一种胶原生物膜及其制备方法与流程

本发明涉及生物医用材料技术领域，特别涉及一种胶原生物膜及其制备方法。

背景技术：

胶原(Collagen)作为一种生物高分子是动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％。与组织的形成、成熟、细胞间信息的传递，以及关节润滑、伤口愈合、钙化作用、血液凝固和衰老等有着密切的关系。胶原也是生物科技产业最具关键性的原材料之一，在医学材料、化妆品、食品工业等均有着广泛应用。在空间结构上，胶原显示出特殊的三股螺旋缠绕的结构，三条相互独立的胶原蛋白肽链依靠甘氨酸之间形成的氢键维系三股螺旋相互缠绕的结构。胶原这种特殊的三股螺旋结构保证了它的机械强度。胶原纤维是胶原行使生理作用的基本形态，在生物体内胶原纤维交织成富有机械强度和弹性的网状结构成为结缔组织最基本的组成成分。

硬脑膜是保护脑组织的一道重要屏障，对于维护神经系统的结构及功能活动意义重大。手术修补硬膜、封闭硬膜下腔，可明显减少或预防脑脊液漏、颅内感染、癫瘸等症状。因此神经外科手术后保持硬脑膜层完整是必要的。创伤、肿瘤侵蚀及手术过程硬脑膜皱缩等因素均可造成硬脑膜的缺损，使得原位关闭硬膜下腔无法完成，此外，神经外科的减压术通常需要扩大膜下腔。此类情况通常需要使用硬脑膜替代材料完成硬膜修复。

天然材料及人工合成材料作为硬脑膜替代品分为可吸收材料和不可吸收材料，此类材料容易制成需要的形状和大小，容易消毒，不担心传递疾病的风险。

可吸收材料可在体内最终降解、吸收，由生成的新脑膜替代修复脑膜缺损。胶原基质通常提取于牛、猪等动物的跟腱或皮肤，可作为硬脑膜修补材料，是一种可吸收的生物材料，与人硬膜主要成分类似，其主要成分是Ⅰ型胶原蛋白。脑膜替代品目前已经以多种形态如膜、薄片、海绵进行实验及临床应用。来自动物的Ⅰ型胶原分子的尾肽经酶处理去除后具有极低的免疫原性，并可诱导成纤维细胞粘附增生以及膜的血管化，从而加速植入材料自体化过程。从理论上讲，胶原作为一种可吸收材料是最理想的脑膜替代材料。

因此，需要高质量的胶原生物膜作为硬脑膜和脊柱膜等的替代品。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供了一种胶原生物膜及其制备方法。技术方案如下：

在第一方面，本发明提供了一种胶原生物膜，胶原生物膜中的胶原具有三股螺旋结构；胶原生物膜的厚度为0.2-0.9cm，具有三维孔径结构，孔径的大小为60-300mm。

在第二方面，本发明提供了上述胶原生物膜的制备方法，包括以下步骤，

将胶原与水混合，向其中加入乳酸溶液和/或盐酸溶液，使胶原均匀分散，制成浆液；

调节所述浆液的pH值至5.5-6.5，之后对所述浆液真空脱泡，然后进行冷冻干燥；

采用物理和/或化学方法交联，即获得胶原生物膜。

在本发明的一种优选实施方式中，所述胶原在所述浆液中的质量分数为0.3％-1.5％。

在本发明的一种优选实施方式中，所述浆液的pH值为2.8-3.8。

在本发明的一种优选实施方式中，所述冷冻干燥为在真空度为120-250毫托的条件下，4-10℃保持40min，-45--35℃保持120-210min，0℃保持20-24h，20-25℃保持2-9h。

在本发明的一种优选实施方式中，所述物理交联方法为：采用254nm的紫外线照射7-13h，或者所述物理交联方法为：在真空条件下100-120℃脱水处理2-3天，之后降温至50℃以下；所述化学交联方法为：采用甲醛气体交联。

在本发明的一种优选实施方式中，所述胶原由以下步骤制得：

先对牛跟腱进行切片；

再将切片的牛跟腱浸泡在无花果蛋白酶的质量分数为0.005％-0.2％的磷酸盐缓冲液中，在4-15℃下保持12-24h；

然后向所述磷酸盐缓冲液中加入氧化剂，用水冲洗所述切片的牛跟腱；所述氧化剂选自亚氯酸盐和过氧化氢中的至少一种；

最后将所述切片的牛跟腱浸泡在氢氧化钠摩尔浓度为1-2mol/L的盐溶液中，在4-15℃下保持1-4天，之后调节所述盐溶液的pH值为4-7，收集产物，对产物进行反复清洗，脱水处理，获得胶原。

在本发明的一种更优选实施方式中，所述无花果蛋白酶的质量分数为0.05％-0.1％；所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为5-7，磷酸根的摩尔浓度为0.01-0.1mol/L。

在本发明的一种更优选实施方式中，所述氧化剂的加入体积为所述磷酸盐缓冲液的1‰-5‰；所述氧化剂为过氧化氢。

在本发明的一种更优选实施方式中，基于所述盐溶液的总质量，所述盐的质量分数为10％-30％；所述盐溶液中的盐选自氯化钠、硫酸钠、碳酸钠中的至少一种。

在本发明的一种更优选实施方式中，在对牛跟腱进行切片之前，先对所述牛跟腱进行预处理；所述预处理为用水对牛跟腱进行反复冲洗，之后用质量分数为20％-75％乙醇溶液漂洗15-45min，用水反复冲洗。

本发明实施例提供的技术方案的有益效果是：本发明提供的胶原生物膜不但保持了胶原的生物学优良性能，即三股螺旋结构，机械强度高，而且可吸收，免疫原性低，有助于组织生长，促进修复，降解可控等优点，可作为硬脑膜和脊柱膜等的替代品。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一示例性实施例示出的胶原生物膜的扫描电镜图；

图2为本发明一示例性实施例示出的胶原生物膜的制备方法中胶原的SDS-PAGE电泳图；

图3为本发明一示例性实施例示出的胶原生物膜的制备方法中胶原的红外光谱图；

图4为本发明一示例性实施例示出的胶原生物膜的制备方法中胶原的紫外光谱图。

具体实施方式

为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

在第一方面，如图1所示，本发明提供了一种胶原生物膜，胶原生物膜中的胶原具有三股螺旋结构；胶原生物膜的厚度为0.2-0.9cm，优选地，胶原生物膜的厚度为0.5cm；具有三维孔径结构，孔径的大小为60-300mm，优选地，孔径的大小为120-250mm。

本发明提供的胶原生物膜不但保持了胶原的生物学优良性能，即三股螺旋结构，机械强度高，而且可吸收，免疫原性低，有助于组织生长，促进修复，降解可控等优点，可作为硬脑膜和脊柱膜等的替代品。

在第二方面，本发明提供了一种胶原生物膜的制备方法，包括以下步骤，

将胶原与水混合，向其中加入乳酸溶液和/或盐酸溶液，使胶原均匀分散，制成浆液；

调节所述浆液的pH值至5.5-6.5，之后对所述浆液真空脱泡，然后冷冻干燥；

采用物理和/或化学方法交联，即获得胶原生物膜。

本发明的胶原生物膜的制备方法，将胶原与水混合，向其中加入乳酸溶液和/或盐酸溶液，使胶原呈现细长纤维状，浆液呈现透明的状态；将浆液的pH调至5.5-6.5是为了冻干后形成的胶原海绵的pH值近中性，接近于人体的pH值；选择乳酸和盐酸溶解胶原，即便乳酸和盐酸在胶原生物膜上有残留，由于乳酸是人体自身代谢物质，盐酸能生成氯化钠，所以二者的残留对人体无碍。因此，本发明的胶原生物膜的制备方法符合人体的需要。不仅如此，利用本发明提供的胶原生物膜的制备方法制备的胶原生物膜，保持了胶原原有的三股螺旋结构，具有机械强度高，而且可吸收，免疫原性低，有助于组织生长，促进修复，降解可控等优点，可作为硬脑膜和脊柱膜等的替代品。此外，该制备方法过程简单。

在实际应用中，本发明提供的胶原生物膜的制备方法的胶原可以来源于牛、猪等动物的跟腱或皮肤，优选为牛跟腱。

还有，在实际应用中，可以使用低浓度氢氧化钠溶液，如0.5mol/L的氢氧化钠将浆液的pH值调节至5.5-6.5，在该pH范围内，冷冻干燥后形成的胶原海绵的pH值近中性，即接近人体的pH值。

再有，将胶原均匀分散到乳酸溶液和/或盐酸溶液中，若发现有不溶物质，可以过滤处理，具体可以利用40目的不锈钢的滤布过滤两次。

作为本发明的一种改进的实施方式，所述胶原在所述浆液中的质量分数为0.3％-1.5％。所述乳酸溶液中乳酸的摩尔浓度为0.01-0.05mol/L；所述盐酸溶液中盐酸的摩尔浓度为0.05-0.1mol/L。优选地，所述浆液的pH值为2.8-3.8，在此pH值范围内，浆液澄清透明度高，而且在后续调节pH值时，减少碱的用量，即盐离子的用量和残留，获得高纯度的免疫原性更低的胶原生物膜。

作为本发明的另一种改进的实施方式，所述冷冻干燥为在真空度为120-250毫托的条件下，4-10℃保持40min，-45--35℃保持120-210min，0℃保持20-24h，20-25℃保持2-9h。此冷冻干燥条件有利于胶原生物膜保持胶原具有三股螺旋结构，并且更好的控制胶原生物膜的厚度和三维孔径结构。

在具体的实施方式中，优选地，所述物理交联方法为：采用254nm的紫外线照射7-13h，或者所述物理交联方法为：在真空条件下100-120℃脱水处理2-3天，之后降温至50℃以下。真空干燥这种重度脱水的方法可以提高胶原的稳定性，防止组织胶原基质塌陷，通过脱水，缩短了胶原活性基之间的距离，导致胶原分子之间发生交联，提高了变性温度，降低了其自由氨基酸的含量，从而提高了胶原的机械强度。

在具体的实施方式中，优选地，所述化学交联方法为：采用甲醛气体交联。

在实际应用中，可以采用质量分数为5％-30％的甲醛溶液发挥出的甲醛气体对冻干后的胶原进行交联改性，通常时间为3-5h。

采用本发明提供的物理或化学交联方法改性后，有利于提高胶原材料的拉伸强度及抗降解能力，降低其膨胀率，改善胶原的抗水性等。

作为本发明的再一种改进的实施方式，所述胶原由以下步骤制得：

先对牛跟腱进行切片；

再将切片的牛跟腱浸泡在无花果蛋白酶的质量分数为0.005％-0.2％的磷酸盐缓冲液中，在4-15℃下保持12-24h；

然后向所述磷酸盐缓冲液中加入氧化剂，用水冲洗所述切片的牛跟腱；所述氧化剂选自亚氯酸盐和过氧化氢中的至少一种；

最后将所述切片的牛跟腱浸泡在氢氧化钠摩尔浓度为1-2mol/L的盐溶液中，在4-15℃下保持1-4天，之后调节所述盐溶液的pH值为4-7，收集产物，对产物进行反复清洗，脱水处理，获得胶原。

本发明提供的一种胶原生物膜的制备方法，先将牛跟腱切成薄片，使胶原容易从牛跟腱中释放出来，再用无花果蛋白酶进行酶水解，使紧致的切片的牛跟腱变得松散，对其中的胶原进行初步提取，无花果蛋白酶是植物来源的蛋白酶不但具有很好的提取胶原的效果，人体对其不具有排异性，而且相对于动物来源的蛋白酶避免了免疫原干扰。磷酸盐缓冲溶液为无花果蛋白酶的活性提供适宜条件。然后用氢氧化钠进行碱水解，一定浓度的氢氧化钠可以去除牛跟腱自身携带的朊病毒等致病因素，并能进一步使胶原从牛跟腱中解离出来，一定浓度的盐溶液使解离出的胶原处于不溶状态，并容易与其它杂质和溶液分离，而且有效地防止胶原水解成胶原蛋白。将温度严格控制在4-15℃是为了防止高温时胶原降解。对产物反复清洗是除去胶原上的各种离子，再脱水，获得高纯度的三股螺旋结构完整的胶原。

需要说明的是，在碱水解疏松的牛跟腱的过程中可以轻微振荡或晃动，但不能用力搅拌，防止机械外力使胶原的肽链断裂。

需要进一步说明的是，将盐溶液的pH值调节至4-7，优选为6-7，具体操作，向盐溶液中滴加酸来调节pH值，摩尔浓度为0.05-2mol/L的硫酸溶液、盐酸溶液或乙酸溶液等。

在实际应用中，先对牛跟腱进行切片，再用水反复冲洗，去除水分。将牛跟腱切片是为了更容易提取其中的胶原。用水反复冲洗，是为了进一步去除切片牛跟腱含有的杂质。

还有，在对牛跟腱进行切片之前，先对牛跟腱进行预处理，预处理的步骤具体可以为：用水对牛跟腱进行反复冲洗，之后用质量分数为20％-75％乙醇溶液漂洗15-45min，用水反复冲洗。对整根的牛跟腱初步进行除杂，洗去表面的血污尘土等杂质，质量分数为20％-75％乙醇溶液对血污去除效果比较好，并且还能消毒杀菌，优选为质量分数为65％-75％的乙醇溶液，更优选为质量分数75％的乙醇溶液。经过漂洗，牛跟腱会变得更白，后续获得的胶原也会更白更纯。

再有，切片可以为冷冻切片，将牛跟腱于-20℃冷冻过夜，大致为7-12h，更容易将牛跟腱切成薄片，具体可以使用切片机将牛跟腱切成厚度为1-3mm的薄片。

此外，亚氯酸盐优选为亚氯酸钠。亚氯酸钠更容易在后续水洗过程中去掉。

为了增强无花果蛋白酶的水解效果，同时减少试剂成本，优选地，无花果蛋白酶在磷酸盐缓冲液中的质量分数为0.05％-0.1％。

为了进一步增强无花果蛋白酶的水解效果，为无花果蛋白酶发挥其酶水解作用提供更适宜的条件和环境，磷酸盐缓冲溶液的pH值为5-7，优选为pH值5.8-6.5，更优选为pH值6.4；磷酸根的摩尔浓度为0.01-0.1mol/L，更优选为0.02-0.06，更优选为0.03mol/L。磷酸盐缓冲液可以由磷酸二氢钾、磷酸一氢钾、磷酸二氢钠和磷酸一氢钠中的至少一种配制而成。

作为本发明的一种改进的实施方式，氧化剂优选为过氧化氢。过氧化氢是一种氧化性很强的氧化剂，可将无花果蛋白酶灭活，同时分解成氧气和水，不会向胶原中引入其他离子。

作为本发明的一种进一步改进的实施方式，氧化剂的加入体积为磷酸盐缓冲液的1‰-5‰。此加入量即可使无花果蛋白酶完全灭活。

作为本发明的另一种改进的实施方式，基于所述盐溶液的总质量，所述盐的质量分数为10％-30％。此浓度范围，更有利于胶原从盐溶液中析出，防止胶原发生水解而生成胶原蛋白。

作为本发明的再一种改进的实施方式，盐溶液中的盐选自氯化钠、硫酸钠、碳酸钠中的至少一种。

对本发明提供的胶原生物膜进行包装灭菌。低温环氧乙烷消毒灭菌具体：冷冻干燥的海绵按照要求的规格大小裁剪后双层包装，100％环氧乙烷灭菌处理；预真空为-50--60Kpa；灭菌湿度为55-74％RH；灭菌温度为35-39℃；换气次数为10次，灭菌时间3-9h，优化的灭菌时间4-8h；灭菌结束后测定无菌和环氧乙烷残留，确认样品无菌并且环氧乙烷残留符合规定要求。

需要说明的是，本发明所使用的水均为医药行业所用的纯化水，满足药典标准。

试剂和仪器

试剂均市售可得。

实施例1-4提取胶原

实施例1

选取新鲜的牛跟腱组织1kg，水冲洗6次，75％酒精漂洗20min；用剪刀剔除筋膜和杂质，水洗后，-20℃冷冻过夜；切片机切片至约1mm，备用；

称取100g腱片，纯化水冲洗5次；5L的纯化水室温浸泡5h；纯化水冲洗5次，滤干水分备用；

清洗后的腱片(即切片的牛跟腱)浸泡在含有0.05％无花果蛋白酶的pH值为6的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液中，在4℃下浸泡24小时后；向其中加入体积为磷酸盐缓冲液体积的3‰的过氧化氢混匀后静置4h灭活无花果蛋白酶，纯化水冲洗；然后在4℃条件下，1M的氢氧化钠的氯化钠溶液中浸泡4天，静置中间轻轻晃动；滴加0.05mol/L的盐酸，调整pH至6；过滤收集胶原沉淀；纯化水冲洗胶原5次，4000转/min离心20min，得到胶原样品。

如图2所示，十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)检测胶原的分子量约为30万道尔顿。

实施例2

选取新鲜的牛跟腱组织1kg，水冲洗9次，45％酒精漂洗30min；用剪刀剔除筋膜和杂质，水洗后，-20℃冷冻过夜；切片机切片至约2mm，备用；

称取100g腱片，纯化水冲洗5次；5L的纯化水室温浸泡3h；纯化水冲洗5次，滤干水分备用；

清洗后的腱片(即切片的牛跟腱)浸泡在含有0.005％无花果蛋白酶的pH值为5的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，在4℃下浸泡24小时后；向其中加入体积为磷酸盐缓冲液体积的1‰的亚氯酸钠混匀后静置4h灭活无花果蛋白酶，纯化水冲洗；然后在4℃条件下，1.5M的氢氧化钠的氯化钠溶液中浸泡4天，静置中间轻轻晃动；滴加0.05mol/L的盐酸，调整pH至5；过滤收集胶原沉淀；纯化水冲洗胶原9次，4000转/min离心20min，得到胶原样品。

十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)检测胶原的分子量约为30万道尔顿。

实施例3

选取新鲜的牛跟腱组织1kg，水冲洗3次，20％酒精漂洗40min；用剪刀剔除筋膜和杂质，水洗后，-20℃冷冻过夜；切片机切片至约3mm，备用；

称取100g腱片，纯化水冲洗5次；5L的纯化水室温浸泡3h；纯化水冲洗5次，滤干水分备用；

清洗后的腱片(即切片的牛跟腱)浸泡在含有0.1％无花果蛋白酶的pH值为5的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，在15℃下浸泡24小时后；向其中加入体积为磷酸盐缓冲液体积的4‰的过氧化氢混匀后静置5h灭活无花果蛋白酶，纯化水冲洗；然后在15℃条件下，1.5M的氢氧化钠的氯化钠溶液中浸泡4天，静置中间轻轻晃动；滴加0.05mol/L的硫酸，调整pH至4；过滤收集胶原沉淀；纯化水冲洗胶原10次，4000转/min离心20min，得到胶原样品。

十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)检测胶原的分子量约为30万道尔顿。

实施例4

选取新鲜的牛跟腱组织1kg，水冲洗3次，65％酒精漂洗25min；用剪刀剔除筋膜和杂质，水洗后，-20℃冷冻过夜；切片机切片至约3mm，备用；

称取100g腱片，纯化水冲洗5次；5L的纯化水室温浸泡3h；纯化水冲洗5次，滤干水分备用；

清洗后的腱片(即切片的牛跟腱)浸泡在含有0.2％无花果蛋白酶的pH值为7的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中，在10℃下浸泡24小时后；向其中加入体积为磷酸盐缓冲液体积的5‰的过氧化氢混匀后静置5h灭活无花果蛋白酶，纯化水冲洗；然后在10℃条件下，2M的氢氧化钠的氯化钠溶液中浸泡4天，静置中间轻轻晃动；滴加0.05mol/L的硫酸，调整pH至7；过滤收集胶原沉淀；纯化水冲洗胶原8次，4000转/min离心20min，得到胶原样品。

十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)检测胶原的分子量约为30万道尔顿。

实施例5胶原的结构检测

图3为实施例1提取的胶原样品的红外光谱图。从图3可知，1653.9cm^-1为酰胺I带的C＝O伸缩振动吸收峰，说明样品中都存在形成三股螺旋内氢键的C＝O；1552.6cm^-1为酰胺II带的N-H弯曲振动吸收峰；1239.1cm^-1为酰胺III带的N-H变形峰；1239.1cm^-1～1452.2cm^-1范围存在的吸收峰表明胶原三螺旋结构的完整性；3422.8cm^-1为胶原的N-H伸缩振动峰，说明肽链间氢键的存在；1239.1cm^-1与1452.4cm^-1的吸收峰强度比值为1.02，非常接近胶原特征值1.0。由此可见，本发明所制备的胶原主要为Ⅰ型胶原，Ⅰ型胶原的三股螺旋结构是保持较完整的。本发明提供的一种从牛跟腱中提取胶原的方法可保持胶原的三股螺旋结构的完整。

实施例6胶原的纯度检测

图4为实施例1提取的I型胶原样品的紫外吸收光谱图。从图4中可以看出，纯化得样品在波长217nm处有紫外光谱最大吸收峰值，峰面积为0.375。

由上述实施例可知，胶原三股螺旋结构完整性好，纯度高，并且胶原的提取方法简单，无需高端设备，提取成本低。

实施例7至实施例11胶原生物膜的制备

实施例7

将胶原加入到水中，并滴加0.01M(mol/L)乳酸溶液，调节pH为3.0，乳化泵6000rpm，高速混匀5min，制成浆液，胶原在浆液中的质量分数为0.3％；40目不锈钢滤布过滤两次，去除不溶的物质；缓慢滴加低浓度(0.5M)的氢氧化钠溶液调节液体的pH至5.5；过滤并真空脱泡，将制备好的浆液倒入托盘，在真空度为120毫托的条件下，10℃保持40min，-45℃保持150min，0℃保持20h，20℃保持5h进行冷冻干燥，得到胶原海绵。

用化学方法交联，质量分数为10％的甲醛溶液所挥发的甲醛中保持4h，得到成品，即胶原生物膜。

实施例8

将胶原加入到水中，并滴加0.03M(mol/L)乳酸溶液，调节pH为3.0，乳化泵8000rpm，高速混匀5min，制成浆液，胶原在浆液中的质量分数为0.5％；40目不锈钢滤布过滤两次，去除不溶的物质；缓慢滴加低浓度(0.5M)的氢氧化钠溶液调节液体的pH至6；过滤并真空脱泡，将制备好的浆液倒入托盘在真空度为120毫托的条件下，10℃保持40min，-35℃保持120min，0℃保持22h，25℃保持9h进行冷冻干燥，得到胶原海绵。

用化学方法交联，质量分数为10％的甲醛溶液所挥发的甲醛中保持5h，得到成品。

实施例9

将胶原加入到水中，并滴加0.05M(mol/L)乳酸溶液，调节pH为3.8，乳化泵8000rpm高速混匀5min，制成浆液，胶原在浆液中的质量分数为1.0％；40目不锈钢滤布过滤两次，去除不溶的物质；缓慢滴加低浓度(0.5M)的氢氧化钠溶液调节液体的pH至6.5；过滤并真空脱泡，将制备好的浆液倒入托盘，在真空度为220毫托的条件下，6℃保持40min，-38℃保持180min，0℃保持24h，24℃保持7h进行冷冻干燥，得到胶原海绵。

用化学方法交联，气体交联，质量分数为10％的甲醛溶液挥发的甲醛气体中保持5h，得到成品(如图1所示)。

实施例10

将胶原加入到水中，并滴加0.03M(mol/L)盐酸溶液，调节pH为3.0，乳化泵8000rpm，高速混匀5min，制成浆液，胶原在浆液中的质量分数为0.5％；40目不锈钢滤布过滤两次，去除不溶的物质；缓慢滴加低浓度(0.5M)的氢氧化钠溶液调节液体的pH至5.8；过滤并真空脱泡，将制备好的浆液倒入托盘，在真空度为150毫托的条件下，10℃保持40min，-45℃保持150min，0℃保持20h，20℃保持5h进行冷冻干燥，得到胶原海绵。

用物理方法交联，120℃，真空48h，得到成品。

实施例11

将胶原加入到水中，并滴加0.05M(mol/L)乳酸溶液，调节pH为2.8，乳化泵8000rpm，高速混匀5min，制成浆液，胶原在浆液中的质量分数为1.0％；40目不锈钢滤布过滤两次，去除不溶的物质；缓慢滴加低浓度(0.5M)的氢氧化钠溶液调节液体的pH至6.2；过滤并真空脱泡，将制备好的浆液倒入托盘冷冻，在真空度为150毫托的条件下，10℃保持40min，-45℃保持150min，0℃保持24h，25℃保持8h进行干燥得到胶原海绵。

用物理方法交联，100℃，真空72h，得到成品。

对实施例7至实施例11所制备的胶原生物膜进行电镜扫描检测，结果如表1所示。

表1实施例7至11的胶原生物膜的电镜扫描结果

由表1和图1可知，胶原生物膜厚度约为0.2-0.9厘米，具有三维孔径结构，孔径大小为60-300微米。

实施例12动物实验

将新西兰兔分随机分为a、b、c，3组，每组12只，于冠状缝后，中线右侧用电钻磨1骨窗，暴露硬脑膜并人为造成硬脑膜缺损，a、b、c，三组中的4只兔应用实施例9制备的胶原生物膜，4只兔应用上市产品(integra，作为对照)进行硬膜缺损修补，4只不予修补。a、b、c三组分别于术后30天、90天、180天处死。术前及处死前采集各组静脉血lml进行白细胞、淋巴细胞计数。术后对动物进行临床观察至预定日期处死，然后扩展开窗，连同硬脑膜、修补材料和脑组织取下，进行标本大体观察，并判断修补材料内表面与脑组织粘连程度。将标本一部分固定于质量分数为10％的福尔马林中1周，石蜡包埋，切片行苏木素—伊红染色，行组织学检查，对比观察植入材料局部细胞浸润情况观察局部蛛网膜、硬膜下腔、及脑皮质情况。

结论：临床观察各组动物除未进行修补的样品外无脑脊液漏发生，未发现动物出现术后并发症，我们的产品与对照样品有相似的修补性能。各组动物术前、处死前的白细胞总数、淋巴细胞计数无显著差异(P>0.05)。术后30天、90天180天两种脑膜脑粘连差异无统计学意义(P>0.05)。各组病理检查移植物无变性、包裹、钙化；各组动物硬膜修补局部均可见不同程度硬膜下腔及蛛网膜病理改变，各组植入材料(胶原生物膜)局部炎症细胞浸润无显著差异(P>0.05)。

以上所述仅是为了便于本领域的技术人员理解本发明的技术方案，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。