一种耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株及其筛选方法和应用【
技术领域：
】[0001]本发明属于微生物
技术领域：
，具体涉及一种耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株，同时还涉及一种耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株的筛选方法和应用。【
背景技术：
】[0002]鸡大肠杆菌病是引起鸡生长缓慢和死亡的重要原因之一，并制约着养禽业的发展。生产中常采取抗生素进行治疗，但抗生素在抑制致病性微生物的同时，也破坏了肠道内正常微生物菌群的平衡，反而增加了其他消化道疾病的发生率，出现一旦不用抗生素，鸡群就发病的怪现象，导致抗生素滥用。抗生素滥用引起动物肠道病原微生物产生耐药性，并造成动物免疫力下降，畜禽产品中的药物残留增加以及环境污染等系列问题，进而使畜禽产品在国际市场的竞争力下降，并对人类健康造成潜在威胁（ServinAL.Antagonisticactivitiesoflactobacilliandbifidobacteriaagainstmicrobialpathogens[J].FEMSMicrobiolRev,2004.28(4):405-440)。因此，开发无毒、无副作用以及无残留的抗生素替代品已成为当前的研宄热点。[0003]以益生菌组成的微生态制剂作为抗生素替代品的首选已被多数从业人员所认可。1998年AAFC0鉴定公布了43种可用作益生素的菌种，其中半数以上是乳酸菌(EwingWN.TheLivingGut[M].UniversityofNotinghan.England,1994,49)。乳酸菌作为益生菌的一种，可调节消化道微生态平衡、诘抗病原微生物（SakamotoL，IgarashiM,KimuraK,etal.SuppressiveeffectofLactobacillusgasseriOLL2716(LG21)onHelicobacterpyloriinfectioninhumans[J].JAntimicro,2001,47(5):709-710；KushalR,AnandSK,ChanderH.Effectofthefeedingmicroentrappedco-cultureofLactobacillusacidophilusandBifidobacteriumbifudumontheimmuneresponseandprotectionofmiceinfectedwithSalmonellatyphimurium[J].DairySciTech,2006,86:387-399)、促进营养成分在动物体内的分解吸收（FooksLJ,FullR,GibsonGR.Prebiotics,probioticsandhumangutmicrobiology[J].IntDairyJ,1999,9:53-61)、降低血清中胆固醇含量（PereiraDI，CibsonGR.Cholesterolassimilationbylacticacidbacteriaandbifididobacteriaisolatedfromthehumangut[J].ApplEnvir,2002,68(9):4689_4693)，以及抗肿瘤作用（ParkHD，RheeCH.AntimutagenicactivityoflactobacillusplantarumKLAB21isolatedfromkimchiKoreanfermentedvegetables[J].Biotechlet,2001,23(19):1583-1589；RafterJ.Lacticacidbacteriaandcancer:mechanisticperspective[J].BrJNutr,2002,88:89-94)等。乳酸菌是动物消化道内的主要共生菌之一，已作为饲料微生物添加剂广泛应用于动物生产中（王晶，季海峰，王四新，等.饲用乳酸菌制剂的研宄现状及在养猪生产中的应用[刀.动物营养与饲料科学，2010,37(3):38-41)，其进入畜禽肠道后能够和病原菌相互竞争营养物质，阻止病原菌获得其生长增殖所需的营养元素，还能够产生如挥发性脂肪酸和乳酸等一系列有机酸，进而降低肠道内的pH，抑制大肠杆菌等致病菌的增殖（IsolauriE,SalminenS,OuwehandAC.Microbial-gutinteractionsinhealthanddisease.Probiotics[J].Bestpractice&research.Clinicalgastroenterology，2004,18(2):299)。如何获得耐胃肠道环境且生长迅速、产酸能力强、抗菌效果好的禽用乳酸菌菌株，是急需解决的问题。[0004]目前，随着乳酸菌的广泛应用，人们对其研宄也越来越深入，乳酸菌在增强机体免疫功能和预防消化道感染方面发挥重要作用（GearyTM，P.H.Brooks,T.Morgan,etal.Performanceofweanerpigsfedadlihitumwithliquidfeedatdifferentdrymatterconcentrations[J].Sci.FoodAgric,1996,72:17-24；VanwinsenRL,BA.Purlings,LA.Lipman,etal.EffectofFermentedFeedontheMicrobiolPopulationoftheGastrointestinalTractsofPigs[J].AppliedandEnvironmentMicrobiology,2001,67(7):3071-3076;GunnarFimland,LineJohnsen,JonNisaen-Meyer.Pediocin-1ikeantimicrobialpeptides(classIIbacteriocins)andtheiriramunityproteins:biosynthesis,structure,andmodeofaction[J]?PeptideSci.2005,11:688-696)。乳酸菌能通过细菌本身或细胞壁成分提高黏膜表面和血清中IgA、IgM、IgG水平，增强体液免疫，促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖，加强细胞免疫（陈世琼，李平兰.特殊性能乳酸菌在治疗仔猪腹泻中的应用前景[J].饲料研宄，2003(1):20-22);能够竞争性排斥病原菌的粘附、产生多种抑菌物质，进而起到预防肠道感染的作用(赵洪梅，杨金生，杨文涛，等.乳酸菌对肠粘膜免疫调节的影响[J].吉林农业，2011，（5):328-329)。市场上以乳酸菌为主的微生态制制剂大多数适宜于哺乳动物，由于家禽独特的消化系统特点，在家禽上应用具有一定的局限性，临床效果不突出。因此研制禽用微生态制剂具有重要意义。【
发明内容】[0005]本发明的目的是提供一种耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株。[0006]本发明的第二个目的是提供一种耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株的筛选方法。[0007]本发明的第三个目的是提供一种耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株在制备用于防治家禽细菌性消化道疾病的微生态制剂方面的应用。[0008]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：[0009]-种耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株，所述菌株为唾液乳酸杆菌（Lactobaci1lussalivarius)L2,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2014614。[0010]本发明的耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株为唾液乳酸杆菌（Lactobaci1lussalivarius)L2,已于2014年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学校内中国典型培养物保藏中心），保藏编号为：CCTCCNO:M2014614。[0011]所述菌株是从家禽肠道内容物中筛选出的。从菌种的安全性及对宿主肠道的粘附性考虑，乳酸菌菌种分离自宿主肠道内的优势菌群。[0012]所述家禽肠道内容物为健康雏鸡盲肠内容物。[0013]一种上述的耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株的筛选方法，包括下列步骤：[0014]1)菌株分离纯化：取健康家禽肠道内容物，用无菌水稀释后，涂布在乳酸杆菌选择性培养基上进行厌氧培养，分离出具有溶钙圈的单菌落，反复划线纯化，得纯化菌；[0015]2)取步骤1)所得纯化菌制成菌液，分别置于酸性的MRS培养基、含有牛胆盐的MRS培养基中进行厌氧培养，得优势菌株；[0016]3)检测步骤2)所得优势菌株对大肠杆菌和沙门氏菌的体外抑菌活性，得具有抗大肠杆菌、沙门氏菌活性的乳酸杆菌。[0017]步骤1)中，1L所述的乳酸杆菌选择性培养基包含以下组分：蛋白胨10g、牛肉浸粉l〇g、酵母浸粉2g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、枸橼酸三铵2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温801g、葡萄糖20g、碳酸妈5g、琼脂25g。