专利名称：一种大豆基因启动子序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物基因启动子及其应用，属于生物工程领域。
背景技术：
启动子是基因表达调控的重要顺式作用元件，在某种程度上决定基因表达的时空顺序。 同时，启动子也是基因工程研究的一个重要工具。因此，分离启动子、弄清楚启动子的分子 本质是研究基因表达调控、构建基因工程表达载体的关键。目前应用较广泛的组成型启动子 有花椰菜花叶病毒的CaMV35s启动子，但由于CaMV35s启动子来自于病毒，应用在植物基因 工程中可能会存在一定的安全隐患，所以近年来人们更倾向于使用来自高等植物的启动子。 目前，已有报道的来自于高等植物的组成型启动子的有水稻肌动蛋白基因启动子(McElroyD, et al. Plant Cell. 1990， 2(2) : 163 71)、玉米泛素基因启动子(Alan H. Christensen, et al. Plant Molecular Biology. 1992， 18(4) :675~689)等；组织特异型启动子有番茄果实专 一性启动子2A12 (毛自朝等.科学通报.2002, 47(6) :444-448)、大豆Gmhspl7. 32B热诱导 表达启动子(Ralf Prandl， et al. Plant Molecular Biology. 1996， 31:157 162)等。
大豆是一种重要的经济作物，但生殖器官(花和荚)脱落率高达55%~70%。研究表明，大 豆的落花落荚率与温度、水分、光照、植物体内生长素及乙烯的含量等因素有关(张兴文等. 大豆科学.2002, 21(4) :290 294)。乙烯是一种重要的植物激素(Yang S-F, et aL Annu. Rev. Plant Physiol, 1984, 35:155~189)，在植物生长发育、果实成熟、脱落等过程中起重要作 用。ACC(l-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase, 1-氨基环丙烷-1-羧酸)合酶是乙烯 合成途径中的限速酶，它在植物组织内活性的大小往往决定着乙烯合成的速率(LiuY-D， et al. The Plant Cell. 2004， 16:3386~3399),因此ACC合酶基因的表达调控对于乙烯的体内 合成是至关重要的，而对于大豆ACC合酶基因启动子调控机制的研究具有重要的现实意义。 迄今为止关于ACC合酶基因启动子的研究却相对较少，目前仅报导了从番茄(Shiu， 0. Y., etal. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998， 95:10334~10339),拟南芥(S5nke Holtorf， et al. Plant Molecular Biology. 1995， 25(4) :637~646)以及绿豆(Cazzonelli CI, et al. Transgenic Research 2005, 14: 941~967)等植物中分离得到ACC合酶基因启动子，有关大 豆ACC合酶基因启动子的研究截止目前尚未见报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种新克隆的来源于大豆的植物基因启动子，用于驱动外源基因在
转基因植物中表达。
本发明的另一个目的是提供一种含有上述启动子序列的植物基因表达载体。 本发明的另一个目的是提供含有上述启动子序列的转基因细胞系、组织或植物个体 本发明的另一个目的是上述启动子序列在培育转基因植物中的应用。
、本发明的技术方案是， 一种大豆基因启动子序列，包括-
(1) 具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；或
(2) 与(1)所述的核酸序列互补的核酸序列；或
(3) 与(1)或(2)得核酸序列具有基本序列同源性，并具有相同功能的核酸序列；或
(4) 可与(1)、 (2)或(3)所述核酸序列在杂交条件下杂交，并具有相同功能的核酸序列。 含有核苷酸序列的基因表达载体。含有核苷酸序列的转基因细胞、组织或个体。本发明在培 育转基因植物中的应用。
本发明提供的DNA序列，如SEQ ID N0:1所示，代表的是大豆ACC合酶基因的启动子序 列。其序列共573bp。其中165 167bp是翻译起始密码子，lbp处为转录起始位点，-44 -50bp 为推测的TATA-box, -223~-227bp为推测的CAAT-box。此外还有三个胁迫诱导元件光应答 元件Boxl位于-168 -174bp，Box4位于-21(T-215bp，诱导物应答元件W-box位于-268 -272bp。
本发明从大豆中分离克隆出一种大豆ACC合酶基因的启动子，基本技术路线为启动子 序列克隆——序列分析——表达载体构建——启动子活性分析。其中，启动子克隆可利用的方法为本领域研究人员熟知，包括有启动子陷阱技术、锚定PCR、反向PCR (I-PCR)、接头 PCR以及热不对称交错PCR (TAIL-PCR)等；获得序列可利用植物启动子顺式元件数据库，例 如 PLANTCARE ( http: 〃s。hinx. rug, ac. be: 8080/PlantCare/ )， 或 PLACE (http:〃www.dna,affrc. go. Jp /htdocs/PLACE/)对得到的启动子序列进行分析，初步确 定启动子的核心元件和相关功能原件；将该序列进一步克隆到含有GUS、 GFP、 GRP等常用报 告基因或抗抗生素、抗除草剂等常用抗性基因、或编码某一功能蛋白的结构基因的常用植物 双元表达载体或线性基因表达载体中，利用本领域研究人员熟知的多种转化手段可以实现将 本发明所涉及的植物表达载体转入植物中，任何适用于植物或植物细胞的转化方法都可以使 用，如使用农杆菌介导侵染法、蘸花法、电击法，基因枪轰击法、花粉管导入法、细胞和原 生质体显微注射法、直接转化法等，转化烟草、拟南芥等模式植物，或其他单子叶、双子叶 植物细胞、组织。被转化的细胞在合适的条件下可再生成完整的转基因植株。最后，通过检 测报告基因的表达情况确定该启动子的活性，如GUS报告基因编码e-葡萄糖苷酸酶，可以在 体外催化裂解人工合成的X-gluc (5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖羧酸)底物，产生深蓝色化合物 沉淀于植物组织。
本发明的有益效果是，本发明所阐述的来自于大豆ACC合酶基因启动子区域的序列可作 为一个启动子元件插在DNA双元载体中而用于所有能够使用该启动子的植物(即该植物的RNA 聚合酶能与本文公开的启动子序列结合)的转化来表达目的基因。在构建的表达载体中，与 该启动子连接的可以是任何目的基因序列；目的基因的DNA序列可以来自同源植物、外源植 物、真菌、藻类、细菌、病毒或动物基因，也可以是人工设计合成的DNA序列。这些序列可 以是一段编码有功能的蛋白质或其一部分的正义序列或一段反义序列。本发明克隆到的启动 子是国内首次克隆到的大豆ACC合酶基因的启动子。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。图1为本发明的ACC合酶基因的5' -RACE结果电泳图
图2为本发明的TAIL-PCR结果电泳图3为本发明的植物表达载体的构建流程图4为本发明的大豆ACC合酶基因启动子驱动的GUS报告基因在烟草叶片中的瞬时表达 结果的烟草叶瞬时表达GUS染色结果；
图5为本发明的大豆ACC合酶基因启动子驱动的GUS报告基因在烟草叶片中的瞬时表达 结果的烟草空白对照。
具体实施例方式
植物材料大豆种子为铁丰-29,在实验室栽培菌种为本实验室保存pMD19 simple-T载 体、各种酶、试剂和试剂盒均购自TaKaRa (大连)公司；测序及引物合成均由TaKaRa (大连) 公司完成。
实施例1
使用TaKaRa 5' -Full RACE Kit进行ACC合酶基因的5' -RACE实验。具体步骤如下
1. 大豆DNA的提取
以大豆叶片为材料，采用SDS-CTAB改进法法提取其总DNA，取2yLDNA样品，琼脂糖凝 胶电泳检测其浓度。
2. ACC合酶基因的扩增
根据已知的大豆ACC合酶基因序列(GenBank Accession No: dq273840),在其两侧设计 引物CTA798F : 5' -AGACTATATGGGGTTGATGGCTGC-3' ， CTA79服5' -GAGCTATCGCAC-ATAACTGGAACA-3',然后以大豆基因组DNA为模板，以CTA798 F/CTA798 R为引物扩增目的 基因片段，pcr反应条件94。C 5min;94。C 30s, 56°C 30s,72。C lmin，共30个循环；72°C lOmin。 切胶回收PCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳后进行测序，获得ACC合酶基因序列。
3. ACC合酶基因的5'-cDNA末端快速扩增(5'-RACE)先根据1.2.2获得的ACC合酶基因序列设计两个嵌套的反向特异弓j物GSP:5' -GGCCTTCTCATACGCATCTTCCAA-3' ，GSPN:5' -CCAGTTGCTCCACCGCTCATGACA-3'，再使用TaKaRa RNAiso Reagent提取大豆嫩叶总RNA，然后使用TaKaRa 5' -Full RACE Kit进行5' -Full RACE 实验(图1)。
实施例2
采用TAIL-PCR的方法从大豆DNA中克隆出ACC合酶基因启动子片段。具体步骤如下
根据实施例1中获得的ACC合酶基因序列，设计三个嵌套的反向特异引物CTA798 spl,
CTA798 sp2, CTA798 sp3，用CTA798 spl， CTA798 sp2， CTA798 sp3分别与4个AD引物(表
1)配对进行TAIL-PCR扩增，首先以大豆基因组DNA为模板，CTA798 sp3为下游引物，4个
AD引物为上游引物进行TAIL-PCR。反应体系luL模板，5p L10XLA Buffer (Mg2 + ), 1 u L
LA Taq酶，特异引物20pmol， AD primer lOOpmol，补水至50uL;反应条件见表2。然后
以第一次的TAIL-PCR产物为模板,CTA798 sp2为下游引物，4个AD引物为上游引物进行
TAIL-PCR，反应体系及反应条件与第一次PCR的相同；再以第二次TAIL-PCR产物为模板，
CTA798 spl为下游引物，4个AD引物为上游引物进行TAIL-PCR ，三次PCR的反应体系及反
应条件与第一、二次PCR的相同。最后将一、二、三次TAIL-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，
回收合适片段,测序。 一 表l TAIL-PCR扩增引物
Table 1The primers used in TAIL-PCR_
CTA798 SP1: 5' -GACCCATTTGGATAACCCCGTTAG-3' CTA798 SP2: 5' -GGGGTTTTCATCATAAGCCTTCCA-3' CTA798 SP3: 5' -GGGGATGCTTCACCATGTCCATCT-3' AD1:5' -NTCGASTWTSGWGTT- 3' AD2: 5' -NGTCGASWGANAWGAA- 3' AD3: 5' - WGTGNAGWANCANAGA- 3'
AD4: 5' - AGWGNAGWANCAWAGG- 3'_
实施例3以pBI121为基础，构建由ACC合酶基因上游调控序列启动的GUS基因植物表达载体，并
转入农杆菌EH105，构建流程如图3所示。 (l)中间载体的构建
根据实施例2中得到的ACC合酶基因启动子片段序列设计引物NEF， NER，并加上酶切表2
TAIL-PCR扩增反应步骤 Table 2TA化一PCR procedure
1 x93 °Clmin95 。Clmin
1 X94 。C30s62 °Clmin72 。C 2min
1 X94 。C30s25 °Clmin72 。C 2min
94 °C30s60 °Clmin72 °C 2min
15 X94 。C30s60 °Clmin72 °C 2min
94 °C30s44 °Clmin72 °C 2min
IX72 °C5min4 °Coo
位点(斜体下划线部分)。NEF: 5' -/MgOTACTTTATGTAGCGTGTGCAC-3' (Hind III),NER: 5， H6GGAAGCCTTTTGAGTGTGGT-3' (BamH I) ， PCR得到全长启动子片段，切胶回收并将此 片段克隆到PMD19 simple-T载体，并转化到大肠杆菌topl0;从含卡那霉素50ng/mL的LB 平板上挑取单菌落进行酶切鉴定，然后碱法提取质粒。
(2)表达载体的构建将(l)中提取的质粒用Hind ni/BamHI酶切，回收启动子片段，然后与 pBI121载体的BamH I /HindlII双酶切大片段回收产物进行连接反应，转化大肠杆菌Topl0; 从含卡那霉素50ng/mL的LB平板上挑取单菌落进行酶切鉴定，并提取质粒。 (3将实施例3中构建由ACC合酶基因上游调控序列启动的GUS基因植物表达载体采用冻融 法转入农杆菌EH105,具体方法参照Cui W等[Rapid， high efficient transformation of foreign腿to Agrobacterium tumefaciens. Chinese Journal of Biotechnology, 1995， 11 (4) :35(T355]。
实施例4
采用农杆菌介导的叶盘法对烟草叶片进行转化，方法参照李静等[莴苣高效瞬时表达体系 的建立.园艺学报，2005， 32(5) :885-888]，然后GUS组织化学染色检测瞬时表达结果，方法参照Jefferson等[Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion systeml Plant Molecular Biology Reporter, 1987, 5 (4) :387 405]，结果如图4所示，这表明该启动子 片段能够调控GUS基因在烟草内进行瞬时表达，具有启动子活性。序列表
SEQUENCE LISTING
〈110〉大连理工大学
<120〉大豆ACC合酶基因启动子序列及其应用
<130〉 AppFileReference :
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〈141〉 CurrentFilingDate : 2008-03-28
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<213〉 OrganismName : Glycine max 〈400> PreSequenceString :1
gattacta犯ctttatgt agcgtgtgca -301 caaagtctat tctctttctc ccattgggtt gacaaaaata ttacgagtgg catcttgcta -241 gctctcacta gggLC犯ttat ttctaattaa tagtgggtcc tgtctgcgta ccaactactg -181 cctaattttc a犯cctaaga agcataatag ctgatgttga actcttctct ccttcgtggg -121 aaccttcatt ttatttggac taaagatatt cctctctctg aaggtcaagg tgaatttgtg -61 cactacatgc tata犯taag cacccctctc ggtgttgttg ttcattgcta gacact犯ac -l atttcctccg taaattattc atagcatatt tcaaaccaca ctcaaaaggc ttccctccct 60 gacttggatt tgattgattt cattacattg ctacactata ttctttttat "tggtgaattg 120 ctatttgcta cactacattt taaggacaat tatacataga ctatatgggg ttgatggctg 180 cgaaccaaac tcaattgttg tctaagatgg ccatcggaga tggacatggt gaagcatccc 240 caatc 24权利要求
1、一种大豆基因启动子序列，其特征在于，包括(1)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；或(2)与(1)所述的核酸序列互补的核酸序列；或(3)与(1)或(2)得核酸序列具有基本序列同源性，并具有相同功能的核酸序列；或(4)可与(1)、(2)或(3)所述核酸序列在杂交条件下杂交，并具有相同功能的核酸序列。
2、 根据权利要求l所述的一种大豆基因启动子序列，其特征在于，含有核苷酸序列的基因表 达载体。
3、 根据权利要求l所述的一种大豆基因启动子序列，其特征在于，含有核苷酸序列的转基因 细胞、组织或个体。
4、 根据权利要求l所述的一种大豆基因启动子序列，其特征在于，在培育转基因植物中的应 用。
全文摘要
本发明提供一种大豆ACC合酶基因启动子序列及其应用。本发明所提供的启动子具备以下序列特征1)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；或2)具有与1)所述序列互补的核酸序列；或3)具有与1)或2)基本序列同源性，并具有相同功能的核酸序列；或4)具有可与上述序列杂交的核酸序列。本发明提供的启动子可作为植物基因工程操作的工具启动子，广泛用于植物基因表达调控研究和培育具有较高生物安全性的转基因植物。
文档编号C12N15/11GK101413000SQ20081001100
公开日2009年4月22日 申请日期2008年4月11日 优先权日2008年4月11日
发明者安利佳, 君 杨, 燚 赵 申请人:大连理工大学