一种用于降解苯醚甲环唑的细菌bmjhz-01及其筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于降解苯醚甲环唑的细菌BMJHZ-01及其筛选方法，属于微生 物领域。
【背景技术】
[0002] 苯醚甲环唑，英文通用名为Difenoconazole，分子式为C19H 17C12N303，其分子量为 406. 26。苯醚甲环唑纯品为无色固体，熔点76°C，沸点220°C /4Pa，蒸气压120nPa(20°C )。 溶解性（20°C ):水3. 3毫克/升，易溶于有机溶剂。< 300°C稳定，在土壤中移动性小，缓 慢降解。
[0003] 研宄表明，三唑类杀菌剂是内吸性杀菌剂，对植物体无害，但对致病真菌具有极 高的生物毒性。其杀菌机理是三唑类化合物的结构中含氮杂环部分的氮原子与细胞色 素P-450的铁离子结合，表现出抗菌活性和植物生长调节活性。R.GadnerS以酵母和鼠肝 均浆为酶，麦角留醇生物合成过程中，三唑类化合物明显地与细胞色素P-450结合；接着 T. E.Wiggins用鼠肝微粒件和酵母细胞色素P-450研宄证实了三唑类化合物作为生长调节 剂阻碍植物中赤霉素的生物合成，在抑制植物生长的同时，有抗菌活性。
[0004] 另外，相关研宄表明，苯醚甲环唑对罗非鱼为高毒药物，24、48、72、96h半数致死浓 度分别为6. 29、5. 46、4. 70、4. 31mg/L。苯醚甲环挫对蜜蜂为低毒。苯醚甲环挫微乳剂对家蚕 进行急性毒性试验，96h LC50值为46. 5_154mg ? I71，属于中毒级；在农业生产中，杀菌剂等 化学农药的施用一直是保证粮食作物增产稳产有效的手段之一。尤其是随着苯醚甲环唑的 大量使用，使得土壤中残存的苯醚甲环唑逐渐累积，进而造成严重的土壤污染；另外，苯醚 甲环唑农药生产过程中产生的废水废气也通过排放以及流失等方式积累到土壤中，进一步 的加剧了土壤的污染。但是，苯醚甲环唑在土壤中降解较慢，半衰期分别为：51. 3d-125. 8d， 43. 6d-69. 3d，47. 5-63. 6d。显然不能有效解决土壤中苯醚甲环唑逐渐累积的现状。
[0005] 目前，微生物为农田中农药残留（包括苯醚甲环唑）的主要降解者，逐渐成为农药 污染土壤生物修复的热点。因此，提供一种能够降解苯醚甲环唑的微生物，并将其应用到苯 醚甲环唑农药土壤的修复中是本领域技术人员亟待解决的一个技术问题。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种用于降解苯醚甲环唑的细菌BMJHZ-01及 其筛选方法，本发明发现细菌BMJHZ-01能以苯醚甲环唑作为碳源并进行增殖，因此，其能 作为降解苯醚甲环唑的微生物并进行利用，通过实验证明，在相应的培养条件下，BMJHZ-01 能使苯醚甲环唑浓度为60-180mg/L的基础盐培养基中的苯醚甲环唑在7天之内完全降解。 在具体使用的过程中，可将大量扩培的BMJHZ-01制成以其为活性成分的降解剂，并修复含 有苯醚甲环唑农药残留的土壤。
[0007] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种用于降解苯醚甲环唑的细菌 BMJHZ-01，Pseudomonasnitroreducens为此细菌的英文名，中文名硝基还原假单胞菌， BMJHZ-01为本发明对该细菌命名的简称。细菌Pseudomonasnitroreducens已经被专利 200610046646. 9保藏，2005年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏号为CGMCCNo. 1488,菌株的具体生理生化特征见专利200610046646. 9。
[0008] 细菌Pseudomonasnitroreducens为革兰氏阴性，有鞭毛，无芽孢的杆菌，菌落较 大为白色、隆起，边缘规则，表面光滑，严格好氧，化能异养。明胶不能液化，硝酸盐可以还原 成亚硝酸盐，氧化酶阳性；接触酶阳性；不产硫化氢，不能淀粉水解；能够利用葡萄糖、葡萄 糖酸盐、2-酮类葡萄糖酸盐、乙醇、琥珀酸盐、柠檬酸盐等碳源，不能利用水杨酸、安息香酸 盐、龙胆酸盐和氨基苯甲酸盐。
[0009] 本发明还提供一种含有上述细菌BMJHZ-01的降解剂，由于细菌BMJHZ-01能以苯 醚甲环唑为碳源进行繁殖，因此，以细菌BMJHZ-01为活性成分并制成相应的降解剂，能修 复含有大量苯醚甲环唑的土壤。
[0010] 本发明还提供一种如上述的细菌BMJHZ-01在降解水体和/或土壤中的苯醚甲环 唑残留的应用。
[0011] 本发明还提供一种如上述的含有细菌BMJHZ-01的降解剂在降解水体和/或土壤 中的苯醚甲环唑残留的应用。
[0012] 本发明还提供一种用于降解苯醚甲环唑的细菌BMJHZ-01的筛选方法，包括：
[0013] 1)取苯醚甲环唑生产厂废水排水道中的泥样，将泥样置于第一基础盐液体培养基 中，泥样与第一基础盐液体培养基的质量比为1:20,摇床培养后得到第一混和菌液，摇床培 养的温度为30°C，转速为200转/分钟，时间为7天，在该培养条件下，细菌繁殖迅速，大量 的微生物呈现对数期生长，为后续的传代培养提供了保障；
[0014] 本步骤将泥样与第一基础盐液体培养基混合，由于在第一基础盐液体培养基中仅 包含了苯醚甲环唑作为微生物的碳源，所以在培养过程中，能够分解并利用苯醚甲环唑的 微生物则正常增殖，不能利用苯醚甲环唑的微生物则会死亡，进而初步筛选出了第一混和 菌液。
[0015] 2)将1)得到的第一混合菌液接种到第二基础盐液体培养基中，接种量为第一混 合菌液体积量的5 %，进行传代培养，培养的温度为30°C，转速为200转/分钟，时间为7天， 得到第二混合菌液；
[0016] 第一混合菌液在增殖过程中会消耗第一基础盐液体培养基中大量的养分（苯醚 甲环唑或各种无机盐），因此，得到第一混合菌液后，需要将其再次接种，并进行传代培养， 获得进一步筛选的第二混合菌液。
[0017] 由于第一混合菌液中的微生物生理活性旺盛，因此，需要对其接种量进行有效控 制，接种量太大会导致后续的营养不能保证其繁殖所需，接种量太小则会影响其筛选效果。 由于目前还未见该菌的报道，因此，本发明对其接种量的控制（5%)是通过大量的探索和 研宄获得的；
[0018] 3)取2)得到的第二混合菌液lmL用质量浓度0. 9%的无菌生理盐水稀释105倍， 然后取100uL涂布到基础盐固体培养基中，30°C暗培养2天，分别收集平板上长出的单菌 落，并利用LB培养基划线纯化，30°C暗培养2天，得到多个纯化后的单菌落，
[0019] 为了保证单菌落快速繁殖，获得活性较高的单菌落，因此，所述LB培养基，包括如 下原料：蛋白胨9-llg、酵母膏4-6g、氯化钠9-llg、琼脂19-21g和水1000g ;
[0020] 基于2)同样的理由，获得第二混合菌液后，为了获得纯的单菌落，需对其利用基 础盐固体培养基培养，培养温度稍高或稍低以及培养时间超过3天则会出现微生物死亡的 现象，在培养过程中，使用基础盐固体培养基暗培养，不同的微生物会长出不同的菌落，然 后分别挑选出多个单菌落，将其利用LB培养基划线纯化，得到多个纯化后的单菌落。
[0021] 4)取3)得到的多个纯化后的单菌落，每个单菌落接种到一个第三基础盐液体培 养基中摇床培养，摇床培养的温度为30°C，转速为200转/分钟，时间为7天，得到多个单菌 菌液；
[0022] 纯化后的单菌落接种到第三基础盐液体培养基中，保证其正常繁殖，并得到多个 单菌菌液，多个单菌菌液通过后续的培养以及测定其对含有苯醚甲环唑的第四基础盐液体 培养基的降解效果进而分离出所需的细菌。
[0023] 5)取4)得到的多个单菌菌液，每个单菌菌液用一个第四基础盐液体培养基摇床 培养，每个单菌菌液的接种量为其体积量的5%，摇床培养的温度为30°C，转速为200转/ 分钟，时间为7天，摇床培养后，分别测定第四基础盐液体培养基中苯醚甲环唑的残留浓 度，并筛选出使苯醚甲环唑浓度降低的单菌菌液，利用标准的菌种鉴定手段鉴定所得单菌 菌液，得到细菌Pseudomonas nitroreducens，本发明将其简称为细菌BMJHZ-01。
[0024] 将单菌菌液分别摇床培养的过程中，会消耗第四基础盐培养基中的苯醚甲环唑， 因此，分别测定第四基础盐液体培养基中苯醚甲环唑的残留浓度，并筛选出使得苯醚甲环 唑浓度降低的单菌菌液，进而获得目标细菌。
[0025] 在培养的过程中也会获得一些降解效果不理想的微生物，其可能是实验误差或微 生物本身耐性较强等原因导致，因此，排出筛选范围，而获得细菌BMJHZ-01能以使苯醚甲 环唑浓度为180mg/L的基础盐培养基中的苯醚甲环唑在7天之内完全降解，降解效果非常 显著。
[0026] 在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0027] 进一步，在1)中所述第一基础盐液体培养基、2)中所述第二基础盐液体培养基、 4)中所述第三基础盐液体培养基和5)中所述第四基础盐液体培养基，为相同的基础盐液 体培养基，均包括如下原料：
[0028] 氯化钠 0. 9-1. lg、磷酸二氢钠 1. 4-1. 6g、磷酸氢二钠 0. 4-0. 6g、硫酸镁 0. 1-0. 3g、 硫酸亚铁0. 01-0. 02g、氯化钙0. 01-0. 03g、硫酸铵0. 9-1. lg和水1000g，每升上述原料含有 苯酿甲环挫180mg。
[0029] 进一步，在3)中，所述基础盐固体培养基，包括如下原料：
[0030] 氯化钠 0. 9-1. lg、磷酸二氢钠 1. 4-1. 6g、磷酸氢二钠 0. 4-0. 6g、硫酸镁 0. 1-0. 3g、 硫酸亚铁〇? 01-0. 02g、氯化钙0? 01-0. 03g、硫酸铵0? 9-1. lg、琼脂19-21g和水1000g，每升 上述原料还含有苯醚甲环挫