专利名称：一种在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，尤其 是一种在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术：
过敏性疾病是人类重大疾病之一。其发病率目前估计约占世界 人口的30~40%，而且正以每年大于1°/。的速度增加，以儿童患者的 发病率上升最为明显。我国近年来对全国的大规4莫调查显示，儿童 哮喘发病率比10年前明显增加，仅小儿哮喘患者达1000万之多， 其中过敏为主要诱因(全国哮喘儿童防治协作组2003)。此外，与癌 症和心脑血管疾病不同，哮喘对人类社会和经济的影响是不能简单 地以其死亡率来衡量的，而要从这种疾病的发作频度来衡量其给人 类造成的经济负担。由于哞喘多发生在年轻人群，其对人类社会和 经济的影响就更严重。早在上世纪60年代，就有蟑螂引起哮喘的报 道。但直到近年来，蟑螂在哞喘发病中的作用才逐渐受到人们的关 注。资料显示，美国哮喘患者中蟑螂过敏的发生率达到27. 5 ~ 42%， 欧洲为3.9-24.5%,非洲为30~44.6%，在我国，北京、上海等 大城市中儿童哮喘患者的蟑螂过敏率也高达27. 8 ~ 43. 8 % 。哮喘发 病率的不断升高，在很大程度上与蟑螂污染加剧有关，蟑螂已经成 为仅次于尘螨的第二大过敏源。目前常见的美洲大蠊和德国小蠊过 敏原已经被鉴定出来，包括3种美洲大蠊过敏原和7种德国小蠊过 敏原被鉴定出来。目前，治疗过敏性疾病的方法主要体现在减轻症 状。有以下方法1.利用抗组胺类以及类固醇药物以緩解症状，但是这些药物并不能抑制IgE抗体的产生并经常带来副作用。2.采用 特异性免疫治疗(脱敏治疗)在过敏性疾病中的作用得到了肯定，其 原理是通过反复给药诱导患者对此过敏原产生耐受性，当患者再 次接触此类过敏原时，过敏反应就会减轻或是不产生反应。然而， 用于治疗的过敏反应提取物是从天然来源分离得到的蛋白质和非蛋 白质成分的粗混合物，这些资源含有大量与过^:原无关的成分，或 者几乎不含有造成患者高敏感性的过敏原，因此疗效不佳。3.利用 基于单克隆抗体的免疫试验对主要过敏原含量进行鉴定，在过敏反 应提取物的标准化方面取得了重要进展，其不利因素是对一种特 定的过敏反应提取物敏感的患者都必须接受含全部提取物成分的相 同的复杂混合物的治疗，会导致副作用的产生，就过敏诊断而言， 这种使用整个过敏反应提取物来进行皮肤测试的方法妨碍了导致患 者敏感的特殊过敏原的检测。4.采用生物化学分离和纯化技术的方 法得到单独的过^:原。尽管这个方法对于过敏原的鉴定可能有效， 但却不足以制备工业规模上的过敏原。因为纯化工艺复杂，其过程 极其耗费人力，并且在通常情况下，从昂贵的自然资源中纯化出过 敏原产量都很低。基于上述原因，用于合成过敏原蛋白质的重组DNA 技术引起了人们的注意。利用可生长在大发酵罐的微生物表达系统 可以大规模获得重组过敏原，这些技术使得重组过敏原以一致纯度 大量生产。除此以外，使用重组DM技术可以表达抗原表位片断或 修饰的过敏原以方便应用于过敏性疾病的诊断或处理。目前，利用 重组DNA技术生产过敏原Per a 9蛋白只是在大肠杆菌中被表达， 并没有在其他系统表达的报道，且在大肠杆菌中被表达的Per a 9 蛋白的特异性IgE结合活性不高。
发明内容
本发明的目的是针对以上现有技术存在的缺点，提出一种在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白的方法，解决天然过
敏原Per a 9蛋白纯化工艺复杂、特异性IgE结合活性不高的问题。 本发明的目的通过以下技术方案实现 一种在杆状病毒-昆虫表 达系统中生产美洲大蠊过^:原蛋白Per a 9的方法，其步骤包括
(1) 从美洲大蠊组织中提取总RNA;
(2) 将总RNA反转录为cDNA,以cDNA为模板，用引物
获得美洲大蠊过敏原Per a 9蛋白的编码基因；
(3) 将Per a 9蛋白的编码基因克隆到杆状病毒载体中，转染 昆虫细胞诱导表达Per a 9蛋白；
(4) 釆用亲和层析方法对Per a 9蛋白进行纯化，从而得到美 洲大蠊过敏原Per a 9蛋白。
在上述生产方法中，所述步骤(2)中PCR反应条件为94。C预变 性10分钟后，94。C30秒变性、50。C45秒退火、72。Cl分钟延伸，进 4亍35个循环。
所述Per a 9蛋白的编码基因如SEQ ID No: 1所示。
所述Per a 9蛋白的编码基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID No: 2所示。与基因数据库(Genbank)中收录的美洲大蠊过敏原精氨酸酯 酶序列有5个位点氨基酸差异，分别是第76位为Gly (数据库为 Ala )，第161为Gly (数据库的Ala )，第163为Leu (数据库为Phe )， 第169为Phe (数据库为Leu)，第258为Ser (数据库为Phe )。
所述步骤(3)中，杆状病毒载体为pFastBacHTA。
所述步骤(3)中，昆虫细胞为sf-9细胞。
所述步骤(4)中，亲和层析的方法为Nickel亲和层析法，具 体步骤是将PO病毒以感染复数为1感染sf9细胞，待细胞出现 肿胀时收集细胞，经超声裂解细胞，离心得到上清液，上Nickel亲和柱，用Tris-HC1緩冲液进行洗脱，第一次洗脱去非特异性结合蛋 白，第二次洗脱下的蛋白即为Per a 9蛋白。其中，在第一次洗脱 步骤中，Tris-HCl緩冲液含300mM NaCl和5%甘油；第二次洗脱步 骤中，Tris-HC1緩冲液含300mM NaCl、 250mM咪哇和5%甘油。
杆状病毒具有高度的种属特异性，不感染脊推动物，相对于其 他病毒载体，如&泉病毒、痘病毒等载体而言，其安全性好。Per a 9 是来源于昆虫(蟑螂)的蛋白，在昆虫细胞中表达能保证表达产物 具有活性，蛋白质表达后修饰加工，信号肽的切除及磷酸化、糖基 化等反应，抗原性、免疫原性均与天然蛋白相似。杆状病毒-昆虫 细胞表达系统，其表达产物的生物学特性与天然产物相似，具有可糖 基化、磷酸化、酰胺化、信号肽和蛋白切割等后加工修饰功能，而 且具有很高的克隆容量，表达产量高，细胞培养筒单，适合大规模 生产。其特异性IgE结合活性比其它系统要高。基于上述原理，本发 明通过杆状病毒-昆虫表达系统生产美洲大蠊过敏原Per a 9蛋白， 从而避免在不同的表达系统中(例如细菌和酵母菌)对Per a 9过 敏原结构造成影响的问题，并提供一种亲和层析的方法，解决天然 Per a 9过敏原纯化工艺复杂的问题。使用杆状病毒-昆虫表达系统 得到的Per a 9蛋白的活性是使用大肠杆菌得到的Per a 9蛋白活 性的2. 1倍。
图1为重组Bacmid的PCR鉴定图。其中，l.鉴定阳性的重组 Bacmid。
图2为重组Bacmid诱导表达及其纯化的SDS-PAGE图语。其中 1.重組质粒感染的sf-9全细胞裂解物；2.上清上Nickel柱后穿 透峰；3.用2OmM Tris-HCl (含有300mM NaCl， 5%甘油，pH8. 0) 洗下的蛋白；4-5.用2OmM Tris-HCl (含有300mM NaCl 5%甘油，20mM咪哇，pH8. O)洗脱后的蛋白；6.用20rnM Tris-HCl (含有300mM NaCl 5°/ 甘油，250mM咪唑，pH8. 0)洗脱下的蛋白。
图3为纯化后的蛋白(Per a 9)免疫印迹(Western blot) 鉴定图。
具体实施方式
实施例一
l.本实施例的步骤如下
(1)从美洲大蠊组织中提取总RNA;取人工伺养的冻存美洲大蠊 (来自江苏省疾病控制中心)，液氮研磨，^t安照lOOmg组织/mL Trizol 试剂加入Trizol试剂。静置10min,而后按照300ul/mL加入氯仿， 混匀，静置lOmin, 12000g离心10min，弃上清，按500ul/mL加入 异丙醇。混匀，静置10min， 12000g离心lOmin,弃上清，管底沉淀 即为美洲大蠊总RNA。加入75°/。乙醇悬浮沉淀，12000g离心lOmin, 弃上清。室温干燥5min,加入无核糖核酸酶的双蒸水溶解。
(2 )以提取的美洲大蠊总RNA为模板，采用TakaRa公司反转录 试剂盒，以多聚脱氧胸腺嘧。定(10 pmol/ul)为引物进行反转录试验产 生cDNA。以基因凄t据库(genbank)美洲大蠊过每文原Per a 9基因序 列设计引物 5 ， -ATGGTGGACGCCGCAGTTCTGGA-3 ， 和 5 ， -TTAGAGCGAGCTCTCCAGCT-3',用PCR方法(94。C预变性10分钟后， 94。C30秒变性、5(TC45秒退火、72°C1分钟延伸，进4亍35个循环。) 扩增出Per a 9基因，用TakaRa公司PCR产物纯化试剂盒纯化PCR 产物。与pMD18-T载体16。C连接过夜，转化到大肠杆菌JM109感受 态细胞中。涂板过夜培养。篩选阳性菌，用TakaRa公司质粒抽提试 剂盒抽提质粒并PCR鉴定正确。送到南京金思特公司测序，确定美洲 大蠊过敏原Per a 9基因，其核苷酸序列如SEQ ID No: 1所示。
(3)将Per a 9蛋白的编码基因克隆到杆状病毒载体中，转染昆虫细胞诱导表达Per a 9蛋白；首先构建美洲大蠊过壽丈原Per a 9 杆状病毒载体pFastBacHTA:将得到的Per a 9基因通过EcoR I and Sal I酶切位点克隆到质粒pFastBacHTA中，转化感受态JM109。 PCR 鉴定筛选出阳性克隆。以含有Per a 9基因的pFastBacHTA质粒转 化感受态DH10Bac，在DH10Bac菌内质粒助手的帮助下，Per a 9基 因可转座到含杆状病毒基因组的Bacmid大质粒上。得到重组 Bacmid。抽提重组Bacmid， PCR鉴定。结果见图1,能扩增出目的条 带，说明Per a 9基因已经重组到Bacmid。将PCR鉴定阳性的重组 Bacmid，用Cellfectin试剂盒转染昆虫细胞Sf9。在HyQ液体培养 基中27。C培养7天后。收集上清得到PO病毒。
(4)采用亲和层析方法对Per a 9蛋白进行纯化，从而得到美 洲大蠊过敏原Per a 9蛋白。首先进行PI病毒扩增PO代病毒以 感染复数0. 1感染lOOmL sf9细胞(2 x 106/ml ) ， 4天收集上清得 到P1代病毒(4 dpi)。再进行大规模感染和纯化
PI代病毒以感染复数为1感染500mL sf 9细胞(2 x l06/ml )， 到细胞出现肿胀的时候收集细胞。超声裂解细胞离心得到上清。上 Nickel亲和柱，用20mM Tris-HCl (含有300mM NaCl， 5%甘油)洗 去非特异性结合蛋白后，改用20mM Tris-HC1 (含有300mM NaCl, 250mM咪唑，5%甘油)洗脱，洗脱下的蛋白即为Per a 5蛋白。釆用 SDS-PAGE进行表达鉴定(图2中lane 6中25-35kDa之间为Per a 9蛋白)。用His单抗估夂western blot,发J见在25—35kDa之间有反 应条带(图3),表明Per a 9蛋白被诱导表达并纯化。 2.对表达出的Per a 9蛋白的特异性IgE结合活性进行测定
采用间接ELISA方法分别测定杆状病毒-昆虫表达系统和大肠 杆菌生产的Per a 9蛋白的特异性IgE结合活性。
杆状病毒-昆虫表达系统生产的Per a 9蛋白，即由实施例一步骤(4 )之后所纯化的Per a 9蛋白；大肠杆菌生产的Per a 9蛋 白为本试验制备，是将实施例一步骤(2 )之后所得的如SEQ ID No: 1所示的美洲大蠊过敏原Per a 9基因，克隆到pET15b质粒中，转化 的大肠杆菌ArcticExpressTM (DE3) RP，用0.5 mMIPTG诱导表达过 夜，收集菌体，超声破碎后离心收集上清，用Nickel亲和柱纯化得 到。
将杆状病毒-昆虫表达系统和大肠杆菌生产的Per a 9蛋白(为 本试验室制备)稀释成lug/ml,高亲和板每孔加入Per a 9蛋白50 ul, 37度保温1小时，洗涤3遍。用1%小牛血清蛋白溶液封闭2h 后，洗涤3遍。加入稀释10倍后的6个美洲大蠊过敏阳性混合血清 和3个蟑螂过敏阴性混合血清50ul,保温lh，洗涤3遍。每孔加1: 150000的偶联辣根过氧化物酶的羊抗人IgE 50ul， 37度保温40分 钟，洗板5遍。加入50ul四曱基联苯胺(TMB)和过氧化氢。闭光反 应5分钟，加入50ullM ^e克酸终止反应。在450nm处测定OD值。美 洲大蠊过敏阳性混合血清和美洲大蠊过敏阴性混合血清450nm处测 定OD值得差值可表示为Per a 9蛋白的特异性IgE结合活性。测定 的OD值分别为1. 5和0. 7。结果表明杆状病毒-昆虫表达系统生产 的Per a 9蛋白的特异性IgE结合活性是大肠杆菌生产的Per a 5 蛋白的2.1倍。说明杆状病毒-昆虫表达系统生产的Per a 9蛋白 优于大肠杆菌生产的Per a 9蛋白。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替 换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。SEQUENCE LISTING
〈110〉江苏省人民医院
〈120〉 一种在杆状病毒一昆虫表达系统生产美洲大蠊过敏原Per a 9蛋白的方 法
<160> 4
<170> Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 1068
〈212〉 DNA
<213〉 美洲大蠊(American cockroach) 〈220〉
〈221> CDS
〈222> (l).. (1068)
〈400〉 1
ATGGTGGACG CCGCAGTTCT GGAGAAGCTG GAGGCCGGCT TCGCCAAATT GGCCGCCTCC 60 GACAGCAAGT CCCTGCTCAA GAAGTATCTG ACCAAGGAAG TGTTCGACAA TCTCAAGACC 120 AAGAAGACTC CTTCATTTGG CTCTACACTT CTTGATGTAA TCCAGTCTGG TCTCGAGAAC 180 CACGACTCCG GCGTGGGCAT CTACGCCCCA GACGCTGAAG CTTATGGCGT GTTCGCTGAC 240 CTGTTCGACC CCATCATTGA GGACTACCAT GGTGGCTTCA AGAAGACCGA CAAGCACCCT 300 CCCAAGGACT GGGGTGATGT GGACACCCTG GGCAACCTGG ACCCTGCTGG CGAGTACATC 360ATCTCCACAC GAGTGAGGTG CGGTCGCTCC ATGCAGGGCT ACCCCTTCAA CCCCTGCTTG 420 ACTGAAGCCC AGTACAAGGA GATGGAGGAC AAGGTGTCCA GCACGCTGTC CGGCCTGGAG 480 GGCGAGCTGA AGGGCCAGTT CTACCCCCTC ACCGGCATGA CCAAGGAGGT CCAGCAGAAG 540 CTCATTGATG ACCACTTCCT CTTCAAGGAG GGCGATCGCT TCTTGCAGGC TGCCAACGCA 600 TGCCGCTTCT GGCCCACTGG ACGAGGCATC TACCACAACG ACGCCAAGAC GTTCCTGGTC 660
CAGGTGTACC GCCGTCTGGT GACGGCTGTG AATGACATCG AGAAGCGCAT CTCCTTCTCG 780 CACGACGACC GTCTGGGCTT CCTCACCTTC TGCCCCACCA ACCTGGGCAC CACCGTGCGT 840 GCGTCTGTGC ACATCAAGGT GCCCAAGCTG GCTGCCGACA AGGCCAAGCT GGAGGAGGTT 900
960
GAGMGAACG ACGGCATCGC CGAGCTGATC AAGCTGGAGA GCTCGCTC 1068
〈210〉 2
〈211〉 356
<212〉 PRT
<213> 美洲大蠊(American cockroach)
<400> 2
MVDAAVLEKLEAGFAKLAASDSKSLLKKYLTKEVFDNLKTKKTPSFGSTLLDVIQSGLEN HDSGVGIYAPDAEAYGVFADLFDPIIEDYHGGFKKTDKHPPKDWGDVDTLGNLDPAGEYI ISTRVRCGRSMQGYPFNPCLTEAQYKEMEDKVSSTLSGLEGELKGQFYPLTGMTKEVQQK LIDDHFLFKEGDRFLQAAMCRFWPTGRGIYHNDAKTFLVWCNEEDHLRIISMQMGGDLG QVYRRLVTAVNDIEKRISFSHDDRLGFLTFCPTNLGTTVRASVHIKVPKLAADKAKLEEV AGKYNLQVRGTRGEHTEAEGGVYDISNKRRMGLTEYDAVKEMNDGIAELIKLESSL
〈210〉 3
<211> 23
<212> 腿〈213〉 Artificial <220〉
<223〉根据基因数据库美洲大蠊过敏原Pera 9基因序列设计引物
<400> 3
ATGGTGGACG CCGCAGTTCT GGA 23
〈210〉 4
〈211〉 20
<212〉 DNA
<213> Artificial
<220>
<223>根据基因数据库美洲大蠊过敏原Pera9基因序列设计引物
<400> 4
TTAGAGCGAG CTCTCCAGCT 20
权利要求
1.一种在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，其步骤包括(1)从美洲大蠊组织中提取总RNA；(2)将总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，用引物ATGGTGGACGCCGCAGTTCTGGA和TTAGAGCGAGCTCTCCAGCT进行PCR反应，获得美洲大蠊过敏原Per a 9蛋白的编码基因；(3)将Per a 9蛋白的编码基因克隆到杆状病毒载体中，转染昆虫细胞诱导表达Per a 9蛋白；(4)采用亲和层析方法对Per a 9蛋白进行纯化，从而得到美洲大蠊过敏原Per a 9蛋白。
2. 根据权利要求1所述在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，其特征在于所述步骤(2)中PCR反应条件为94。C预变性10分钟后，94。C30秒变性、5(TC45秒退火、72°C1分钟延伸，进行35个循环。
3. 根据权利要求1所述在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过壽l原蛋白Per a 9的方法，其特征在于所述Per a 9蛋白的编码基因如SEQ ID No: 1所示。
4. 根据权利要求1所述在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过彰:原蛋白Per a 9的方法，其特征在于所述Per a 9蛋白的编码基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID No: 2所示。
5. 根据权利要求1所述在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，其特征在于所述步骤(3)中，杆状病毒载体为pFastBacHTA。
6. 根据权利要求1所述在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，其特征在于所述步骤(3)中，昆虫细胞为sf-9细胞。
7. 根据权利要求1所述在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，其特征在于所述步骤(4)中，亲和层析的方法为Nickel亲和层析法，具体步骤是将P0代病毒以感染复数为l感染sf9细胞，待细胞出现肿胀时收集细胞，经超声裂解细胞，离心得到上清液，上Nickel亲和柱，用Tris-HCl緩冲液进行洗脱，第一次洗脱去非特异性结合蛋白，第二次洗脱下的蛋白即为Per a 9蛋白。
8. 根据权利要求7所述在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，其特征在于第一次洗脱步骤中，Tris-HC1緩沖液含300mM NaCl和5%甘油(体积比)；第二次洗脱步骤中，Tris-HC1緩沖液含300mMNaCl、 250mM咪哇和5%甘油(体积比)。
全文摘要
本发明涉及一种生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，尤其是一种在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Pera 9的方法，属于基因工程技术领域。本发明通过杆状病毒-昆虫表达系统生产美洲大蠊过敏原Per a 9蛋白，从而避免在不同的表达系统中(例如细菌和酵母菌)对Per a 9过敏原结构造成影响的问题，并提供一种亲和层析的方法，解决天然Per a 9过敏原纯化工艺复杂的问题。使用杆状病毒-昆虫表达系统得到的Per a 9蛋白的活性是使用大肠杆菌得到的Per a 9蛋白活性的2.1倍。
文档编号C12P21/02GK101591674SQ20091003190
公开日2009年12月2日 申请日期2009年7月2日 优先权日2009年7月2日
发明者何韶衡, 魏继福 申请人:江苏省人民医院