本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种G蛋白信号转导调节蛋白10(RegulatorofG-proteinsignaling10,RGS10)在治疗脂肪肝、Ⅱ型糖尿病中的功能和应用，具体是在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物中应用。
背景技术：
：近年来，随着我国经济不断发展，人均寿命逐年延长，脂肪肝和Ⅱ型糖尿病等慢性非传染性疾病的发病率显著上升。据统计，在我国20岁以上人群中，Ⅱ型糖尿病患病率为9.7％，为最常见的慢性内分泌系统疾病。其是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染和精神因素等多种因素引发的机体胰岛功能减退、胰岛素抵抗，最终导致糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，多在35～40岁之后发病，占糖尿病患者90％以上。非酒精性脂肪肝(NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损伤肝因素造成的以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病例综合征，常演变成肝硬化和肝癌。调查显示，我国普通人群NAFLD的患病率介于6.3％-27.0％之间，而在肥胖及Ⅱ型糖尿病患者中更是高达60％以上。研究表明，NAFLD和Ⅱ型糖尿病均能显著增加心脑血管病、慢性肾脏病乃至全因死亡的风险。随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，Ⅱ型糖尿病合并NAFLD的患病率正逐年增加。NAFLD患者Ⅱ型糖尿病或空腹血糖损害的发生率高达18％～33％，而Ⅱ型糖尿病患者的NAFLD发生率更是高达49％～62％。NAFLD的发生多与肥胖、血脂异常、糖耐量异常和胰岛素抵抗等并存，提示NAFLD与Ⅱ型糖尿病密切相关。糖尿病可能是发展为NAFLD的一个独立的危险因素，Ⅱ型糖尿病继发于NAFLD的风险也增加。改善NAFLD可以减少糖尿病的发生发展。这启示医生在临床上不能将这两个疾病孤立看待，而且为了预防糖尿病的发生，更应重视对脂肪肝的治疗。G蛋白信号转导调节蛋白(RGS)是一种能直接与激活的Gɑ亚基结合，发挥GTPase激活作用，从而终止G蛋白信号转导通路的一类多功能蛋白质家族。其自发现以来，一直是生物领域的研究热点之一。所有的RGS蛋白都有一个共同的，同源的RGS区域，被分为6个显著不同的亚家族。RGS10是RGS蛋白中R12家族的一种，广泛分布于脑、心脏、肝脏、睾丸、脾等组织中。目前已有研究发现RGS10在心肌肥厚、卵巢癌耐药性、神经细胞凋亡、破骨细胞分化及炎症细胞粘附等方面发挥着重要的作用。涉及的信号通路包括：通过抑制MEK-ERK1/2信号通路改善心肌肥厚；通过抑制AKT信号通路的激活来改善卵巢癌细胞对化疗药物的耐药性；通过下调NF-Kβ通路P65磷酸化及上调CREB活性保护脂多糖刺激的神经元细胞等。不过，关于其在脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的作用仍不清楚，还有待进一步研究。参考文献：1.中华医学会糖尿病学分会.中国2型糖尿病防治指南(2013年版).中华内分泌代谢杂志,2014,30(10):893-942.2.StrebaLA,VereCC,RogoveanuI,etal.Nonalcoholicfattyliverdisease,metabolicriskfactors,andhepatocellularcarcinoma:Anopenquestion.WorldJGastroenterol,2015,21(14):4103-10.3.杨蕊旭,范建高.非酒精性脂肪性肝病的流行现状.临床内科杂志.2015(5):293-6.4.ShiKQ,WuFL,LiuWY,etal.Non-alcoholicfattyliverdiseaseandriskofin-stentrestenosisafterbaremetalstentinginnativecoronaryarteries.Molecularbiologyreports.2014Jul1；41(7):4713-20.5.MussoG,GambinoR,TabibianJH,etal.Associationofnon-alcoholicfattyliverdiseasewithchronickidneydisease:asystematicreviewandmeta-analysis.PLoSMed.2014Jul22；11(7):e1001680.6.MiaoR,LuY,XingX,LiY,HuangZ,ZhongH,HuangY,ChenAF,TangX,LiH,CaiJ.RegulatorofG-proteinsignaling10negativelyregulatescardiacremodelingbyblockingmitogen-activatedproteinkinase–extracellularsignal-regulatedproteinkinase1/2signaling.Hypertension.2016；67(1):86-98.7.HooksSB,CallihanP,AltmanMK,HurstJH,AliMW,MurphMM.RegulatorsofG-ProteinsignalingRGS10andRGS17regulatechemoresistanceinovariancancercells.Molecularcancer.2010；9(1):1.8.LeeJK,ChungJ,McAlpineFE,TanseyMG.RegulatorofG-proteinsignaling-10negativelyregulatesNF-κBinmicrogliaandneuroprotectsdopaminergicneuronsinhemiparkinsonianrats.TheJournalofNeuroscience,2011；31(33):11879-88.技术实现要素：为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种RGS10基因的表达与脂肪肝、Ⅱ型糖尿病之间的相互关系，提供一个用于治疗脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的靶基因RGS10的新用途，进而把RGS10基因应用于脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的治疗。本发明的目的通过以下技术方案实现：本发明以野生型C57小鼠与RGS10基因敲除小鼠为实验对象，通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型(dietinducedobesity，DIO)研究RGS10基因的功能，结果发现与野生型WT小鼠对比，RGS10基因敲除小鼠明显出现肥胖，其体重显著高于同种饲料饲养的WT小鼠，并且RGS10基因敲除小鼠的空腹血糖水平高于对照组WT小鼠。进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验发现RGS10基因敲除小鼠对葡萄糖的耐受能力明显减弱。从小鼠肝脏重量及肝脏/体重比以及脂质成分、糖原含量病理染色结果等均说明HFD组(Highfatdiet，高脂饮食)的RGS10-KO小鼠脂肪肝病变明显严重，脂质蓄积显著增加。这表明RGS10基因敲除会加剧脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的发生，RGS10基因能够改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的发生。本发明人的研究证明了：在高脂诱导的脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型中，RGS10具有抑制肥胖，降低血糖，减少肝脏脂质蓄积，保护肝功能，特别是改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的作用。针对RGS10的上述功能，提供RGS10作为药物靶标在筛选保护肝脏及糖代谢的药物中的应用。针对RGS10的上述功能，提供RGS10作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。以上药物是指能够促进RGS10基因表达的药物。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本发明发现RGS10基因的新功能，即RGS10基因具有能够保护脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病的作用。(2)基于RGS10在保护脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病中的作用，其可以用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物。附图说明图1是RGS10基因敲除小鼠的构建策略图。图2是WT和RGS10-KO小鼠的体重、空腹血糖结果图；A为小鼠体重结果图，B为空腹血糖水平统计图(*：p＜0.05vsWTNC组，**：p＜0.01vsWTNC组，#：p＜0.05vsWTHFD组，##：p＜0.01vsWTHFD组)。图3是WT和RGS10-KO小鼠通过腹腔注射葡萄糖耐量结果图；A为通过腹腔注射葡萄糖后不同时间点小鼠血糖水平统计图，B为各组小鼠糖耐量曲线下面积(areaunderthecurve，AUC)比较图(**：p＜0.01vsWTNC组，##：p＜0.01vsWTHFD组)。图4是RGS10-KO和WT小鼠的肝脏重量、肝脏重量与小鼠本身体重比值统计柱状图(##：p＜0.01vsWTHFD组)。图5是WT和RGS10-KO和WT小鼠的油红O染色和糖原染色结果图。具体实施方式通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。实验用动物及饲养：实验动物种属，性别，周龄及来源：C57BL/6(WT)小鼠和肝脏特异性RGS10基因敲除(RGS10-KO)小鼠，雄性，8周龄。C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司；肝脏特异性RGS10基因敲除小鼠构建如下(构建策略见图1)：根据基因信息利用CRISPRDesign(网址：http://crispr.mit.edu/)分别在内含子1和内含子2中各设计一个CRISPR的打靶位点。靶序列分别为：RGS10sgRNA1：GGGTCGGGGAGGTCGATGGAAGGRGS10sgRNA2：AGTCTCTTTGAACGTATCACTGG此外还设计了一个用于同源修复的供体质粒(DonorVector)，它包括两侧同源臂、中间的外显子2，以及两个同向的loxp序列。①打靶载体的构建：分别将sgRNA1和sgRNA2对应的两条引物融合成双链DNA，然后用T4DNA连接酶连入经过限制性内切酶BsaI处理过的pUC57-sgRNA载体中。该载体上游有一个T7启动子，可以用于后续的体外转录实验。②条件性敲除骨架载体pBluescriptSK(+)-2loxp的构建：分别合成4条寡聚单链核苷酸序列：loxp1-F：AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT，loxp1-R：ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；loxp2-F：GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA；loxp2-R：CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2两条双链。将pBluescriptIISK(+)载体用HindIII(NEB，R0104L)和EcoRV(NEB，R0195L)双酶切后连接入loxp1退火双链，再将测序正确的载体用BamHI(NEB，R0136L)和SpeI(NEB，R0133L)双酶切，连接入loxp2退火双链，得到条件性敲除骨架载体，命名为pBluescriptSK(+)-2loxp。③供体载体(DonorVector)的构建：根据引物设计原则，设计如下引物(表1)用于扩增供体载体的左右同源臂(LA和RA)以及中间的外显子部分(M)。扩增得到的产物经表1中所示限制性内切酶酶切后得到3个片段，将其分别连入条件性敲除骨架载体pBluescriptSK(+)-2loxp中，得到DonorVector。表1构建供体载体所需引物序列及对应酶切位点引物名称引物序列酶切位点RGS10LA-FCTTCTGAATGCTGGCCTCTTXhoIRGS10LA-RCCGCTCGAGCCAGCTCTCTGATGGACCTCHindIIIRGS10M-FCCCAAGCTTATCGACCTCCCCGACCCAGCATCCACTCTTAgeIRGS10M-RTCTACCGGTGGAAGGTGGGTTGCAGAGABamHIRGS10RA-FCGGGATCCGTGATACGTTCAAAGAGACTCTGAGMluIRGS10RA-RCGACGCGTCACTGGTGAGAGAGGTTGGATNotI④打靶载体的转录：对CRIPR/Cas9系统包含的两个部分(负责切割作用的Cas9蛋白和引导Cas9蛋白定位到靶位点的gRNA)分别进行转录。对于Cas9蛋白，将其表达载体(pST1374-Cas9)用PmeI进行酶切，以纯化后回收线性化质粒为转录模板，用T7mMESSAGEmMACHINE试剂盒(AM1345，Ambion)进行体外转录，获得加帽的mRNA产物。并用Poly(A)Tailing试剂盒(Ambion)对上述产物加尾，获得成熟的mRNA产物；对于sgRNA，使用MEGAshortscriptTMKit(AM1354，Ambion公司)进行体外转录。将转录得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasyMicroKit(Qiagen，217084)进行纯化。⑤RGS10-floxed条件性敲除小鼠的制作将上述成熟的mRNA产物与供体质粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠体内进行培育。得到的小鼠进行鉴定。取出生一周后的小鼠脚趾或尾部组织，提取基因组，并通过PCR方法筛选阳性首建鼠。从确定发生同源重组的小鼠中随机挑选一只作为F0代进行后续的繁殖，最终获得RGS10-floxed纯合小鼠。⑥肝脏特异性RGS10基因敲除小鼠的制作将上述RGS10-floxed小鼠与肝细胞特异性表达的Cre转基因小鼠Albumin-Cre(购自TheJacksonLaboratory，货号003574)转基因小鼠交配，筛选得到RGS10floxed/floxed/Albumin-Cre小鼠，待该小鼠长至6周龄左右后，腹腔注射Tamoxifen，诱导Cre酶的表达，Cre酶特异性的识别两个同向的loxp，并切除两者之间的序列及其中的一个loxp，最后得到肝脏细胞特异性RGS10基因敲除小鼠。实验动物饲料配方：高脂饲料(HFD)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12942)：热量百分比：蛋白质:20％；碳水化合物:20％；脂肪:60％，总的热量质量比:5.24kcal/g。低脂饲料(NC)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12450B)：热量百分比：蛋白质:20％；碳水化合物:70％；脂肪:10％，总的热量质量比:3.85kcal/g。动物饲养及环境条件：所有的实验小鼠均饲养在武汉大学SPF级动物房(许可证号：SYXK(鄂)：2009-0053)。每12小时交替照明，温度24±2℃，湿度40％-70％，小鼠自由饮水进食。【实施例1】小鼠脂肪肝、II型糖尿病模型(dietinducedobesity，DIO)获得(1)实验动物分组：选用8周龄，雄性，WT小鼠和RGS10-KO小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料(Highfatdiet，HFD)和D12450B低脂饲料(Normalchow，NC)饲养，即WTNC组，KONC组，WTHFD组，KOHFD组共4个组别。(2)模型通过高脂饲料诱导操作流程：采用WT和KO小鼠，建立DIO模型，进行表型相关分析，明确RGS10基因对脂肪肝、II型糖尿病发挥的作用。选用8周龄，雄性，WT小鼠和RGS10-KO(TG)小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料(Highfatdiet，HFD)和D12450B低脂饲料(Normalchow，NC)饲养，即WTNC组，KONC组，WTHFD组，KOHFD组共4个组别。每周均详细记录小鼠摄食量，小鼠空腹体重和空腹血糖每隔2周检测1次。实验第11周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对葡萄糖耐受能力。第12周终末取材，取出小鼠肝脏拍照，然后一部分置于甲醛溶液中固定或O.C.T冰冻切片包埋剂(TissueFreezingMedium)包埋作为病理分析用。【实施例2】小鼠体重、血糖水平测定(1)小鼠空腹体重检测1)体重检测。①禁食：上午8:00将待实验小鼠禁食(不禁水)，下午2:00开始实验操作。②称重：分别在第0周、2周、4周、6周、8周、10周、12周称重，将一塑料小桶放在动态电子天平上，抓起小鼠，放入称量小桶中，测量体重记录数据。饲料量检测：待称体重操作完成后，给小鼠加饲料，并在动态电子天平上记录小鼠的饲料量。(2)空腹血糖水平检测实验将所有待实验的小鼠从上午8:00至下午2:00间禁食(不禁水)，即禁食6小时后开始实验操作。①血糖仪准备：检查血糖仪(美国强生公司，ONETOUCH)电池，按右侧开关，将试纸正确放入左侧插槽，屏幕显示与血糖试纸条相应代码的数字，随后显示滴血图案，提示血糖仪进入待测状态。②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一块毛巾，将毛巾对折，用拇指和食指捏住毛巾对折处，将鼠头部和身体包入手掌内的毛巾，拇指和食指在将鼠尾根部固定。③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm处剪下鼠尾，待血滴自行流出。④血糖检测：将血糖仪试纸边缘轻触血滴，血液浸入试纸，血糖仪倒计时5秒显示读数。II型糖尿病损伤严重程度的评估指标主要包括体重、血糖等水平，体重、血糖变化结果如图2所示，WT小鼠在给与HFD饲料饲养后，从第4周开始体重明显高于其NC饲料组，给与RGS10-KO小鼠12周的HFD饲料和NC饲料饲养后，HFD组的RGS10-KO小鼠体重从第6周开始明显高于HFD组的WT小鼠(见图2A)；经空腹血糖检测发现在HFD组的小鼠从第2周开始空腹血糖水平明显较相应NC对照组升高，HFD组的RGS10-KO小鼠空腹血糖水平也明显高于WT组小鼠空腹血糖水平(见图2B)。表明RGS10基因敲除后显著影响了小鼠在HFD饲养状态下的糖代谢稳态，RGS10基因能显著提高小鼠的糖代谢能力，表明RGS10基因可抑制高脂诱导引起的II型糖尿病的发生。【实施例3】葡萄糖耐量实验(intraperitonealglucosetolerancetest，IPGTT)实验第11周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对糖耐受能力。(1)在测血糖之前，先测量小鼠的空腹体重，根据10μL/g计算葡萄糖的注射体积。(2)先检测葡糖糖注射前即0分钟时空腹血糖，在检测完毕后迅速经腹腔注射葡萄糖液。(3)腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和无名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下，将小鼠腹部充分暴露。②进针定位及注射：从腹部一侧进针右手持注射器，将尖端与小鼠腹部成45°的夹角，进针，回抽，注射时针头在腹部皮下穿行一小段距离，穿过腹中线后在腹部另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。(4)分别于腹腔注射后15分、30分、60分、120分钟时间点剪尾测小鼠血糖值，并记录血糖数值和检测时间。进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验(intraperitonealglucosetolerancetests，IPGTT)来评估各组小鼠对葡萄糖的处理能力，在实验第11周，通过注射1.0g/kg体重的葡萄糖后，HFD组的WT小鼠和RGS10-KO小鼠血糖水平在15分钟时间点剧增达到峰值，随着时间推移至注射后60分钟，两组小鼠血糖水平稍微下降，但仍处于高于空腹血糖水平(0分钟时血糖)，在2小时时恢复至空腹血糖水平，且RGS10-KO小鼠血糖水平从0分钟至2小时一直处于高于WT小鼠的血糖水平(图3A)。比较各组小鼠血糖曲线下面积(areaunderthecurve，AUC)，发现WT小鼠HFD组的AUC显著高于NC组，RGS10-KOHFD组的AUC显著大于WTHFD组的AUC(图3B)，表明RGS10可促进糖代谢稳态。【实施例4】肝脏大体外观及肝脏油红O、糖原染色(1)终末肝脏组织取材1)小鼠称重后，迅速脱颈处死。仰卧固定小鼠，用蒸馏水将小鼠胸部，腹部毛发润湿。2)用一镊子钳夹小鼠腹部正中皮肤，沿腹部正中向头部剪开皮肤至剑突下，向尾端剪开皮肤，逐层暴露皮下筋膜，肌肉等，打开腹腔，充分暴露各脏器。3)迅速找到并取下小鼠的肝脏，将取下的肝脏标本置于灭菌纱布上，拭干肝脏表面上残留血液，将肝脏置于无菌培养皿中，迅速称重。4)石蜡标本：切取部分肝脏置于10％中性福尔马林中固定。冰冻标本：切取部分肝脏，置于有OCT的锡纸模具中包埋，放在干冰上冰冻固定。(2)肝脏组织处理及病理染色相关实验1)肝脏脱水，透明，浸蜡切取10％中性福尔马林中固定好的部分肝叶组织于标记的包埋框内，在小流量流水冲洗30分钟以上。按照以下流程在机器上设置以下程序，①脱水：75％酒精(45分钟)→75％酒精(45分钟)→85％酒精(45分钟)→85％酒精(45分钟)→95％酒精(45分钟)→95％酒精(45分钟)→无水酒精(1小时)→无水酒精(1小时)；②透明：二甲苯(1小时)→二甲苯(1小时)；③浸腊(65℃)：石蜡(1小时)→石蜡(1小时)。待组织冲洗完毕后，将包含组织的包埋框装进机器篮筐内，启动上述程序。上述程序完成后，取出组织包埋框送病理室包埋组织，同时清洗机器备用。2)肝脏组织切片使用切片机切片(切片厚度5μm)。3)肝脏组织糖原染色将肝脏组织石蜡切片放入65℃烘箱(30分钟)→二甲苯中(5分钟×3次)→100％酒精(1分钟)→90％酒精(1分钟)→70％酒精(1分钟)→蒸馏水洗→高碘酸(10分钟)→自来水洗去切片上的浮色→雪夫试剂浸染(10-15分钟)→自来水洗数下→苏木素(1分钟)→蒸馏水洗去切片上的浮色→70％酒精一下→90％酒精一下→100％酒精(30秒×3次)→二甲苯(2分钟×3次)→在二甲苯未干时封片，拍照。4)肝脏组织油红O染色①将冰冻肝脏组织切片在通风橱中风干30分钟，4％多聚甲醛固定10分钟。置于双蒸水中稍洗10分钟，以除去组织表明的多聚甲醛。②以60％异丙醇处理1分钟。③用油红O(公司sigma，货号O0625，浓度0.5克/100mL100％异丙醇)染色30分钟。④之后以60％异丙醇漂洗1分钟×3次，直至背景干净。⑤用Mayer’s苏木素染液(5滴)淡染细胞核。⑥水漂洗，稀碳酸锂水溶液中促蓝，充分水洗，水洗至细胞核蓝化。⑦用甘油明胶封片，拍照。肝脏重量及肝重体重比结果见图4所示，HFD组的RGS10-KO小鼠的肝脏无论肝脏重量还是肝脏重量与小鼠本身体重比值均较HFD组的WT小鼠高(如图4)。进一步通过组织切片，进行油O和糖原染色，显微镜下观察各组小鼠肝脏组织在高脂饮食饲养条件下发生了显著的病理改变。通过肝脏油红O染色来检测肝组织中脂质，可以观察到在HFD饲养条件下，WT小鼠和RGS10-KO小鼠肝脏组织均有脂肪沉积，可以看到HFD组WT小鼠的肝细胞发生脂肪变性、空泡化且融合连成片状，肝脏细胞形态已几乎完全破坏，而RGS10-KO组小鼠的肝细胞形态变化更为严重，空泡化更明显(如图5上)。通过肝脏糖原染色来检测肝脏损伤程度，可以发现在HFD组的RGS10-KO小鼠肝糖原的含量相比于WT组小鼠明显减少(如图5下)，这些结果说明RGS10基因敲除小鼠的脂肪肝明显恶化。上述结果显示RGS10-KO小鼠在HFD的诱导下发生的II型糖尿病和脂肪肝病变显著加重。这些结果表明RGS10基因对改善II型糖尿病和脂肪肝具有显著的作用。本发明结果说明RGS10基因在脂肪肝、II型糖尿病疾病模型中有着重要的保护作用。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。SEQUENCELISTING<110>武汉大学<120>G蛋白信号转导调节蛋白10在治疗脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和应用<160>12<170>PatentInversion3.3<210>1<211>23<212>DNA<213>RGS10sgRNA1<400>1gggtcggggaggtcgatggaagg23<210>2<211>23<212>DNA<213>RGS10sgRNA2<400>2agtctctttgaacgtatcactgg23<210>3<211>54<212>DNA<213>loxp1-F<400>3agcttgacgtcataacttcgtatagcatacattatagcaatttata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