专利名称：一种以敌敌畏为底物的降解菌株的筛选方法
技术领域：
本发明涉及生物降解农药残留技术领域，具体地说是 一种以敌敌 畏为底物的降解菌株的筛选方法。
背景技术：
敌敌畏，又名DDVP，有机磷杀虫剂的一种，化学名称2,2-二氯乙 烯基二甲基磷酸酯(2， 2-Dichlorovinyl dimethyl phosphate ).分子 式C4H7C1AP,分子量为分子量220.98,化学结构式为
敌敌畏是广谱性杀虫、杀螨剂，具有高效、低毒、广谱、用量少、 价格低廉等优点，是目前广泛用于蔬菜、果树和多种农田作物的主要杀 虫剂之一。敌敌畏在水溶液中缓慢分解，遇碱分解加快，对热稳定， 对铁有腐蚀性。对人畜中毒，对鱼类毒性较高，对蜜蜂剧毒。敌敌畏 不易被土壤颗粒吸附。因此，可能污染地下水，由于其对环境和食品 安全造成的危害，解决敌敌畏残留的降解问题已成为当前农残降解领 域研究的热点之一。
目前，国内外主要釆取一系列化学方法降解残留敌敌畏，沸石负 载Ti02光催化法等，但是化学处理方法价格高，且易造成二次污染。 由于生物处理法具有条件简便、处理彻底，以及不会造成二次污染等 特点而备受欢迎。因此，研制敌敌畏生物降解菌剂具有十分重要的意 义。
发明内容
本发明的目的是提供 一 种快速、高效的以敌敌畏为底物的降解菌 株的筛选方法。
为实现上述目的，本发明釆用的技术方案如下
1) 将2-4g菌样接种于含敌敌畏的100-150 mL富集培养基中进行 转接培养，每次转接培养条件为30-35°C、 150-200r/min摇床培养5-7 天，共转接4-5次，转接量按体积百分比计每次培养液8-10%接种于含 敌敌畏遂渐增加的100-150ml富集培养基中，待用；其中敌敌畏首次加 入量100-150mg/L,而后以100-150mg/L逐渐增加；
2) 分离筛选取步骤l)中培养的菌液驯化液，稀释104-1 05后， 涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板上，30-35。C恒温倒置培养3-4天；3)降解菌复筛将步骤2)中生长的菌株在含敌敌畏为惟一碳源的 选择性无机盐培养基固体平板上划线分离，30-35'C培养4-5天，能够 生长的菌株即为能够以敌敌畏为唯一碳源的降解菌株。
所述富集培养基的组成为MgS04'7H20 0.20-0.25g, (NH4) 2S04 0.50—0. 6g， KH2P04 0. 50-0.6g， NaCl 1. O-l. 2g, K2HP04 1.50-1.6 g, 敌敌畏分别为100-500mg,加蒸馏水至1000ml,调pH至7. 0-7. 5;所 述牛肉膏蛋白胨培养基的组成为牛肉膏5. 0-6. Og，蛋白胨 10. O-ll. Og, NaCl 10. 0-11. Og,琼脂15. 0-20. Og,加蒸馏水至1000ml, pH=7. 0-7. 5;所述选择性培养基的配方为MgS04'7H20 0. 20-0.25g, (NH4)2S04 0.50-0. 6g， KH2P04 0. 50-0. 6g , NaCl 1. 0-1. 2g , K2HP04 1.50-1.6 g,敌敌畏为300-350mg,琼脂15. 0-20. Og,加蒸馏水至 1000ml,调pH至7. 0-7, 5。
将得到以敌敌畏为唯一碳源的降解菌液，5000-6000r/min离心 8-IO分钟，取上层清液，加入8-10mL丙酮振荡，再加入4-5g氯化钠 振荡1 -2min，而后室温下静置待水相与丙酮相分层后移出上层丙酮， 再将上层丙酮相常温常压下过无水硫酸钠柱，收集流出的丙酮进行气 相色谱测定。所述气相色谱条件为NPD检测器；DB-1701P色谱柱(30 m x 0. 32 mm x 0. 25 y m);氧气流量60mL/min，氢气流量2. 3 mL/min,氮 气流量1.2ml/min，检测器温度30(TC,进样口温度29(TC，色谱柱程 序升温温度60。C保持lmin， 3(TC/min上升至130°C， 5。C/min上升至 170°C,进样量1. OjiL。
本发明所具有的优点
1. 本发明釆用的筛选方法简单易行、经济廉价，所得菌株可以用 来制备敌敌畏的降解菌剂，在实践中有很好的应用潜力。
2. 本发明利用长期受敌敌畏污染的田间土壤为处理对象，所得的 降解菌是田间土壤中的土著菌，制成菌剂后田间应用不易被排斥，效 果会更好。
3. 本i明提供的以敌敌畏为底物的降解菌株的筛选方法可以用于 其它有机磷类杀虫剂降解菌株的筛选，在农药残留降解菌株的筛选方 面提供了一定的理论指导。
图l为甲基杆菌降解敌敌畏曲线图。
具体实施方式
实施例1 敌敌畏降解菌株的筛选
1) 菌样品釆集釆自沈阳巿苏家屯农药厂附近长期被敌敌畏农药 污染的土样。
2) 降解菌的富集驯化将2g菌样接种于含敌敌畏的100ml富集培养基中充分混匀进行转接培养，每次转接培养条件为3(TC、 180r/min摇床培养7天，共转接4次，转接量按体积百分比计每次培养 液10%接种于含敌敌畏逐渐增加的100ml富集培养基中待用；其中敌敌 畏每次以100mg/L逐渐增加，4次转接过程中敌敌畏分别为100, 200， 300， 400mg/L。
所述步骤1)中的富集培养基的组成为MgS04 '7H20 0.20g, (NH4)2S04 0.50g， KH2P04 0. 50g, NaCl 1. Og, K2HP04 1. 50g,敌敌畏分 别为100mg，加蒸馏水至1000ml，调pH至7. O-. 5。
2)分离筛选取步骤1)中培养的菌液驯化液稀释104倍后，涂布 于牛肉膏蛋白胨固体平板上，3(TC恒温倒置培养3-4天；所述步骤2 ) 中的牛肉膏蛋白胨培养基的组成为牛肉膏5. Og,蛋白胨10. Og， NaCl 10g,琼脂15.0g，水1000ml， pH=7.0-7. 5。
3 )降解菌复筛将步骤2)中生长的菌株在含敌敌畏为惟一碳源的 选择性无机盐培养基固体平板上划线分离，3(TC培养4-5天，能够生 长的菌落即为得到以敌敌畏为底物的4株降解菌。所述步骤3 )中的选 择性培养基的配方为MgS04 '7H20 0. 20 g， (,) 2S04 0. 50 g, KH2P04 0. 50 g， NaCl 1. Og， K2HP04 1. 50 g，敌敌畏为300mg，琼脂15. 0 ~ 20. Og, 加蒸馏水至1000ml,调pH至7.0-7.5。为防止产生沉淀，含磷的成分 与其它成分，分别12rC, 30min，高压蒸汽灭菌后再混合，敌敌畏浓度 可根据实验步骤相应调整。
实施例2
降解菌株降解活性的测定
1) 样品的预处理取4mL待测溶液，5000r/min离心8分钟，取上 层清液，加入8 mL丙酮，剧烈振荡；再加入4g饱和氯化钠剧烈振荡1 min, 室温下静置5min，使水相与丙酮相分层，移出上层丙酮，将上层丙酮常 温常压下过无水硫酸钠柱收集流出的丙酮进行气相色谱测定。
2) 降解率的测定将上述收集的丙酮进行气相色谱测定，气相色 谱条件为NPD检测器；DB-1701P色谱柱(30 m x 0. 32 mm x 0. 25um); 氧气流量60mL/min，氢气流量2. 3 mL/min，氮气流量1. 2ml/min，检 测器温度30(TC,进样口温度29(TC，色谱柱程序升温温度6(TC保持 lmin， 30。C/min上升至130。C, 5'C/min上升至17(TC，进样量1. OjuL。
进行色谱条件测定。
通过该方法筛i得到4株以敌敌畏为唯一碳源的降解菌株，经其 16SrDNA测序和生理生化实验初步鉴定为氧化微杆菌、球形节杆菌、巨
大芽孢杆菌、及嗜中温甲基杆菌。
将上述4株菌株在敌敌畏初始浓度为100mg/L的选择性培养基中， 接种量10%,温度3(TC , 180r/min摇床培养条件下培养5天，其中嗜 中温甲基杆菌菌株对敌敌畏的降解率达到74.9% (参见图1)。实施例3
与实施例1不同之处在于
1) 降解菌的富集驯化将3g菌样接种于含敌敌畏的120mL富集 培养基中进行转接培养，每次转接培养条件为32°C、 200r/min摇床培 养5天，共转接5次，转接量按体积百分比计每次培养液8%接种于含敌 敌畏逐渐增加的120ml富集培养基中待用；其中敌敌畏首次加入量 150mg/L，而后以150mg/L逐渐增加，5次转接过程中敌敌畏分别为150, 300， 450, 600，750mg/L。
2) 分离筛选取步骤l)中培养的菌液驯化液，稀释105后，涂布 于牛肉膏蛋白胨固体平板上，32'C恒温倒置培养3-4天；
3) 降解菌复筛将步骤2)中生长的菌株在含敌敌畏为惟一碳源的 选择性无机盐培养基固体平板上划线分离，32'C培养4-5天，能够生 长的菌株即为能够以敌敌畏为唯一碳源的降解菌株。
所述富集培养基的组成为MgS04'7H20 0. 25g， (NH4) 2S04 0.6g, KH2P04 0. 6g,NaCl 1. 2g, K2HP04 1.6 g，敌敌畏分别为500mg,加蒸馏水至 1000ml，调pH至7. 5;所述牛肉膏蛋白胨培养基的组成为牛肉膏6. Og, 蛋白胨ll.Og,NaCl ll.Og，琼脂20. Og，加蒸馏水至1000ml， pH=7. 5; 所述选择性培养基的配方为MgS(V7H20 0.25g， (NH4) 2S04 0. 6g, KH2P04 0. 6g，NaCl 1.2g,K2HP04 1.6 g，敌敌畏为350mg，琼脂20. Og，加蒸馏水 至1000ml，调pH至7. 5。
将得到以敌敌畏为唯一碳源的降解菌液，6000r/min离心IO分钟， 取上层清液，加入10mL丙酮振荡，再加入5g氯化钠振荡2min,而后 室温下静置待水相与丙酮相分层后移出上层丙酮，再将上层丙酮相常 温常压下过无水硫酸钠柱，收集流出的丙酮进行气相色谱测定。 实施例4
与实施例l不同之处在于
1) 降解菌的富集驯化将3g菌样接种于含敌敌畏的150mL富集 培养基中进行转接培养，每次转接培养条件为35°C、 150r/min摇床培 养6天，共转接4次，转接量按体积百分比计每次培养液9%接种于含敌 敌畏逐渐增加的120ml富集培养基中，待用；其中敌敌畏首次加入量 120mg/L，而后以120mg/l逐渐增加；4次转接过程中敌敌畏分别为 120， 240， 360, 480mg/L。
2) 分离筛选取步骤l)中培养的菌液驯化液，稀释105后，涂布 于牛肉膏蛋白胨固体平板上，35。C恒温倒置培养3-4天；
3 )降解菌复筛将步骤2)中生长的菌株在含敌敌畏为惟一碳源的 选择性无机盐培养基固体平板上划线分离，35。C培养4-5天，能够生长
的菌株即为能够以敌敌畏为唯 一碳源的降解菌株。
所述富集培养基的组成为MgS04*7H20 0. 23g， (NH4) 2S04 0. 55g,KH2P04 0.55g，NaCl 1. lg， K2HP04 1.55 g，敌敌畏分别为400mg，加蒸馏 水至1000ml，调pH至7. 2;所述牛肉膏蛋白胨培养基的组成为牛肉膏 5. 5g，蛋白胨10. 5g，NaCl 10. 5g,琼脂17g，加蒸馏水至1000ml， pH=7. 2; 所述选择性培养基的配方为MgS04*7H20 0. 24g, (NH4)2S04 0. 55g， KH2P04 0. 55g, NaCl l.lg， K2HP04 1. 55g,敌敌畏为320mg,琼脂19g，加蒸 馏水至1000ml,调pH至7. 2。
将得到以敌敌畏为唯一碳源的降解菌液，5500r/min离心9分钟， 取上层清液，加入9niL丙酮振荡，再加入4. 5g氯化钠振荡1.5min，而 后室温下静置待水相与丙酮相分层后移出上层丙酮，再将上层丙酮相 常温常压下过无水硫酸钠柱，收集流出的丙酮进行气相色谱测定。
权利要求
1.一种以敌敌畏为底物的降解菌株的筛选方法，其特征在于1)将2-4g菌样接种于含敌敌畏的100-150mL富集培养基中进行转接培养，每次转接培养条件为30-35℃、150-200r/min摇床培养5-7天，共转接4-5次，转接量按体积百分比计每次培养液8-10％接种于含敌敌畏逐渐增加的100-150ml富集培养基中，待用；其中敌敌畏首次加入量100-150mg/L，而后以100-150mg/L逐渐增加；2)分离筛选取步骤1)中培养的菌液驯化液，稀释104-105后，涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板上，30-35℃恒温倒置培养3-4天；3)降解菌复筛将步骤2)中生长的菌株在含敌敌畏为惟一碳源的选择性无机盐培养基固体平板上划线分离，30-35℃培养4-5天，能够生长的菌株即为能够以敌敌畏为唯一碳源的降解菌株。
2. 按权利要求1所述的以敌敌畏为底物的降解菌株的筛选方法， 其特征在于所述富集培养基的组成为MgS(V7H20 0.20-0. 25g, (NH4)2S04 0.50-0.6g, KH2P04 0. 50-0. 6g , NaCl 1. 0-1. 2g ， K2HP04 1. 50-1. 6 g,敌敌畏分别为100-500mg,加蒸馏水至1000ml,调pH至 7. 0-7. 5;所述牛肉膏蛋白胨培养基的组成为牛肉膏5. 0-6. 0g,蛋白胨 10. 0-11. Og，NaCl 10, O-ll. Og,琼脂15. 0~20. Og，加蒸馏水至1000ml， pH=7. 0-7. 5;所述选择性培养基的配方为MgS04'7H20 0. 20-0. 25g, (NH4) 2S04 0.50-0.6g, KH2P04 0. 50-0.6g, NaCl 1. 0—1. 2g， K2HP04 1.50-1.6 g， 敌敌畏为300-350mg,琼脂15. 0-20. 0g，加蒸馏水至lOOOml，调pH 至7. 0-7. 5。
3. 按权利要求1所以敌敌畏为底物的降解菌株的筛选方法，其特 征在于将得到以敌敌畏为唯一碳源的降解菌液，5000-6000r/min离 心8-10分钟，取上层清液，加入8-10mL丙酮振荡，再加入4-5g氯化 钠振荡1 -2min，而后室温下静置待水相与丙酮相分层后移出上层丙 酮，再将上层丙酮相常温常压下过无水硫酸钠柱，收集流出的丙酮进行 气相色谱测定。
4. 按权利要求1所以敌敌畏为底物的降解菌株的筛选方法，其特 征在于所述气相色谱条件为NPD检测器；DB-1701P色谱柱(30 m x 0. 32 mm x 0. 25 y m); 氧气流量60mL/min,氢气流量2. 3 mL/min,氮 气流量1.2ml/min，检测器温度30(TC，进样口温度29(TC，色谱柱程 序升温温度6(TC保持lmin， 3(TC/min上升至13(TC， 5'C/min上升至 170°C，进#量1. 。nL。
全文摘要
本发明涉及生物降解农药残留技术领域，具体地说是一种以敌敌畏为底物的降解菌株的筛选方法。具体为菌样接种于含敌敌畏的100-150mL富集培养基中进行转接培养，而后取步骤1)中培养的菌液驯化液，稀释10<sup>4</sup>-10<sup>5</sup>后，涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板上，30-35℃恒温倒置培养3～4天；将步骤2)中生长的菌株在含敌敌畏为惟一碳源的选择性无机盐培养基固体平板上划线分离，30-35℃培养4～5天，能够生长的菌株即为能够以敌敌畏为唯一碳源的降解菌株。本发明提供的以敌敌畏为底物的降解菌株的筛选方法可以用于其它有机磷类杀虫剂降解菌株的筛选，在农药残留降解菌株的筛选方面提供了一定的理论指导。
文档编号C12Q1/04GK101597637SQ20081001171
公开日2009年12月9日 申请日期2008年6月6日 优先权日2008年6月6日
发明者张惠文, 张晓黎, 旭 李, 苏振成, 蔡颖慧 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所