一种促进细菌生物膜形成的培养基及培养方法
【技术领域】
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[0001]本发明属于微生物领域，具体涉及一种促进细菌生物膜形成的培养基及培养方法。
【背景技术】
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[0002]细菌生物膜(Bacterial b1film, BF)是一种附着于生物或非生物材料表面，被自身分泌的胞外大分子包裹并具有一定三维结构特点的细菌群体，生物膜的基本构成包括:水、细菌、大分子聚合物、吸附的营养物质、代谢产物和细菌裂解产物等，其中生物大分子包括蛋白质、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等。与单细胞浮游状态的细菌不同，在载体表面增殖的细菌生物膜在整体上表现出一系列新的生物学特征并具有更强的适应外界环境胁迫的能力，如抗药性的提高，从而导致生物膜不易被清除，引起人类疾病和工业产品腐败变质等。
[0003]细菌生物膜的形成是一个复杂和动态变化的过程，一般包括四到五个阶段:最初的定植阶段、不可逆的粘附阶段、结构分化阶段、发展成熟阶段以及最后的细菌脱落和再植阶段。研宄表明，上述过程会受到诸多因素的影响，如附着载体的材料性质，包括载体界面形态特征、静电作用、亲疏水性和表面粗糙度；细胞表面物化性质，包括胞外多糖、胞外蛋白和胞外DNA ;营养和环境条件，包括温度、培养基、pH值、金属离子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+、Fe3+和Al 3+等)和杀菌剂等。
[0004]在如何促进细菌生物膜形成方面，已有一些专利和文章公布或者发表。在“调节生物膜生长的方法和组合物(200680023920.9)”专利中，作者提供了一种利用有效量的一氧化氮或有效量的至少一种产生或者释放一氧化氮的试剂来促进细菌生物膜形成的方法。用BMM培养基(每升体积中含有下列组分:9.0mM谷氨酸钠、50mM甘油、0.02mM硫酸镁、0.15mM磷酸二氢钠、0.34禮磷酸氢二钾、145禮氯化钠、2(^1痕量金属溶液和Iml维生素溶液)诱导铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa FRDI)生物膜的形成，发现当在BMM中添加1.0mM和1mM的氯化钙时，可使生物膜的厚度增加约十倍(Sarkisova，S.，Μ.Patrauchan, et al.2005.Calcium-1nduced virulence factors associated with theextracellular matrix of mucoid Pseudomonas aeruginosa b1films.Journal ofBacter1logy 187 (13): 4327-4337)。用PD2培养基(每升体系中含有下列组分:4.0g胰蛋白胨、2.0g植物蛋白胨、1.0g柠檬酸三钠、1.0g琥珀酸二钠、0.0lg氯化血红素、1.0g七水硫酸镁、1.0g磷酸二氢钾、1.5g磷酸氢二钾和2.0g牛血清白蛋白组分五)培养叶缘焦枯菌(Xylella fastid1sa)，发现当PD2培养基中添加1.0mM_2.5mM氯化妈和1.0-1.8mM的硫酸亚铁时，可以促进其生物膜的形成(Cruz, L.F., Cobine P.A., etal.2012.Calcium increases Xylella fastid1sa surface attachment,b1filmformat1n, and twitching motility.Applied and Environmental Microb1logy78(5):1321-1331)。用改进型TSB培养基(每升体系中含有下列组分:17g酪蛋白胰酶消化物、3g大豆粉木瓜酶消化物、5g氯化钠、2.5g磷酸氢二钾、2.5g葡萄糖和1.5g胆汁盐)培养少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)，当培养基中添加250 μ m浓度的氯化镁或者氯化钙时，都可以促进浮游菌在不锈钢片表面的附着和生物膜的形成(Guvensen, N.C., Demir S., et al.2012.Effects of magnesium and calcium cat1ns onb1film format1n by Sphingomonas paucimobilis from an industrial environment.Fresenius Environmental Bulletin 21 (12):3685-3692)。用 TRIS-G 培养基(每升体系中含有下列组分:6.057g三(羟甲基)氨基甲烷、7.88g Tris-HCl、4.675g氯化钠、1.4912g氯化钾、1.0698g氯化铵、4.261g磷酸钠、2.033g六水硫化镁、0.294g 二水氯化钙、40mg 二水磷酸二氢钠、4.8mg/L柠檬酸铁铵和100 μ I痕量物质储液)培养门多萨假单胞菌(P.mendocina NR802)，发现在上述培养基中添加1mM或者20mM的氯化妈或者氯化儀，都可以促进生物膜的形成(Mangwani, N., Shukla S.K., et al.2014.Calcium-mediatedmodulat1n of Pseudomonas mendocina NR802b1film influences the phenanthrenedegradat1n.Colloids and Surfaces B:B1interfaces 114:301-309)。用 King B 肉汤培养基(每升体系中含有下列组分:20g蛋白胨、1.5g磷酸氢二钾、1.5g七水硫酸镁和1ml甘油)培养荧光假单胞菌(P.fluorescens PCL1701)，当培养基中添加一定浓度(如15mM)的氯化钙时，可以促进生物膜的生物量和表面覆盖率提高，而对生物膜的厚度不会产生影响(Safari, A., 0.Habimana, et al.2014.The significance of calcium 1ns onPseudomonas fluorescens b1films - a structural and mechanical study.B1fouling30(7):859-869) o用LB培养基(每升体系中含有下列组分:10g氯化钠、1g胰蛋白胨和5g酵母粉)分别培养嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和类肠球菌(Enterococcusfaecalis)，当培养体系中同时添加100mM的二水氯化钙、25units的DNase I和5mM的氯化镁时可促进上述两株菌的生物膜形成(Das, T.，Sehar S., et al.2014.1nfluenceof calcium in extracellular DNA mediated bacterial aggregat1n and b1filmformat1n.PLoS 0ne9 (3):e91935)。
[0005]纵观上述专利或者文献中提供的促进生物膜形成的方法，有的培养基配方过于复杂，有的不易操作，有的配方中的成份价格昂贵，因此，很有必要开发一种配方简单和价格低廉的可同时对革兰氏阴性细菌和阳性细菌的生物膜形成都有促进作用的培养基配方。
[0006]同时，目前关于细菌生物膜的研宄，主要是生物膜的发生发展及其相应的基因调控规律，以及如何减少生物膜的产生和如何清理生物膜，但是，细菌生物膜也有可被利用即有益的一面，如细菌生物膜可以防止或者减少金属的腐蚀；利用细菌生物膜可以吸附重金属离子和脱氮作用等功能，在污废水处理系统中得到广泛应用；有的还利把细菌生物膜改造成蛋白合成的微工厂(Nguyen, P.，et al.2014.Programmable b1film-based materialsfrom engineered curIi nanofibres.Nature Communicat1ns 5:4945)，由此可见，细菌生物膜在未来将得到更加广泛的有益应用。若想大规模的利用生物膜，就必须使用某种技术或者方法使细菌能够在附着物表面形成更多的生物膜。
【发明内容】
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[0007]本发明的第一个目的是提供一种成份简单，原料易得，价格低廉，配制简便，无论是对革兰氏阳性细菌还是革兰氏阴性细菌，都可以促进其生物膜的形成，可以满足大规模推广需要的促进细菌生物膜形成的培养基。
[0008]本发明的促进细菌生物膜形成的培养基，其特征在于，每升含有:氯化钠8_12g、胰蛋白胨7-13g、酵母粉4-7g、氯化钙10_50g，余量为水。
[0009]本发明的第二个目的是提供一种促进细菌生物膜形成的培养方法，其特征在于，其是以上述促进细菌生物膜形成的培养基作为细菌的培养基对细菌进行培养。
[0010]所述的细菌为葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、芽孢杆菌属(Bacillusspp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、梓檬酸杆菌属(Citrobacter spp.)或者肠杆菌属(Enterobacter spp.)的细菌等。
[0011]进一步优选，所述的细菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、魏氏朽1檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)或者阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)等。
[0012]本发明的促进细菌生物膜形成的培养基，其配比简单、配制简便、价格低廉、效果明显，而且对革兰氏阳性和阴性细菌的生物膜形成都有促进作用，应用范围更加广泛。
【具体实施方式】
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[0013]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0014]测试方