专利名称：一种促进降解菌定植于生物膜用于对污染水体的处理方法
技术领域：
本发明涉及一种污水处理技木，特别涉及一种促进降解菌定植于生物膜用于对污染水体的处理方法。
背景技术：
向废水生化处理系统投加特效降解菌的生物强化(bioaugmentation)技术,是去除环境中有毒难降解有机物有效、简便且没有二次污染的方法。多年来能降解不同复杂有机物的微生物资源不断被发现，如中国发明专利CN 101343616 B公开了ー株高坏多环芳烃降解菌及其应用、CN 101638630 B公开了苯こ烯降解菌MJ001及其分离，虽然这些宝贵的降解菌资源已为生物強化处理带了了希望，但仍然存在着投加的降解菌流失或不易定植的问题。
凝集是两个细菌之间通过细胞表面特异的多糖与蛋白质凝集素分子进行的相互吸附，同种细菌间的自凝集和不同种属细菌之间的共凝集在生物膜的形成中发挥着重要的作用，以生物膜形式存在的细菌能更好的停留于水处理系统中。中国发明专利(CN 101255403 B )公开的“一株吡啶降解菌及其应用”，利用了吡啶降解菌同时具有自絮凝(凝集)作用，提高了系统的耐冲击性。Diana等报道了没有降解能力但能与壬基酹降解菌发生共凝集作用的一株芽孢杆菌(ガaciパ 5· sp. VA160)促进了壬基酚的降解效率([J] Research in Microbiology, 2004，155 (9) : 761-769)。大多数细菌一般仅可与其它少数几种细菌发生共凝集。从口腔生物膜中发现能与多种菌发生广泛共凝集能力的架桥细菌一具核梭杆菌iFusobacteriumnucleatum)后([J] FEMS Microbiology Letters, 2000, 182 (I) :57_62)，1997 年 Buswell 等从人工培养的水体生物膜中分离到19株细菌,研究发现藤黄微球菌(Micrococcus Iuteus)能与其中的11株细菌发生明显共凝集，扮演了架桥细菌的角色([J] Journal of AppliedMicrobiology 1997，83，477 - 484) ；2002年Rickard等人从淡水生物膜中分离到19株细菌，发现ガnatatoria 2. I能与其它18个种属的菌株发生特异性凝集([J]Applied and Environmental Microbiology,2002,68 (7) :3644-3650) ;2008 年 Sim5es 等人发现来源于饮用水环境的calcoacticus不仅具有自凝集能力，还能与其它5个分离株中的4个发生共凝集,没有A. calcoacticus则不发生共凝集([J] Appliedand Environmental Microbiology, 2008, 74 (4) :1259 - 1263)。这些有广泛共凝集能力的架桥细菌分属于多个菌属，目前的研究发现其在进化系统中的分布还是比较分散的。在本发明作出之前，在文献“废水处理系统生物膜中细菌的共凝集研究”([J]安徽农业科学，2010,38( 11) : 5752- 5754)中，公开了 2种能与多株细菌发生共凝集作用的架桥细菌，并且证明筛选出的有广泛共凝集能力的2株细菌具有将多株细菌固定于生物膜的功能。中国发明专利(CN 1076323 C)公开的“废水处理方法”，采用在污泥活化工序中，加入含有腐殖物、溶出性硅石、溶出性硅石前驱物中的至少一种填充材料的溶出成分，进行接触混合的技术方案，可以提高活性污泥的凝集吸附カ及絮凝物的形成能力。
现有技术在对架桥细菌的筛选后所达到的效果是自凝集或只能与ー种降解菌发生共凝集，从而提高系统的耐冲击性或一种污染物的降解效率。而有广泛共凝集能力的细菌与多种降解菌组合，并通过凝集条件的改进进一步提高凝集活性，并且用于生物強化的技术还未见报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种能促进多种降解菌定植于生物膜，減少降解菌的流失，維持稳定，有效提高对污染水体治理效果的方法。实现本发明目的的技术方案是ー种促进降解菌定植于生物膜用于对污染水体的处理方法，从生物膜法废水处理池或河道、湖塘水体中采集生物膜样品，筛选具有广泛共凝集能力的架桥细菌，再进行如下步骤
(1)将架桥细菌和降解菌分别在各自的培养基液中培养20 30小吋，离心分离后收集 菌体；
(2)用含有促进共凝集的液体制成OD66tl=I的菌悬液，所述含有促进共凝集的液体为在浓度为O. I O. 2 mo I/L的磷酸缓冲液中含有I 3 mmol的CaCl2 ·2Η20和I 3 mmol的 MgSO4 · 7H20, pH = 7. O 7. 5 ;
(3)按体积比I 3:1将架桥细菌与降解菌的菌悬液混合，静置3小时后，投加到含有毒难降解有机物的生物膜法废水处理池中，或受有毒难降解有机物污染的水域中，投菌量为 I 10% V/Vo架桥细菌的培养基液为在每IL水中，包括蛋白胨5 10 g，酵母粉2 5 g，(NH4)2NO3 I. O I. 5 g’NaCl O. I O. 5 g,MgSO4 ·7Η20 O. I O. 2 g; CaCl2 ·2Η20 O. 05
O.2 g, FeCl3 · 6H20 O. 01 O. 05 g, K2HPO4 O. 5 I. O g，调节 pH =7. 2 7. 4。降解细菌的培养基液为在每IL水中，包括蛋白胨O I. O g，葡萄糖O I. O g，有毒难降解有机物 O. I I g, (NH4)2NO3 I. O I. 5 g，NaCl O. I O. 5g, MgSO4 ·7Η20 O. I
O.2 g; CaCl2 ·2Η20 O. 05 O. 2 g,FeCl3 ·6Η20 O. 01 O. 05g,K2HPO4 O. 5 I g，调节 pH7. 2 7· 4。所述的有毒难降解有机物包括苯、甲苯、苯酚、硝基苯、苯胺、氯苯和吡啶。在受有毒难降解有机物污染的水域中，放置有供生物膜附着生长的填料，所述的填料固定于箱式框架或网袋内。与现有技术相比，本发明的优点是针对废水或污染水体中常常含有多种难降解有机物的现象，采用具有广泛共凝集能力的细菌与多种高效降解菌混合，通过细菌培养条件和共凝集条件的改进，进ー步增强各种功能菌间的共凝集作用，促使多种降解菌固定于生物膜，減少降解菌的流失，維持稳定的降解效果。
图I是在本实施例提供的菌悬液和普通磷酸缓冲液中G5与A3的共凝集率对比曲线 图2是本发明实施例I提供的凝集体菌悬液和对比例接种于反应器后出水中3，5- ニ硝基苯甲酸含量的对比曲线图；图3是本发明实施例2提供的凝集体的扫描电镜照片；
图4是本发明实施例2提供的凝集体菌悬液和对比例投入到水体中后水池出水中苯酚含量的对比曲线图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明技术方案作进ー步的阐述。实施例I
(O共凝集菌(架桥细菌)的培养取事先分离筛选到的有广泛共凝集能力的架桥细^Bacillus cereus G5，分离筛选方法參见文献“废水处理系统生物膜中细菌的共凝集研究”([J]安徽农业科学，2010，38( 11) : 5752- 5754)，经活化培养后接种到架桥细菌培养 液，30°C，150转/分钟培养20小时，离心收集菌体。架桥细菌培养液的配方为在每IL自来水中包括蛋白胨 5 g，酵母粉 5 g，(NH4)2NO3 I. 5 g，NaCl O. I g，MgSO4 · 7H20 0. 2 g;CaCl2 · 2H20 0. 05 g, FeCl3 · 6H20 0. 01 g, K2HPO4 0. 5 g，调节 pH =7. 2。(2)降解菌的培养降解菌可选择使用已报道或通过筛选获得的多种降解菌，如睾丸酮丛毛单胞菌A3，在本实施例中，取事先分离筛选到的具有3，5-ニ硝基苯甲酸细菌Comamonas testosterone A3,具体方法參见文献“3，5- ニ硝基苯甲酸降解菌A3的分离及降解特性”([J]中国环境科学，2007，27(1) :106 110)。经活化培养后接种到降解菌培养液中，A3降降解菌培养液的配方为在每IL自来水中包括蛋白胨O. 5 g，3，5-ニ硝基苯甲酸 O. I g, (NH4)2NO3 I. 5 g, NaCl O. I g, MgSO4 · 7H20 O. 2 g ；CaCl2 · 2H20 O. 05 g,FeCl3 ·6Η20 0.01 g，K2HPO4 I g，调节pH 7.2。细菌培养液温度为30°C，150转/分钟培养20小时，离心收集菌体。(3)凝集体的制备将离心收集的上述2种菌体分别重悬于含2 mmol CaCl2 ·2Η20和2 mmol MgSO4 ·7Η20的O. I mol/L的磷酸缓冲液(pH 7.0)中，调节菌体浓度为OD66tl=I,按I: I体积将上述2种菌悬液混合，静置3小时后，得到G5A3凝集体菌悬液。參见附图I，它是本实施例提供的在G5A3凝集体菌悬液和普通磷酸缓冲液中的G5与A3的共凝集率对比曲线图；由图I可以看出，在本实施例提供的含钙、镁离子的菌悬液中，G5与A3的共凝集效果明显高于不含钙、镁离子的普通磷酸缓冲液。(4)在3个有效容积为5L的反应器中分别加入4个悬浮球填料。按接种量为5%(V/V)，在3反应器中分别投加本实施例提供的G5A3凝集体菌悬液，对比例A3菌悬液和城市生活污水处理厂曝气池含活性污泥的菌悬液。3个反应器接种后闷曝24h，第二天开始每天更换人工合成的废水I L，反应器运行温度28±2°C。人工合成废水的配方为蛋白胨0.2g，3, 5-ニ硝基苯甲酸O. 2 g, (NH4)2NO3 I. 5 g，NaCl O. I g,MgSO4 ·7Η20 O. 2 g; CaCl2CH2OO. 05 g, FeCl3 · 6H20 O. 01 g, K2HPO4 I g,自来水 1L，调节 pH 7. 2 · 4。參见附图2，它是本实施例提供的G5A3凝集体菌悬液和A3菌悬液、含活性污泥的菌悬液接种于反应器后，出水中的3，5-ニ硝基苯甲酸含量的对比曲线图。由图2可以看出，投加G5与A3凝集体的反应器比只投加降解菌A3的反应器对3，5- ニ硝基苯甲酸的降解速度更快，而只接种生活污水处理厂活性污泥的反应器对3，5- ニ硝基苯甲酸的降解最慢。实施例2
(I)共凝集菌的培养按实施例I技术方案分离筛选到具有广泛共凝集能力的架桥细菌Bacillus megaterium TI，经活化培养后接种到架桥细菌培养液，30°C，150转/分钟培养20小时，离心收集菌体。架桥细菌培养液的配方包括蛋白胨5 g，酵母粉2 g，(NH4)2NO3
I.5 g, NaCl O. I g, MgSO4 · 7H20 O. 2 g ；CaCl2 · 2H20 O. 05 g, FeCl3 · 6H20 0. 01 g, K2HPO4
0.5 g,自来水1L，调节pH =7. 4。(2)降解菌的培养取苯酹降解细菌AeWtZofflmas sp. FY_6,具体方法參见文献“苯酚降解菌株FY-6的初步鉴定及苯酚降解特性的研究”([J]科技通报，2009，25 (4)441-444)，经活化培养后接种到降解菌培养液中，降解菌培养液的配方为细菌培养液，30°C，150转/分钟培养20小时，离心收集菌体。降解菌培养液的配方为蛋白胨O. 5 g，苯酚O. 2 g, (NH4)2NO3 I. 5 g，NaCl O. I g,MgSO4 ·7Η20 O. 2 g ;CaCl2 ·2Η20 O. 05 g,FeCl3 ·6Η20
O.01 g，K2HPO4 I g,自来水 1L，调节 pH =7.4。
(3)凝集体的制备将离心收集的上述2种菌体分别重悬于含2 mmol CaCl2 ·2Η20和2 mmol MgSO4 ·7Η20的O. I mol/L的磷酸缓冲液(pH 7. O)中，调节菌体浓度为0D660=1，按I :1体积将2种菌悬液混合3小时，2种菌凝集体的扫描电镜照片见图3，由图3可以看出，共凝集菌ガ.megaterium Tl (大杆菌)与降解菌P (小杆菌)紧密的凝集在一起，形成了较大块的凝集体。(4)在O. 5 m3的水池中引入河水并在河水中加入苯酹,使苯酹浓度达到250mg/L,池水深O. Sm，将直径8cm的悬浮球填料装入长方形网袋，扎紧网袋ロ，使悬浮球填料在网袋内堆叠5 10层，同时在网袋上系几根挂了砖石的尼龙绳，使网袋位于水面下20cm左右的位置，将本实施例步骤(3)制得的广泛共凝集菌与降解菌的凝集体液按2%d的比例投加到已放置生物膜填料的水池内，使共凝集体在沉降的过程中附着到层层堆叠的悬浮球填料上，2天后将池子中的水全部排空(待附着在填料表面的凝集体形成微小菌落)，重新换上添加苯酹至250mg/L的河水(以此为O天)，I天后姆天更换添加苯酹至250mg/L的河水50L,运行过程中每隔12小时开启I次水循环泵，毎次I小时，水温为24 28°C，第5天时水池出水中苯酚含量为50mg/L，以相同处理方式但不投加共凝集体的水池和只投加降解菌P的水池为对比例，出水中苯酚含量见图4。由图4可以看出，没有投加降解菌的水池中，苯酚降解情况最差，排空池水后，运行到第3天时苯酚浓度较高为241. 3mg/L ;只投加降解菌的水池中，苯酚的降解情况比没投加降解菌的水池略好ー些，第3天时苯酚浓度较高为203. 2mg/L，说明大多数降解菌在排空池水的时候流失掉了 ；在投加架桥细菌Tl与降解菌的凝集体的水池中，苯酚的降解效果最好，第3天出水中苯酚含量为94. 3mg/L，说明在排空池水吋，由于共凝集菌促使降解菌已定植于填料表面，降解菌没有随着排空池水流失掉，在以后的24天里，出水中的苯酚含量始終保存在较低的浓度，说明降解菌一直存在于水池中。实施例3
(I)按常规微生物学实验方法，将事先培养获得的具有广泛共凝集能力的细菌和降解菌划线接种至LB试管斜面，30°C培养24小吋。(2)挑取试管上的菌体接种到装有IOOmL LB液体培养基的250 mL的三角瓶中，30°C，150转/分钟振荡培养24小时。(3)按10%接种量将三角瓶内的菌种分别接种到装有300 mL LB液体培养基的1000 mL的三角瓶中，30°C，150转/分钟振荡培养24小时。(4)收集2种菌体的菌悬液，6000转/分钟离心，分别用含2 mmol CaCl2 ·2Η20和2 mmol MgSO4 · 7H20mol/L的0. I磷酸缓冲液(pH 7. O)制成OD66tl=I的菌悬液,两种菌悬液按I: I比例混合，静置3小吋，使广泛共凝集菌与降解菌的进行共凝集，形成共凝集体。(5)按实施例I或2的技术方案将共凝集体投加到含有毒难降解有机物的生物膜法废水处理池中，或受有毒难降解有机物污染的水域中，对废水或污染水体进行生物治理。 ·
权利要求
1.一种促进降解菌定植于生物膜用于对污染水体的处理方法，从生物膜法废水处理池或河道、湖塘水体中采集生物膜样品，筛选具有广泛共凝集能力的架桥细菌，其特征在于再进行如下步骤 (1)将架桥细菌和降解菌分别在各自的培养基液中培养20 30小吋，离心分离后收集菌体； (2)用含有促进共凝集的液体制成OD66tl=I的菌悬液，所述含有促进共凝集的液体为在浓度为O. I O. 2 mo I/L的磷酸缓冲液中含有I 3 mmol的CaCl2 ·2Η20和I 3 mmol的 MgSO4 · 7H20, pH = 7. O 7. 5 ; (3)按体积比I 3:1将架桥细菌与降解菌的菌悬液混合，静置3小时后，投加到含有毒难降解有机物的生物膜法废水处理池中，或受有毒难降解有机物污染的水域中，投菌量为 I 10% V/Vo
2.根据权利要求I所述的ー种促进降解菌定植于生物膜用于对污染水体的处理方法，其特征在于架桥细菌的培养基液为在每IL水中，包括蛋白胨5 10 g，酵母粉2 5 g, (NH4)2NO3 I. O I. 5 g, NaCl O. I O. 5 g, MgSO4 · 7H20 O. I O. 2 g; CaCl2 · 2H20.0.05 O. 2 g, FeCl3 · 6H20 O. 01 O. 05 g, K2HPO4 O. 5 I. O g，调节 pH =7. 2 7. 4。
3.根据权利要求I所述的ー种促进降解菌定植于生物膜用于对污染水体的处理方法，其特征在于降解细菌的培养基液为在每IL水中，包括蛋白胨O I. O g，葡萄糖O .1.O g，有毒难降解有机物 O. I I g，(NH4)2NO3 I. O I. 5 g，NaCl O. I O. 5g，MgS04 ·7Η20.O. I O. 2 g; CaCl2 · 2H20 O. 05 O. 2 g, FeCl3 · 6H20 O. 01 O. 05g, K2HPO4 O. 5 I g,调节pH 7. I . 4。
4.根据权利要求I所述的ー种促进降解菌定植于生物膜用于对污染水体的处理方法，其特征在于所述的有毒难降解有机物包括苯、甲苯、苯酚、硝基苯、苯胺、氯苯和吡啶。
5.根据权利要求I所述的ー种促进降解菌定植于生物膜用于对污染水体的处理方法，其特征在干在受有毒难降解有机物污染的水域中，放置有供生物膜附着生长的填料，所述的填料固定于箱式框架或网袋内。
全文摘要
本发明公开了一种促进降解菌定植于生物膜用于对污染水体的处理方法。筛选具有广泛共凝集能力的架桥细菌和降解菌，分别收集菌体，用含有CaCl2·2H2O和MgSO4·7H2O促进共凝集的液体制成OD660=1的菌悬液，将架桥细菌与降解菌的菌悬液混合后，投加到含有毒难降解有机物的生物膜法废水处理池中，或受有毒难降解有机物污染的水域中。本发明针对废水或污染水体中常常含有多种难降解有机物的现象，采用具有广泛共凝集能力的细菌与多种高效降解菌混合，通过细菌培养条件和共凝集条件的改进，进一步增强各种功能菌间的共凝集作用，促使多种降解菌固定于生物膜，减少降解菌的流失，维持稳定，有效提高了对污染水体的治理效果。
文档编号C02F3/34GK102826661SQ20121034631
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者李蒙英 申请人:苏州大学