专利名称：快速高通量筛选多环芳烃降解菌的改进固体双层平板法的制作方法
快速高通量筛选多环芳烃降解菌的M固体双层平板法 駄领域本发明涉及一种快速高通量筛选多环芳烃降解菌的改进固体双层平板法，采用6M的固体双层平板法从土壤样品中快速、高通量筛选多环芳烃降解菌，属于 污染土壤生物修复技术领域，适用于从环境样品中挖掘多环芳烃污染土壤生物修 复微生物资源。 背景狱多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbon, PAHs)是倍受关注的一大类环 境污染物，分布十分广泛，在空气、土壤、地表水和地下水中均能检出PAHs组 分。由于其生物可禾拥度差、半衰期较长，并且具有潜在的致畸、致癌和致突变 效应，因lt树人类健康产生了巨大劇办。菲、芘、荧蒽、苯并芘等16种多环芳烃 化合物已被美国环保局(EPA)列入优先控制污染物黑名单。原油开采和冶炼过 程中的工业污水排放和溢油泄漏事故是导致土壤PAHs污染的主要原因，我国石 油工业发展迅速，但也随之带来严重的环境污染问题，有近千万亩的耕地受到不 同禾號的石油烃污染。因此，对PAHs污染土壤进行修复、恢复其生态功能以保 障农产品安全是一项十分迫切的任务。PAHs污染微生物降解技术是一种新型原位生物修复技术。它利用微生物种 类繁多、代谢类型极为丰富等生物多样性原理与特点，M从土著微生物群落中 筛选高效PAHs降解菌株并回接原位污染土壤，达到清除土壤PAHs污染的目的。 采用生物修复法降解PAHs污染物操作简单，可以克服物理、化学处理修^(隹度 大、成本高，还会有二次污染的缺陷，应用前景广阔。其中，高效PAHs降解菌 的筛选皿行有效生物修复的技术关键。传统PAHs降解功能菌株的筛选一iK取"富集培养一随机挑取菌株一液体 摇瓶魁正降解率"的技术路线，这种方法往往带有一定的盲目性和随机性，工作 量大、费时费力，皿用高效液相色谱(HPLC)测定成*^高。开发一种快速、 便捷、高通量的筛选方法从环境样品中分离PAHs降解功能微生物资源对于环境微生物学者是一种迫切需求，类似的研究方法也能为其他功能微生物资源的开发 提供借鉴。此前，也有学者提出采用"单层平板法"初步筛选PAHS降解菌。"单层平板分离法"为在固体无机培养基上涂一层PAHs的丙酮或乙醇溶液，待有机溶剂充 分挥发后，接种土壤样品悬液，使之均匀分布在PAHs表层；l-3星期后，在離 的旁边可形成一个降解圈的则为PAHs降解菌。但在劍门的实践操作中发现，采 用涂布法制备以PAHs为唯一碳源单层固体平板不可行，因为有机溶剂挥发比较 快，未等涂布均匀便析出PAHs晶体，因此不能制备均匀的PAHs固体平板；采 用喷雾法制备单层固体平板较涂布法效果稍好，PAHs晶体分布比较均匀，但形 成的降解圈边缘不整齐，不容易辨认，且喷雾过程需在通风櫥中进行，t歡隹控制 无菌緣 发明内容本发明的目的是提供一种从土壤样品中快速高通量筛选多环芳烃高效降解菌 的固体"双层平板分离法"。针对传统随机筛选方法的盲目性和费时费力的缺点， 在单层平板法改进的基础上开发一种快速、便捷的筛选方法从环境样品中分离 PAHs降解功能微生物。克服了单层平板法的许多不足，采用双层平板法能够使 PAHs晶体均匀分布于上层培养基形成的菌斑边缘清晰，易于辨认，且可在超 净台中操作，容易控制无菌^#。从而，满足在实验室決速高通量初步筛选多环 芳烃高效降解功能菌株的要求。本发明的技术方案如下本发明提供一种快速高通量筛选多环芳烃降解菌的固体双层平板法，主要特 征为下层培养基为普通无机盐琼脂培养基添加多种维生素和微量元素，从而能 够尽可能满足各种微生物的营养需求；上层培养基为以多环芳烃(PAHs)为唯一 碳源的无机盐低熔点琼脂糖培养基，选择低烙点琼脂糖代#^通琼脂制作上层培 养基， 一方面可防止加入PAHs时由于高温导致的降解或者挥发；另一方面可使 降解暗圈更清晰易辨。^fOT上述"固体双层平板法"从土壤样品中快速高通量筛选PAHs高效卩賴牟 菌的主要技术路线为土壤样品采集—多环芳烃耐受菌群的富集培养和菌株分离 4应用双层平板法初步筛选多环芳烃降解菌—HPLC法测定初筛菌株PAHs降解 率复筛—确认高效菌株。详细实施步骤为1) 土壤样品采集和处理采集表层土壤样品(0-20cm)，过1腿筛，4。C冰 箱保存；2) 多环芳烃耐受菌群的富集培养采用逐步提高底物浓度的方法对多环芳 烃耐受菌群进行富集培养。称取供试土壤样品5g (干重)，接入45ml以某PAHs 组分为唯一碳源的液体无机盐培养基中，PAHs的初始浓度为50mgi;1，置于30 'C恒温摇床上180rpm富集培养。富集培养一定时间后(7~10天)，移取第一次富 集培养液按10%的体积比例接入45 ml新鲜的以PAHs为唯一碳源的液体无机盐 培养基中，进行第二次富集培养，共重复4次，每转接1次，PAHs的浓度提高 50 mg L" ， PAHs的浓度逐步提高至200 mg U1 。3) 多环芳烃耐受菌群的分离将2)中的富集培养 用无菌生理盐水(重 量浓度0.85%NaCl溶液)在无菌条件下进行10倍系列梯度稀释，取O.lml、稀释 度为10:10—7的富集培养液涂布LB固体培养基，置于3(TC恒温培养箱中，培养 48 h。挑取具有不同M形态的单K^若干株，重新点种于LB固体培养基上， 并对離进行顺序编号。置于3(TC恒温培养箱中，培养48h。4) 多环芳烃固体双层平板制备在无菌的平皿中先倾入20ml下层培养基， 既固体无机盐培养基添加0.1ml/L维生素母液。待下层培养基凝固后，再加入IO ml上层培养基，既以PAHs为唯一碳源的固体无机盐低熔点琼脂糖培养基。上层 培养基配制方法量取重量浓度1% PAHs无菌乙醇溶液100^1，加入10ml冷却 至35T:的无机盐低熔点琼脂糖培养基中，使PAHs终浓度为100mglA5) 应用双层平板法高通量筛选多环芳烃降解菌用灭菌牙签将3)中培养好 的離点种于4)中帝ij备的多环芳烃固体双层平fch， 3(TC恒温培养箱中，培养 2~4周(培养时间根据不同PAHs而不同)。在紫外灯下观察， 周围出现降解 暗圈则表明底物被降解，该菌株可确认为多环芳烃降解菌。6) 根据降解率进行复筛选取5)中降解暗圈较大的部分菌株，接种于LB 液体培养基，培养至OD6oH).6^.8，按10%接种量接入以PAHs为唯一碳源的液 体无机盐培养基中，置于30。C恒温摇床上180rpm培养5-10天(培养时间根据不 同PAHs组分而定)。提取培养基中剩余PAHs组分，采用HPLC方法测定，与对 照比较，计算降解率。本发明中，液体无机盐培养基配方为:K2HP04 2g、 KH2PO40.5g、 NaC10.5g、 NH4Cl 0.5g、 MgS04 0.2g、 CaCl2 10mg、微量元素溶液lml，用蒸馏7乂定容至1000ml;其中，微量元素溶液配方为FeS02 7H20 2g、 MnS04 H20 2g、 Na2MoS04 '2H20 0.5g、 H3B04 0.2g、 CuS04 '5恥0.4g、 ZnS04 0.5g、 NHtVOs 0.2g、 CoCl2 6H2O0.5g、 MC12 6H2O0.2g，用蒸馏水定容至lOOOml。本发明中，以PAHs为唯一碳源的液体无机盐培养基配制方法取丙酮配制 的PAHs母液，浓度为5g/L， 0.22,滤膜除菌，量取50~200 (ol PAHs丙酮母液， 加入已灭菌的250ml三角瓶中，待丙酮挥发完毕，加入50ml灭菌的液体无机盐 培养基，使PAHs的终浓度为50-200 mg U1 。本发明中，固体无机盐琼脂培养基配方为液体无机盐培养基，加入2%重 量的普通琼脂粉。本发明中，固体无机盐低熔点琼脂糖培养基配方为液体无机盐培养基，加 入1%重量的低熔点琼脂糖(熔点为3(TC)。本发明中，维生素母液配方为硫胺素10mg、核黄素5mg、维生素B6 5mg、 泛酸转20mg、对-氨基苯甲酸5mg、烟碱5mg、肌醇100mg，用无菌水定容至 1000ml，用0.4pm滤膜过滤除菌。本发明中，LB固体培养基配方为胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g， NaC110g， 琼脂粉20g，用蒸馏水定容至1000ml， pH7.2~7.4。本发明中，多环芳烃为菲、芘或荧蒽等。本发明的有益效果如下-1、 本发明掛共了一种 的"固体双层平板法"，操作简便,，育g够高通 量从土壤样品中分离具有,PAHs功能的菌株，大大提高了初筛效率。本发明 针对传统降解菌株筛选的盲目性、随机性且工作量大、费时费力等缺点，开发研 制出一种舰的固体双层平板法，为在实验室中高通量筛选多环芳烃降解菌，挖 掘新的生物修复微生物资源提供了一种快速便捷的手段。2、 本发明所采用的固体双层平板法，下层培养基为普通无机盐琼脂培养基添 加多种维生素和微量元素；上层培养基为以多环芳烃(PAHs)为唯一碳源的无机 盐低熔点琼脂糖培养基，选择低熔点琼脂糖代替普通琼脂制作上层培养基， 一方 面可防止加入PAHs时由于高温导致的降解或者挥发；另一方面可使降解暗圈更 清晰易辨。3、 与"单层平板法"相比，采用"双层平板法"能够使PAHs晶体均匀分布 于上层培养基，形成的菌斑边缘清晰，易于辨认。下层培养基添加多种维生素和微量元素，倉詢多尽可能满足各种微生物对维生素和微量元素的需求，从而做到尽量不漏筛；制备上层培养基时，选用低熔点琼脂糖代替普通琼脂，使PAHs可以 在培养基、鹏降至较低时加入，可避免高温加入时弓l起的挥发，从而降低对实验 操作人员的身体危害。4、实验室实验表明，采用本发明提供的"固体双层平板法"，能够快速大量 的从石油污染土壤中分离降解菲、芘和荧蒽的菌株，从而进一步采用液体摇瓶方 法复筛。
图1为菲,军菌在双层平板上形成的暗圈。 图2为芘P絲军菌在双层平板上形成的暗圈。 图3为荧蒽降解菌在双层平板上形成的暗圈。实施例i采激抚灌区石油污水灌溉50姊的稻田表层(0-20cm) 土壤，过l纖筛， 4。C7水箱《呆存。称取供试土壤样品5g (干重)，接入45ml以PAHs为唯一碳源的 液体无机盐培养基中(PAHs的初始浓度为50mgU1)，可以选择加入玻璃珠，置 于3(TC恒温摇床上180rpm富集培养。富集培养一定时间后(7~10天)，移取第 一次富集培养液按10%的体积比例接入45 ml新鲜的以PAHs为唯一碳源的液体 无机盐培养基中，进行第二次富集培养，共重复4次，每转接1次，PAHs的浓 度提高50mgi;1， PAHs的浓度逐步提高至200mglA将上述富集培养液无菌生 理盐7K (重量浓度0.85%NaCl溶液)在无菌^j牛下进行10倍系列梯度稀释，取 O.lml、稀释度为10'5 10-7的富集培养液涂布LB固体培养基，置于30。C恒温培养 箱中，培养48h。挑取具有不同m形态的单^S"軒株，重新点种于LB固 体培养基上，并对離进行顺序编号。置于30。C恒温培养箱中，培养48h。取丙酮配制的PAHs母液，浓度为5g/L， 0.22pm滤膜除菌，量取50 200^1 PAHs丙酮溶液，加入已灭菌的250 ml三角瓶中，待丙酮挥发完取加入50 ml 灭菌的液体无机盐培养基，使PAHs的终浓度为50 200mgi;1。其中液体无机盐培养基配方为:K2HP04 2g、 KH2P04 0.5g、 NaCl 0.5g、 NH4Cl 0.5g、 MgS04 0.2g、 CaCl210mg、微量元素溶液lml，用蒸馏水定容至1000ml。其中， 微量元素溶^夜配方为FeS02 '7H202g、 MnS04 'H202g、 Na2MoS04 '2H2O0.5g、H3BO40.2g、 CuS04 5H20 0.4g、 ZnSO40.5g、 NH4VO30.2g、 CoCl2 6H20 0.5g、 NiCl2*6H2O0.2g，用蒸馏水定容至lOOOml。LB固体培养基配方为胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g， NaCl 10g，琼脂粉20g， 用蒸馏水定容至lOOOml， pH7.2~7.4。实施例2用灭菌牙签将实施例1中培养好的菌株点种于多环芳烃固体双层平板上，置 于3(TC恒温培养箱中，培养24周(培养时间根据不同PAHs而不同)。在紫外 灯下观察，菌落周围出现降解暗圈则表明底物被降解，该菌株可确认为备选的 PAHs降解菌。多环芳烃固体双层平板帝恪方法在无菌的平皿中先倾入20 ml 下层培养基，既固体无机盐培养基添加0.1ml/L维生素母液。待下层培养基凝固 后，再加入10 ml上层i咅养基，既以PAHs为唯一碳源的固体无机盐低熔点琼脂 糖培养基。上层培养基配制方法上层培养基配制方法量取重量浓度"/。PAHs 无菌乙醇溶液1(%1，加入10ml冷却至35。C的无机盐低熔点琼脂糖培养基中，使 PAHs终浓度为100 mg L—1 。其中固体无机盐琼月針咅养基配方为液体无机盐培养基(同上)，加入2%重量的 劍謝。固体无机盐低熔点琼脂糖培养基配方为液体无机盐培养基(同上)，加入 1%重量的低熔点琼脂糖。维生素母液配方为硫胺素10mg、核黄素5mg、维生素B6 5mg、泛酸f丐 20mg、对-氨基苯甲酸5mg、烟碱5mg、肌醇100mg，用无菌水定容至1000ml， 用0.4,滤膜过滤除菌。实施例3选取中实施例2中降解暗圈较大的初筛菌株，接种于LB液体培养基，培养 至OD6oo=0.6~0.8，按10%接种量接入以PAHs为唯一碳源的液体无机盐培养基(同 上)中，置于3(TC恒温摇床上180rpm培养5-10天(培养时间根据不同PAHs组 分而定)。提取培养基中乘l涂PAHs组分，采用HPLC方法测定，与对照比较，-计LB液体培养基配方为胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g， NaCl 10g，用蒸馏水 定容至画ml， pH7.2~7.4。应用例1采敏抚灌区石油污水灌溉50余年的稻田表层(0-20cm) 土壤作为供试土 壤，采用舰的"固体双层平板法"，以三环PAHs菲为模式化合物，从该土壤样 品中筛选菲P絲军菌。富集培养菲的浓度从50mgL—1，逐渐提高至200mgL'1，每 轮富集i歸时间为7天；双层平fei:层培养基菲的终浓度为100 mg L"，点种双 层平板后培养时间为2周，共有7株菌在菲双层平板上出现降解暗圈(见图l); 选取其中3株降解暗圈较大的菌株经液体摇瓶实验测定菲降解率，底物浓度为200 mgL'1，培养时间为5天，降解率分别为87%， 95%和92°/。。应用例2采M:抚灌区石油污7jC灌溉50 ^的稻田表层(0-20cm) 土壤作为供试土 壤，采用改进的"固体双层平板法"，以四环PAHs芘为模式化合物，从该土壤样 品中筛选芘降解菌。富集培养芘的浓度从50mgi;1，逐渐提高至200mgL'1，每 轮富集培养时间为10天；双层平板上层培养基芘的终浓度为100mgL'1，点种双 层平板后培养时间为4周，共有8株菌在芘双层平板上出现降解暗圈(见图2); 选取其中5株降解暗圈较大的菌株经液体摇瓶实验测定芘降解率，底物浓度为100 mgU1，培养时间为10天，降解率分别为54%， 52%， 68%， 73%和61%。应用例3采^t抚灌区石油污水灌'溉50余年的稻田表层(0^0cm) 土壤作为供试土 壤，采用M的"固体双层平板法"，以四环PAHs荧蒽为模式化合物，从该土壤 样品中筛选荧蒽,菌。富集培养荧蒽的浓度从S0mg1/1，逐渐提高至200 mg L—、每轮富集培养时间为10天;双层平板上层培养基荧蒽的终浓度为100mgL—、 点种双层平板后培养时间为4周，仅有1株菌在荧蒽双层平板上出现降解暗斷见 图3);该菌株经液体摇瓶实验测定荧蒽降解率，底物浓度为講mgL—1，培养时 间为7天，降解率分别88%。
权利要求
1、一种快速高通量筛选多环芳烃降解菌的改进固体双层平板法，其特征在于，下层培养基采用普通无机盐琼脂培养基添加多种维生素和微量元素；上层培养基为以多环芳烃为唯一碳源的无机盐固体培养基，但选择低熔点琼脂糖代替普通琼脂；具体步骤如下1)土壤样品采集和处理采集表层土壤样品，过1mm筛，4℃冰箱保存；2)多环芳烃耐受菌群的富集培养采用逐步提高底物浓度的方法对多环芳烃耐受菌群进行富集培养；3)多环芳烃耐受菌群的分离将2)中的富集培养液采用无菌生理盐水在无菌条件下进行10倍系列梯度稀释，取0.1ml、稀释度为10-5～10-7的富集培养液涂布LB固体培养基，置于30℃恒温培养箱中，培养48h；挑取具有不同菌落形态的单菌落各若干株，重新点种于LB固体培养基，并对菌落进行顺序编号，置于30℃恒温培养箱中，培养48h；4)多环芳烃固体双层平板制备在无菌的平皿中先倾入20ml下层培养基，既固体无机盐培养基添加0.1ml/L维生素母液；待下层培养基凝固后，再加入10ml上层培养基，既以PAHs为唯一碳源的固体无机盐低熔点琼脂糖培养基；上层培养基配制方法量取重量浓度1％PAHs无菌乙醇溶液100μl，加入10ml冷却至35℃的无机盐低熔点琼脂糖培养基中，使PAHs终浓度为100mgL-1；5)应用双层平板法高通量筛选多环芳烃降解菌用灭菌牙签将3)中培养好的菌落点种于4)中制备的多环芳烃固体双层平板上，30℃恒温培养箱中，培养2～4周；在紫外灯下观察，菌落周围出现降解暗圈则表明底物被降解，该菌株可确认为多环芳烃降解菌。
2、 按照权利要求l戶脱的固体双层平板法，其特征在于，所述步骤l)中， 表层土壤样品在距地面0-20cm舰取。
3、 按照权利要求1所述的固体双层平板法，其特征在于，戶，步骤2)中， 逐步提高底物浓度的方法是称取供试土壤样品5g，接入45ml以某PAHs组分为唯一碳源的液体无机盐培养基中，第一轮富集培养PAHs浓度为50mgi;1，置 于3(TC恒温摇床上180rpm富集培养，富集培养时间根据不同PAHs组分而定， 为7~10天，富集培养后，移取第一次富集培养液按10%的体积比例接入45 ml 以PAHs为唯一碳源的液体无机盐培养基中，进行第二次富集培养，共重复4次， 每转接1次，PAHs的浓度提高50 mg L—1 ，即最后一次PAHs的浓度提高至200 mg L"。
4、 按照权利要求3戶腿的固体双层平板法，其特征在于，以PAHs为唯一 碳源的液体无机盐培养基配制方法取5g/L丙酮配制的PAHs母液，0.22pm滤 膜除菌，量取50 ~200|il PAHs丙酮母液，加入已灭菌的250 ml三角瓶中，待丙 酮挥发完毕，加入50ml灭菌的液体无机盐培养基，使PAHs的终浓度为5(K200 mgiA
5、 按照权利要求1所述的固体双层平板法，其特征在于，戶舰步骤3)中， LB固体培养基配方为胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g， NaC110g，琼脂粉20g，用 蒸馏水定容至謂Oml， pH7.2~7.4。
6、 按照权禾腰求1戶脱的固体双层平板法，其特征在于，戶腿步骤4)中， 固体无机盐培养基配方为液体无机盐培养基，加入2%重量的琼脂粉；维生素 母液配方为硫胺素10mg、核黄素5mg、维生素B6 5mg、泛酸f丐20mg、对-氨基苯甲酸5mg、烟碱5mg、肌醇100mg，用无菌水定容至1000ml，用0.4(om 滤膜过滤除菌。
7、 按照权利要求1所述的固体双层平板法，其特征在于，所述步骤4)中， 无机盐低熔点琼脂糖培养基配方液体无机盐培养基，加入1%重量的低熔点琼 脂糖。
8、 按照权利要求4、 6或7所述的固体双层平板法，其特征在于，液体无 机盐培养基配方为K2HP。4 2g、 KH2PO40.5g、 NaCl 0.5g、 NH4C10.5g、 MgS04 0.2g、 CaCl210mg、微量元素溶液lml，用蒸馏水定容至1000ml;其中，微量元 素溶液配方为FeS02 '7H202g、 MnS04 'H202g、 Na2MoS04 '2H2O0,5g、 H3B04 0.2g、 CuS04 '5恥0.4g、 ZnS04 0.5g、 NHtVOs 0.2g、 CoCl2 "6恥0.5g、 NiCl2 6H20 0.2g，用蒸馏水定容至lOOOml。
全文摘要
本发明涉及一种快速高通量筛选多环芳烃降解菌的改进固体双层平板法，属于污染土壤生物修复技术领域，适用于多环芳烃污染土壤生物修复微生物资源的挖掘。所采用的固体双层平板法，下层培养基为普通无机盐琼脂培养基添加多种维生素和微量元素；上层培养基为以多环芳烃为唯一碳源的无机盐低熔点琼脂糖培养基，选择低熔点琼脂糖代替普通琼脂制作上层培养基，一方面可防止加入PAHs时由于高温导致的降解或者挥发；另一方面可使降解暗圈更清晰易辨。本发明针对传统降解菌株筛选的盲目性、随机性且工作量大、费时费力等缺点，开发的固体双层平板法，为在实验室中高通量筛选多环芳烃降解菌，挖掘新的生物修复微生物资源提供了一种快速便捷的手段。
文档编号C12Q1/04GK101245366SQ20081001056
公开日2008年8月20日 申请日期2008年3月7日 优先权日2008年3月7日
发明者倪志龙, 史荣久, 颖 张, 张忠泽, 慧 徐, 慧 李, 杨伟超, 陈冠雄, 韩斯琴 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所