专利名称：一种重组杆状病毒快速筛选方法
技术领域：
本发明属于生物基因克隆表达技术领域，涉及一种重组杆状病毒快速筛选 方法，特别是对现有的利用杆状病毒表达系统筛选重组病毒步骤的改进。
技术背景杆状病毒以NPV为主，病毒粒子呈杆状，外被有囊膜和核衣壳。病毒囊膜 内包被一个或多个病毒粒子，成病毒束。核衣壳内包含着单分子环状双链DNA 分子，当囊膜病毒进入到中肠细胞后，在中肠碱性条件下，释放出病毒粒子， 使病毒在细胞内增殖并传播。杆状病毒囊膜表面蛋白主要包括gp64、 p74、 gp41、 p25等，这些蛋白在囊膜病毒进入宿主细胞的过程中起着非常重要的作用，当病毒在细胞内复制、重 新包装时，这些蛋白被表达于病毒囊膜的表面。因此，有人利用杆状病毒囊膜蛋白的特点，建立了杆状病毒表面展示系统。 杆状病毒表面展示系统以杆状病毒为载体，外源基因片段插入到病毒衣壳蛋白 的信号肽与成熟蛋白之间，与衣壳蛋白融合表达或与特异性的锚定部位结合， 加工后信号肽被切除形成的N端融合蛋白或多肽借助杆状病毒稳定地表达并展 示于感染细胞或病毒粒子的表面，筛选得到表达有特异肽或蛋白的杆状病毒粒 子。杆状病毒表面展示系统主要是通过在病毒衣壳蛋白gp64插入外源肽，二者 融合表达或与特异性的锚定部位结合，在病毒表面进行融合表达而筛选出目的 活性肽或蛋白的高等真核生物展示系统。可以用来展示需糖基化、二硫键异构化等翻译后修饰才表现功能活性的复杂真核蛋白及构建多肽文库、抗体库等。杆状病毒表面展示系统的基础是gp64蛋白。gp64蛋白是出芽型病毒特有的 结构蛋白，以同源二聚体、三聚体或四聚体的方式存在于囊膜内、被感染细胞 或病毒粒子的表面，介导病毒和细胞的融合及侵染过程。gp64蛋白能够在病毒 感染的早期和晚期表达。在出芽病毒吸附内吞入细胞的过程中，作为pH依赖型 的膜融合蛋白，gp64与胞饮体膜融合而把病毒核衣壳释放到细胞质中。杆状病毒表达载体系统(baculovirus expression vector system, BEVS) 是一个以杆状病毒为外源基因载体，以和细胞为宿主的表达系统。杆状病毒的 杆状衣壳与较大的基因组可以容纳相对较大片段的DNA插入物，可表达来自病 毒、细菌、真菌、植物和动物几乎所有的蛋白；而且细胞作为真核细胞能完成 外源基因转译后一系列加工修饰，其转译后的加工修饰是赋予外源基因产物生 物活性所必需的，而这些加工修饰在大肠杆菌等原核生物表达系统内往往无法 完成，所以利用杆状病毒表达载体表达出来的蛋白更近似于天然物质。由于以 上优点，杆状病毒表达载体系统已经成为当今基因工程领域四大表达系统之一， 在研究基因表达调控、蛋白质结构和功能分析及各种生物活性物质的制备等方 面发挥着越来越重要的作用。目前，用BEVS表达的外源基因己达500种以上， 并在基因工程生产蛋白质的研究方面存在巨大潜力。由于杆状病毒基因组太大，很难对它直接进行操作。通常BEVS由转移载体、 亲本病毒和重组介质三部分组成，其技术路线分以下几步先将外源片段克隆 到载体质粒中，置于杆状病毒启动子控制之下，上下游各有一段与亲本病毒DNA 相匹配的侧翼序列，通常是多角体蛋白基因(PH)或者是p10基因的侧翼非必 须序列，转移载体带有能在大肠杆菌中繁殖的复制起点却不能在细胞中复制。 构建完成转移载体，然后把转移载体和野生型病毒共转染入细胞，通过同源重组将外源片段插入到病毒基因组而产生重组病毒。由于外源目的基因替换多角 体蛋白基因，重组病毒不能形成多角体，从而易与野生型病毒区分开来，可以 通过空斑分析来鉴定和纯化重组病毒。传统的空斑纯化重组病毒的技术是将共转染后的含有重组病毒和野生型病 毒的溶液作梯度稀释后，用不同浓度的病毒感染单层培养细胞，温育lh后用低熔点琼脂糖凝胶覆盖，27'C培养4 6天后进行空斑鉴定。重组病毒产生的空斑 借助光学显微镜检査加以筛选，并用消毒玻璃毛细管挑取吸出。吸出的含有重 组病毒的琼脂块置于少量细胞培养液溶解稀释并用于下次空斑筛选。如此反复 筛选，才能得到纯化的重组病毒。从共转染样本中分离重组病毒也可以在96孔 塑料板上进行，但是无论哪种方法，由于重组病毒产生的比例很低(通常只有 0. 1% 1%)，往往是重组病毒和野生型病毒混合在一起，区分野生型有包涵体表 型和重组病毒无包涵体表型非常困难，需要训练有素的观察能力和实际经验， 即使技术熟练也需要数个月才能完成。由于空斑筛选的方法效率很低，费时费力，所以重组杆状病毒的筛选成为 制约杆状病毒表达载体系统应用的技术瓶颈。近年来，在空斑分析技术的基础 上发展了一些新技术，大大简化了重组病毒构建和筛选的过程。其中包括在空 斑测定基础上发展的蓝白斑筛选技术、野生型病毒线性化技术、大肠杆菌_细胞 穿梭载体(Bac—to一Bac系统)技术、酵母—细胞穿梭载体等。但是，这些新技术、 新方法只是针对AcNPV表达系统而言的。对于新开发的其他杆状病毒表达系统， 由于受到敏感细胞株、野生型病毒基础理论研究的限制，很难在较短的时间内 开发这些新技术、新方法，使这些表达系统的应用受到限制和影响。 发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种重组杆状病毒快速筛选方法，达到快速筛选重组杆状病毒，提高重组杆状病毒的筛选效率。 本发明的技术方案如下杆状病毒囊膜表面蛋白基因与标签蛋白基因进行融合，构建带有杆状病毒 囊膜表面蛋白基因和标签蛋白基因的转移载体；转移载体与野生型病毒DNA共 转染细胞，待细胞发病后收集病毒液，将得到的病毒液通过能与标签蛋白亲和 的凝胶进行亲和层析，利用展示在病毒囊膜表面的标签蛋白分离、纯化重组杆 状病毒。用收集的重组杆状病毒侵染细胞，即可观察红色荧光蛋白的表达。其中所述的杆状病毒囊膜表面蛋白基因是存在于杆状病毒基因组上的核苷 酸序列，包括gp64、 p74、 gp41、 p25等表达于杆状病毒囊膜表面的蛋白。其中所述的标签蛋白基因是精氨酸标签(Arg-tag)、谷胱甘肽S-巯基转移酶、 麦芽糖结合蛋白和硫氧还蛋白等基因，主要用于分离、纯化与之共同表达的融 合蛋白。本发明的效果和益处是与常规的空斑筛选方法相比，重组杆状病毒的筛选 效率大大提高，可以广泛的应用到利用杆状病毒表达载体进行外源基因表达及 其相关内容的研究工作中。
图1为构建转移载体gst-gp64-rfp-pAp748的质粒示意图。图2为构建gst-gp64-pAp748载体的电泳图。图3为构建gst-gp64-rfp-pAp748载体的电泳图。图4为筛选得到的重组病毒感染樗蚕蛹精巢细胞，红色荧光蛋白表达图。 图中M1:DL2000 DNA Mark; M2: A-HindIII DNA Mark;l:gst-gp64-pAp748质粒； 2:gst-gp64-pAp748-1-Not I /EcoR I ; 3:gst-gp64-pAp748-2-Not I /EcoR I ; 4:pAp748—Not I /EcoR I对照； 5:rfp-T-EcoR I ; 6:rfp-gst-gp64-pAp748-EcoR I ; 7: gp64-pAp748-EcoR I 。
具体实施方式
以下结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施例。实施例分别克隆gst-gp64基因和cmv-rfp-polyA序列。将这两段基因分别依次 克隆到已有的pAp748质粒中，得到转移载体gst-gp64-rfp-pAp748。转移载体 与野生型病毒DNA共转染樗蚕蛹精巢细胞。待细胞发病后收集病毒液，将病毒 液经过GST吸附柱，洗脱吸附的病毒，得到重组病毒。用收集的病毒侵染樗蚕 蛹精巢细胞，观察红色荧光蛋白的表达。下面是详细的步骤第一步构建转移载体gst-gp64-rfp-pAp7481.提取柞蚕杆状病毒DNA:收取患核多角体病的柞蚕血，低速离心沉淀多角 体，以蒸馏水多次洗涤后，加入0.訓a2C03-0. 15MNaCl溶液，室温放置1-1. 5 小时，偶尔摇动。冰醋酸调pH到7.5。加入蛋白酶K至终浓度30ug/ml， 50°C 消化2小时；加入SDS至终浓度P/。， 5(TC消化2小时。酚、酚/氯仿/异戊醇、 氯仿/异戊醇依次抽提一次，取上清。2倍体积冷无水乙醇沉淀DNA, 70%乙醇洗 涤，溶于无菌水中。2.以柞蚕杆状病毒DNA为模板，扩增gp64基因 使用引物Gp64 F:5'-TCTGGAAGTTCTGTTCCAGGCCGAGCATTGCAACGC-3，Gp64 R:5' -GMTTCTAGAAAGGGCCATTAATTTGACTGGCGCCGCCT-3'，其中粗 体字为EcoRI酶切位点。以已有的pGEX6p-l质粒为模板，扩增gst基因。 使用引物GST F: 5， -AGATCT^ r6"C7AU^ 7TJ 70CA4 7T6T6"67^7T6^C(^6^a ftT ATGCTTGGGCATGTCCCCTATACTAGGTTA-3' GST R:5'-AGCGTTGCAATGCTCGGCCTGGAACAGAACTTCCAG-3'，其中粗体 字为BglII酶切位点，斜体字为信号肽序列。以扩增出的gp64片段和gst片段共同作为模板，使用GST F和Gp64 R作 为引物，扩增出gst-gp64片段，连接T载体，测序。3.以pDsRed-Express Nl质粒为模板，克隆CMV-rfp-polyA片段 使用引物RED F: 5' -CGAATTCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGG-3，RED R:5' -CGMTTCCTTAAGATACATTGATGAGTTTGGAC-3， 其中粗体字为EcoRl酶切位点。片段连接T载体。将gst-gp64片段克隆到已有的pAp748载体中。Bgl II ， EcoR I ， Pvu I三 酶切gst-gp64-T质粒，回收2900bp片段。BamH I ， EcoR I双酶切pAp748质粒， 回收载体片段。连接gst-gp64和pAp748。得到gst-gp64-pAp748质粒。 (附图2) 将CMV-rfp-polyA片段克隆到gst-gp64-pAp748载体中。EcoR I分 别酶切CMV-rfp-polyA-T质粒和gst-gp64-pAp748质粒，回收1500bp片段和载 体片段。载体5'端去磷酸化后，连接CMV-rfp-polyA和gst-gp64-pAp748，得 到转移载体gst-gp64-rfp-pAp748，见附图3。第二步共转染樗蚕蛹精巢细胞TC100+20。/。胎牛血清，26。C静止培养樗蚕蛹精巢细胞至对数生长期，以1X106 个/ml接种12孔细胞培养板，待完全贴壁后进行转染。5u g gst-gp64-rfp-pAp748质粒DNA， 10u g野生型柞蚕杆状病毒DNA与 90ii 1无血清培养基混合，3u 1 Cellfection与97 u 1无血清培养基混合。将 上述两种溶液混合，置室温20min。将培养板中的培养液吸出，加入上述混好的 转染混合液，放置27'C培养箱作用5h。弃去转染混合液，加入正常细胞培养液， 27"C静置培养，观察细胞变化。第三步经亲和层析筛选纯化的重组病毒待细胞发病，收集培养基上清液。使用Amersham Biosciences GST Gene Fusion System中的谷胱苷肽琼脂糖4B介质，参考Amersham Biosciences GST Gene Fusion System Handbook,从病毒提取液纯化表面展示了 GST标签的重组 病毒，收集病毒。第四步筛选的重组病毒感染樗蚕蛹精巢细胞，观察红色荧光蛋白的表达 TC100+20y。胎牛血清，26。C静止培养樗蚕蛹精巢细胞至对数生长期，以1X106个/ml接种12孔细胞培养板，待完全贴壁后进行感染。取收集的病毒液，加入上述准备好的细胞中，放置27。C培养箱置培养，观察细胞变化及红色荧光；见附图4，图中的白点为红色荧光。
权利要求
1. 一种重组杆状病毒快速筛选方法，其特征在于杆状病毒囊膜表面蛋白基因与标签蛋白基因进行融合，构建带有杆状病毒囊膜表面蛋白基因和标签蛋白基因的转移载体；转移载体与野生型病毒DNA共转染病毒敏感细胞，等细胞发病后将得到的病毒液通过能与标签蛋白亲和的凝胶进行亲和层析，利用展示在病毒囊膜表面的标签蛋白分离、纯化重组杆状病毒。
2. 根据权利要求1所述的一种重组杆状病毒快速筛选方法，其特征在于昆虫 杆状病毒囊膜表面蛋白基因是存在于杆状病毒基因组上的核苷酸序列，包括 gp64、 p74、 gp41或p25。
3. 根据权利要求1所述的一种重组杆状病毒快速筛选方法，其特征在于其中 所述的标签蛋白基因是精氨酸标签(Arg-tag)、谷胱甘肽S-巯基转移酶、麦芽 糖结合蛋白或硫氧还蛋白。
4. 根据权利要求1所述的一种重组杆状病毒快速筛选方法，其特征在于克 隆gst-gp64基因和cmv-rfp-polyA序列，将两段基因分别依次克隆到已有的 pAp748质粒中，得到转移载体gst-gp64-rfp-pAp748;转移载体与柞蚕野生型 杆状病毒DNA共转染樗蚕蛹精巢细胞；待细胞发病后收集病毒液，将病毒液经 过GST吸附柱，洗脱吸附的病毒，得到重组杆状病毒；用收集的重组杆状病毒 侵染樗蚕蛹精巢细胞，观察红色荧光蛋白的表达。
全文摘要
本发明公开了一种快速筛选重组杆状病毒的方法，属于生物基因克隆表达技术领域。其特征是杆状病毒囊膜表面蛋白基因与标签蛋白基因进行融合，构建带有杆状病毒囊膜表面蛋白基因和标签蛋白基因的转移载体，转移载体与野生型病毒DNA共转染病毒敏感细胞，待细胞发病后将得到的病毒液通过能与标签蛋白亲和的凝胶进行亲和层析，利用展示在病毒囊膜表面的标签蛋白分离、纯化重组杆状病毒。本发明的效果和益处是与常规的空斑筛选方法相比，重组杆状病毒的筛选效率大大提高，可以广泛的应用到利用杆状病毒表达载体进行外源基因表达及其相关内容的研究工作中。
文档编号C12N15/85GK101275122SQ20081001135
公开日2008年10月1日 申请日期2008年5月7日 优先权日2008年5月7日
发明者李文利, 邵纯君 申请人:大连理工大学