，维生素B12 lmg，用无菌水定容至1000ml，用0.4Mm滤膜过滤除菌。所述液体无机盐培养基为=NaNO30. 5 g，(NH4)2SO4 l.Og , Na2HPO4 2. 5g, KH2PO4 1. Og，微量元素溶液1ml，钙镁溶液Iml用蒸馏水定容至IOOOml ；其中，微量元素溶液配方为412(504)3.18!120 108 mg, CoSO4 · 7H20 56 mg, CuSO4 · 5H20 56 mg, FeSO4 ·7Η20 3. Og , H3BO3 61 lmg，KBr 28 mg，KI 56 mg, LiCl 28mg, MnCl2 ·4Η20 389mg, Na2MoO4 · 2Η20 28mg, Na2WO4 · 2Η20 28mg, NiCl2 · 6Η20 58mg, SnCl2 · 2Η20 28mg, ZnSO4 · H2O 3%ig，用蒸馏水定容至1000ml ；钙镁溶液配方为CaCl2 30g, MgCl2 20g，用蒸馏水定容至1000ml。所述多环芳烃膜为将配置的多环芳烃丙酮溶液置于通风处使丙酮挥发，即成多环芳烃膜。所述多环芳烃丙酮溶液按质量体积比(g.mr1)为1:100将多环芳烃溶于丙酮中，制成10000 mg ·じ1的母液。所述取多环芳烃丙酮溶液置于通风处使丙酮挥发净，待成膜整体放到沙浴中加热至相应多环芳烃的熔点以上，在平板上方放上冰袋，使多环芳烃升华后遇平板冷却而附着在牛肉膏蛋白胨固体培养基上。本发明的有益效果如下
1、本发明提供一种改进的成膜法，在固体培养基上形成ー层肉眼可见的多环芳烃膜， 可使以多环芳烃为底物的降解菌可使降解圈清晰易辨，能够快速从土壤中分离出具有降解 PAHs功能的菌株。本发明针对传统降解菌株筛选的盲目性，随机性且工作量大，费时费力， 浪费资源等缺点，开发的升华成膜法，为在实验室中快速筛选出以多环芳烃为底物的降解菌，开发新的生物修复微生物资源提供了ー种快速便捷的手段。2、本发明的筛选方法步骤在通风橱中使丙酮挥发干净，可防止工作人员吸入。两个平皿对扣，并用封ロ膜密封，可避免PAHs加热时挥发出来，从而降低对实验操作人员的身体危害。3、本发明筛选时采用平皿，而非500ml的烧杯，不仅便于密封，而且可以有效的缩短PAHs的上升距离，节省时间的同吋，减少PAHs的浪费。4、本发明实验室实验表明，采用本发明提供的成膜法，能够快速大量的从石油污染土壤中分离降解菲和芘的菌株，从而进一步采用液体摇瓶方法复筛。
图1为本发明实施例提供的初筛降解菌在芘膜上形成的降解圏。图2为本发明实施例提供的复筛降解菌在芘膜上形成的降解圏。图3为本发明实施例提供的降解菌在芴，菲和荧蒽膜上形成的降解圏。
具体实施例方式实施例1
1)采集沈抚灌区表层0-20 cm土壌作为样品，4°C冰箱保存。称取供试土壤样品5g，接入45ml含四环多环芳烃芘的液体无机盐培养基中，其中芘浓度为100啤·じ1，加入适量玻璃珠，置于观-32で恒温摇床上180 r · HiirT1富集培养1个月，富集培养后，移取第一次培养液按10%的体积比例接入45ml含芘的液体无机盐培养基中，进行第二次富集培养，共重复4次，每转接一次，芘的浓度提高100 mg ·じ1，即最后一次芘的浓度提高至400 mg ·じ1。2)将上述富集培养液在无菌条件下用无菌水进行10倍系列梯度稀释至10_7，分別取10_5，10_6和10_7三个浓度的菌液 οομ 涂布在山梨醇固体培养基上，置于观_32で恒温培养1-3周，挑取具有不同形态的有降解圈的单菌落各若干株，分別点种于含10 mg ·じ1的芘的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，并对菌落进行顺序编号。置于观_32で恒温培养1-2周。含芘的液体无机盐培养基的配制取浓度为1000 mg じ1用丙酮配制的芘母液，用 0. 22ΜΠ1滤膜除菌过滤，量取5-20ml芘丙酮母液，加入已灭菌的250ml三角瓶中，待丙酮挥发完毕，加入50ml灭菌的液体无机盐培养基，使芘的终浓度为100-400 mg ·じ1。另外，含芘的牛肉膏蛋白胨固体培养基的配制在牛肉膏蛋白胨固体培养基中加入2000 mg ·じ1的芘的ニ甲基亚砜母液，终浓度为10 mg ·じ1。其中，液体无机盐培养基配方为NaNO3 0. 5 g， (NH4)2SO4 l.Og , Na2HPO4 2. 5g, KH2PO4 l.Og，微量元素溶液lml，钙镁溶液Iml用蒸馏水定容至1000ml;其中， 微量元素溶液配方为Al2 (SO4) 3 · 18H20 108 mg, CoSO4 · 7H20 56 mg, CuSO4 · 5H20 56 mg, FeSO4 · 7H20 3. Og , H3BO3 611mg，KBr 28 mg，KI 56 mg, LiCl 28mg, MnCl2 · 4H20 389mg, Na2MoO4 · 2H20 28mg, Na2WO4 · 2H20 28mg, NiCl2 · 6H20 58mg, SnCl2 · 2H20 28mg, ZnSO4 · H2O 3%ig，用蒸馏水定容至1000ml。钙镁溶液配方为CaCl2 30g，MgCl2 20g，用蒸馏水定容至1000ml。牛肉膏蛋白胨固体培养基配方为牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂条20g，用蒸馏水定容至1000ml, pH 7. 2 7. 4。山梨醇固体培养基为每升山梨醇无机盐培养基中加入Iml维生素母液。山梨醇无机盐培养基为每升液体无机盐培养基中加入9g山梨醇，0.5g酵母粉和培养基总重的重量百分比2%的琼脂条；所述维生素母液配方为对氨基苯甲酸200mg，生物素200mg，叶酸200mg，烟酸200mg，泛酸钙lOOmg，维生素B6 lOOmg，核黄素IOOmgjIi 胺素lOOmg，维生素B12 lmg，用无菌水定容至1000ml，用0. 4Mm滤膜过滤除菌。3)用无菌牙签将步骤2)中培养好的菌株点种于有芘膜的牛肉膏蛋白胨培养基的平板上，置于观_32て恒温培养1-3周，菌落周围出现降解圈则表明底物被降解，该菌即为能够以芘为唯一碳源的降解菌株。芘膜的制备
1)按质量体积比(g.mr1)为1:100将芘溶于丙酮中，制成10000啤·じ1的母液。2)吸取10000啤 じ1的芘的丙酮母液2ml于ー平皿中，在通风橱中使丙酮挥发净， 在平皿底部形成均勻的ー层膜，然后把接种后的平板倒扣到底部平铺有固体芘的平皿上， 并用封ロ膜将接ロ处封闭，整体放到沙浴中加热，在平板上方放上冰袋，使芘升华后遇平板冷却而附着在固体培养基上。4)根据降解率进行复筛选取3)中降解圈较大的部分菌株，接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，培养至OD6tltl=O. 6-0. 8，用磷酸盐缓冲液洗浄，按10%接种量接入含芘100 mg ·じ1-400 mg ·じ1的液体无机盐培养基中，置于沘_32で恒温摇床上180r · mirT1培养10 天。提取培养基中剰余芘组分，采用HPLC方法測定降解率。实施例2
1)采集沈抚灌区表层0-20 cm土壌作为样品，4°C冰箱保存。称取供试土壤样品5g，接入45ml含三环的多环芳烃菲(苊，芴，蒽，荧蒽等方法同)的液体无机盐培养基中，其中菲浓度为200 mg ·じ1，加入适量玻璃珠，置于沘-32で恒温摇床上180r .mirT1富集培养1个月， 富集培养后，移取第一次培养液按10%的体积比例接入45ml含菲的液体无机盐培养基中， 进行第二次富集培养，共重复4次，每转接一次，菲的浓度提高100 mg じ1，即最后一次菲的浓度提高至500 mg ·じ1。2)将上述富集培养液在无菌条件下用无菌水进行10倍系列梯度稀释至10_7，分別取10_5，10_6和10_7三个浓度的菌液 οομ 涂布在山梨醇固体培养基上，置于观_32で恒温培养1-3周，挑取具有不同形态的有降解圈的单菌落各若干株，分別点种于含10 mg ·じ1的菲的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，并对菌落进行顺序编号。置于观_32で恒温培养1-2周。含菲的液体无机盐培养基的配制取浓度为1000 mg じ1用丙酮配制的菲母液，用 0. 22ΜΠ1滤膜除菌过滤，量取5-20ml母液，加入已灭菌的250ml三角瓶中，待丙酮挥发完毕， 加入50ml灭菌的液体无机盐培养基，使终浓度为200-500 mg ·じ1。另外，含菲的牛肉膏蛋白胨固体培养基的配制在牛肉膏蛋白胨固体培养基中加入2000 mg ·じ1的ニ甲基亚砜菲的母液，终浓度为10 mg ·じ1。其中，液体无机盐培养基配方为NaNO3 0. 5 g， (NH4)2SO4 l.Og , Na2HPO4 2. 5g, KH2PO4 l.Og，微量元素溶液lml，钙镁溶液Iml用蒸馏水定容至1000ml;其中， 微量元素溶液配方为Al2 (SO4) 3 · 18H20 108 mg, CoSO4 · 7H20 56 mg, CuSO4 · 5H20 56 mg, FeSO4 · 7H20 3. Og , H3BO3 611mg，KBr 28 mg，KI 56 mg, LiCl 28mg, MnCl2 · 4H20 389mg, Na2MoO4 · 2H20 28mg, Na2WO4 · 2H20 28mg, NiCl2 · 6H20 58mg, SnCl2 · 2H20 28mg, ZnSO4 · H2O 3%ig，用蒸馏水定容至1000ml。钙镁溶液配方为CaCl2 30g，MgCl2 20g，用蒸馏水定容至1000ml。牛肉膏蛋白胨固体培养基配方为牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂条20g，用蒸馏水定容至1000ml, pH 7. 2-7. 4。山梨醇固体培养基为每升山梨醇无机盐培养基中加入Iml维生素母液。山梨醇无机盐培养基为每升液体无机盐培养基中加入9g山梨醇，0. 5g酵母粉和培养基总重的重量百分比2%的琼脂条；所述维生素母液配方为对氨基苯甲酸200mg，生物素200mg，叶酸200mg，烟酸200mg，泛酸钙lOOmg，维生素B6 lOOmg，核黄素IOOmgjIi 胺素lOOmg，维生素B12 lmg，用无菌水定容至1000ml，用0. 4μπι滤膜过滤除菌。3)用无菌牙签将步骤2)中培养好的菌株点种于有菲膜的牛肉膏蛋白胨培养基的平板上，置于观_32て恒温培养1-3周，菌落周围出现降解圈则表明底物被降解，该菌即为能够以菲为唯一碳源的降解菌株。菲膜的制备1)按质量体积比(g.ml-1)为1:100将菲溶于丙酮中，制成10000啤·じ1的母液。2)吸取10000 mg ·じ1的菲丙酮溶液2ml于ー平皿中，在通风橱中使丙酮挥发净， 在平皿底部形成均勻的ー层膜，然后把接种后的平板倒扣到底部平铺有固体菲的平皿上， 并用封ロ膜将接ロ处封闭，整体放到沙浴中加热，在平板上方放上冰袋，使多环芳烃升华后遇平板冷却而附着在固体培养基上。4)根据降解率进行复筛选取3)中降解圈较大的部分菌株，接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，培养至0D_=0. 6-0.8，用磷酸盐缓冲液洗浄，按10%接种量接入含菲100 mg ·じ1-400 mg ·じ1的液体无机盐培养基中，置于沘_32で恒温摇床上180r · mirT1培养10 天。提取培养基中剰余PAHs组分，采用HPLC方法測定降解率。
应用例1
采集沈抚灌区的表层土壤作为供试土样，以四环PAHs芘为模式化合物，从该土壤中筛选芘的降解菌。1)采集沈抚灌区表层0-20 cm土壌作为样品，4°C冰箱保存。称取供试土壤样品5g， 接入45ml含四环PAHs芘的液体无机盐培养基中，其中四环PAHs芘浓度为100 mg ·じ1，加入适量玻璃珠，置于观_32で恒温摇床上lSOi^mirT1富集培养1个月，富集培养后，移取第一次培养液按10%的体积比例接入45ml四环PAHs芘的液体无机盐培养基中，进行第二次富集培养，共重复4次，每转接一次，四环PAHs芘的浓度提高100 mg ·じ1，即最后一次四环 PAHs芘的浓度提高至400 mg ·じ1。2)将上述富集培养液在无菌条件下用无菌水进行10倍系列梯度稀释至10_7，分別取0_5，10_6和10_7三个浓度的菌液ΙΟΟμΙ涂布在山梨醇固体培养基上，置于观_32で恒温培养1-3周，挑取具有不同形态的有降解圈的单菌落各若干株，分別点种于含四环PAHs芘10 mg じ1的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，并对菌落进行顺序编号。置于观_32で恒温培养1-2 周。四环PAHs芘的液体无机盐培养基的配制取浓度为1000 mg じ1用丙酮配制的四环PAHs芘母液，用0. 22Mm滤膜除菌过滤，量取5-20mlPAHs丙酮母液，加入已灭菌的250ml 三角瓶中，待丙酮挥发完毕，加入50ml灭菌的液体无机盐培养基，使四环PAHs芘的终浓度为 100-400 mg ·じ1。另外，含四环PAHs芘的牛肉膏蛋白胨固体培养基的配制在牛肉膏蛋白胨固体培养基中加入2000 mg ·じ1的ニ甲基亚砜芘母液，终浓度为10 mg ·じ1。3)用无菌牙签将步骤2)中培养好的菌株点种于有四环PAHs芘膜的牛肉膏蛋白胨培养基的平板上，置于恒温培养1-3周，菌落周围出现降解圈则表明底物被降解， 该菌即为能够以四环PAHs芘为唯一碳源的降解菌株(參见图1)。四环PAHs芘膜的制备
1)按质量体积比(g^r1)为1:100将四环PAHs芘溶于丙酮中，制成10000啤·じ1的母液。2)吸取10000 mg ·じ1的四环PAHs芘丙酮溶液2ml于ー平皿中，在通风橱中使丙酮挥发净，在平皿底部形成均勻的ー层膜，然后把接种后的平板倒扣到底部平铺有固体多环芳烃的平皿上，并用封ロ膜将接ロ处封闭，整体放到沙浴中加热，在平板上方放上冰袋，使多环芳烃升华后遇平板冷却而附着在固体培养基上。4)根据降解率进行复筛选取3)中降解圈较大的部分菌株，接种于NR液体培养基，培养至0D_=0. 6-0. 8，用磷酸盐缓冲液洗浄，按10%接种量接入含四环PAHs芘100-400 mg ·じ1的液体无机盐培养基中，置于观_32で恒温摇床上180r · mirT1培养10天。提取培养基中剰余四环PAHs芘组分，采用HPLC方法測定降解率。选取其中1株降解圈最大的菌株经液体摇瓶实验测定芘降解率，底物浓度为100啤 じ1，培养时间为7天，降解率为94. 4%。通过该方法筛选得到30多株以四环PAHs芘为唯一碳源的降解菌株，提取菌株的 DNA，扩增其 16S rDNA 序列。扩增所用的前引物 27F (5，-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG -3，)， 和后引物1492R (5，-TA CGGHTACCTTGTTACGAC TT- 3，)分别来源于大肠杆菌16S rDNA的 8-27和1492 -1513基因片段。扩增反应程序如下在96°C预变性10分钟，95°C变性1分钟，55°C退火1分钟，72°C延伸1. 5分钟，35个循环，最后72°C延伸10分钟。反应产物用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，经切胶纯化送华大基因公司测序。测得的序列登陆GeneBank进行blast分析，有分枝杆菌，戈登氏菌，假单胞菌，红球菌等。应用例2
采集沈抚灌区的表层土壤作为供试土样，从该土壤中得到的菌中筛选芘的降解菌，采用改进的成膜法。以四环PAHs芘为底物，把各个菌株分別点接到山梨醇固体培养基上，制作芘膜，出现降解圈的菌株即可确认为芘的降解菌(见图2)。应用例3
采集沈抚灌区的表层土壤作为供试土样，从该土壤中得到的菌中筛选芴，菲和荧蒽多环芳烃的降解菌，采用改进的成膜法。以这三种多环芳烃分别为底物，把各个菌株分別点接到山梨醇固体培养基上，制作成膜，出现降解圈的菌株即可确认为降解菌(见图3)。
权利要求
1.ー种以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于1)富集培养，采用逐步提高多环芳烃浓度的方法对以多环芳烃为底物的降解菌进行富集培养；2)分筛培养取步骤1)中富集培养液稀释IO1-IO7后，涂布于山梨醇固体培养基中，置于观_32で恒温培养箱中培养1-3周，挑取具有降解圈的单菌落分別点种于含多环芳烃的牛肉膏蛋白胨培养基中，置于观_32で恒温培养箱中培养1-2周；3)成膜法快速筛选降解菌将步骤2、中生长的菌株点种于带有多环芳烃膜的无机盐固体培养基上，置于观-32で恒温培养箱中培养1-3周，能够生长的菌株即为能够以多环芳烃为唯一碳源的降解菌株。
2.2.按权利要求1所述的以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于所述步骤1)富集培养将菌样接种于含多环芳烃的液体无机盐培养基中进行转接培养，每次转接培养条件为置于观_32で恒温摇床上180r .min-1培养30天，共转接4_5次，转接量按体积百分比计每次培养液10%接种于含多环芳烃逐渐增加的50ml液体无机盐培养基中， 待用；其中含多环芳烃的液体无机盐培养基中多环芳烃首次加入量100啤 じ1，而后以毎次増加100 mg ·じ1的速度逐渐增加。
3.3.按权利要求1或2所述的以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于 所述多环芳烃是首先溶于丙酮的，按质量体积比(g^mr1)为1:1000将多环芳烃溶于丙酮中，制成IOOOmg ·じ1的母液。
4.按权利要求1所述的以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于所述含多环芳烃的牛肉膏蛋白胨培养基中的多环芳烃是溶于ニ甲基亚砜的，按质量体积比 (g · ml—1)为1:500将多环芳烃溶于ニ甲基亚砜中，制成2000 mg ·じ1的母液。
5.按权利要求1所述的以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于所述山梨醇固体培养基为每升山梨醇无机盐培养基中加入Iml维生素母液。
6.按权利要求5所述的以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于所述山梨醇无机盐培养基为每升液体无机盐培养基中加入9g山梨醇，0. 5g酵母粉和按培养基总重的2%的琼脂条；所述维生素母液配方为对氨基苯甲酸200mg，生物素200mg，叶酸 200mg，畑酸200mg，泛酸钙lOOmg，维生素B6 lOOmg，核黄素lOOmg，硫胺素lOOmg，维生素 B12 lmg，用无菌水定容至1000ml，用0. 4Mm滤膜过滤除菌。
7.按权利要求2或6所述的以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在干 所述液体无机盐培养基为=NaNO3 0. 5 g，(NH4)2SO4 l.Og , Na2HPO4 2. 5g, KH2PO4 1. Og，微量元素溶液1ml，钙镁溶液Iml用蒸馏水定容至1000ml ；其中，微量元素溶液配方 、A12(S04)3*18H20 108 mg, CoSO4 ·7Η20 56 mg, CuSO4 ·5Η20 56 mg, FeSO4 ·7Η20 3. Og，H3BO3 6Ilmg，KBr 28 mg，KI 56 mg, LiCl 28mg, MnCl2 · 4H20 389mg, Na2MoO4 · 2H20 28mg, Na2WO4 · 2H20 28mg, NiCl2 · 6H20 58mg, SnCl2 · 2H20 28mg, ZnSO4 -H2O 3%ig，用蒸馏水定容至1000ml ；钙镁溶液配方为CaCl2 30g, MgCl2 20g，用蒸馏水定容至1000ml。
8.按权利要求1所述以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于所述多环芳烃膜为将配置的多环芳烃丙酮溶液置于通风处使丙酮挥发，即成多环芳烃膜。
9.按权利要求8所述以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于所述多环芳烃丙酮溶液按质量体积比(g^r1)为1:100将多环芳烃溶于丙酮中，制成IOOOOmg じ1 的母液。
10.按权利要求8或9所述以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于所述取多环芳烃丙酮溶液置于通风处使丙酮挥发净，待成膜整体放到沙浴中加热至相应多环芳烃的熔点以上，在平板上方放上冰袋，使多环芳烃升华后遇平板冷却而附着在牛肉膏蛋白胨固体培养基上。
全文摘要
本发明涉及污染土壤生物修复技术领域，具体的说是一种以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法。采用逐步提高多环芳烃浓度的方法对以多环芳烃为底物的降解菌进行富集培养；取富集培养液稀释101-107后，取其中适宜浓度涂布于山梨醇固体培养基上，加芘膜后，置于28-32℃恒温培养箱中培养1-3周，挑取具有降解圈的单菌落分别点种于含多环芳烃的牛肉膏蛋白胨培养基中，置于28-32℃恒温培养箱中培养1-2周；将生长的菌株点种于带有多环芳烃膜的无机盐固体培养基上，置于28-32℃恒温培养箱中培养1-3周，能够生长的菌株即为能够以多环芳烃为唯一碳源的降解菌株。本发明为在实验室中快速筛选多环芳烃降解菌，开发新的生物修复微生物资源提供了一种快速便捷的手段。
文档编号C12N1/26GK102533928SQ20101058893
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者张惠文, 李新宇, 王秀娟, 胡凤钗, 苏振成 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所