专利名称：一种利用糖化酶筛选高产柠檬酸菌株的方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，具体地，涉及一种利用糖化酶筛选高产柠檬酸菌株的方法。
背景技术：
在我国的朽1檬酸行业中，利用淀粉质原料，以黑曲霉(Aspergillusniger)为菌种深层发酵生产柠檬酸的水平已达到世界先进水平。其生产工艺为先将淀粉质原料粉碎、力口α -淀粉酶将淀粉液化分解为短链的糊精，取其液化液加适量有机氮源进行发酵，发酵醪液经过提取后获得柠檬酸。黑曲霉可以自身分泌糖化酶，并且该糖化酶可以耐受酸性环境。黑曲霉利用糖化酶对短链的糊精进行分解获得葡萄糖，葡萄糖进入EMP途径，经三羧酸循环获得柠檬酸。柠檬酸菌种进行生产筛选时的主要指标是摇瓶产酸。其筛选流程为平板分离后，单菌落接入试管，将成熟的孢子接入摇瓶培养基中，在96小时检测摇瓶产酸，选取摇瓶高产酸的编号试管进行传代用于发酵生产。在柠檬酸发酵生产中经常发 现，当应用不同批次菌种时，会出现产酸及残糖的区另O。排除发酵过程中通气、搅拌罐压等控制因素的影响，研究发现，不同批次菌种筛选结果中，每一只试管斜面接种培养基后，其糖化酶的活力不同。当淀粉质原料经α-淀粉酶液化后，糖化酶活力强的试管菌株产生的发酵菌球可以快速的分泌糖化酶，从而将短链糊精较快的分解为葡萄糖供给菌体进行发酵产酸。而分泌糖化酶慢或糖化酶活力较弱的菌株，将短链糊精分解为葡萄糖的速度较慢，这会导致柠檬酸发酵产酸速度较慢。当柠檬酸一旦积累，发酵醪液的PH值迅速下降。如果糖化酶的耐酸性较弱，分解短链糊精的速度将大为下降，到发酵终点时，发酵醪液中残糖较高不能被利用。因此，在发酵开始后，柠檬酸产生菌黑曲霉的糖化酶的活力是影响柠檬酸产酸速率与发酵残糖的重要因素。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明目的是提供一种利用糖化酶筛选高产柠檬酸菌株的方法。为实现本发明的目的，本发明的主要技术路线如下:通过测定柠檬酸发酵过程中糖化酶和朽1檬酸含量，筛选朽1檬酸高产菌株。具体地，通过测定24小时、36小时的发酵醪液中的糖化酶含量和测定96小时的发酵醪液中的柠檬酸含量来筛选糖化酶与柠檬酸产生量高的柠檬酸高产菌株。上述技术方案具体包括以下步骤:(I)将黑曲霉孢子接入柠檬酸发酵摇瓶中，发酵培养；(2)将24小时、36小时发酵醪液中菌丝体过滤，测定滤清液中糖化酶含量；(3)将96小时发酵醪液中菌丝体过滤，测定滤清液中柠檬酸含量；(4)筛选糖化酶与柠檬酸产生量高的柠檬酸高产菌株。
其中，筛选糖化酶含量高的柠檬酸高产菌株的标准为糖化酶含量:24小时酶活力大于2500u/100ml、36小时酶活力大于1800u/100ml。筛选朽1檬酸含量高的朽1檬酸高产菌株的标准为:96小时朽1檬酸的含量大于15g/100ml。优选地，24小时酶活力 2500-2800u/100ml、36 小时酶活力 1800-2000u/100ml。筛
选朽1檬酸含量高的朽1檬酸高产菌株的标准为:96小时朽1檬酸的含量15-16g/100ml。其中，步骤(1)中黑曲霉孢子的发酵培养为常规方法培养。黑曲霉菌株包括各种不同来源的黑曲霉菌株。发酵培养基的配方例子为:所述的培养基为玉米粉按22%的质量百分比用自来水配制；在IL发酵培养基中加α -淀粉酶0.Γ0.5mL,由水浴锅控制液化温度，分段液化(65°C保温45min，然后升温至90°C后保温，直至终点)，以碘液不变色为液化终点。过滤后得液化清液。其中，所述玉米液化液中含糖量15 16%。发酵培养基中加入总重量1(Γ14%的玉米蛋白粉为有机氮源。培养条件的例子为:发酵条件为温度36-39°C，摇瓶转速为350-400r/min，培养时间 96h。本发明的积极效果在于:本发明中所述方法进行柠檬酸菌株的筛选，发酵菌株性能稳定，发酵前期产糖较快，柠檬酸积累速度较快，尤其突出表现为发酵终点发酵残糖低，残总糖在1.0%以下。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。黑曲霉菌株(ATCC16404)购自广东省微生物研究所。实施例1菌种分离用接种环取一环成熟孢子于装有无菌水及玻璃珠的三角瓶中，置于摇瓶机上震荡5分钟，使孢子悬浮于水中。取已灭菌的装有9mL无菌水试管数支，做好标号，另用无菌吸管吸取菌悬液lmL，注入I号试管，充分摇匀，使孢子均匀地悬浮在无菌水中。吸取此悬浮液ImL注入2号试管中，依次类推，直至最后一支试管。每稀释一管，必须更换一支无菌吸管。从最后2 3支试管中分别用无菌吸管吸取0.1mL放入无菌平板中，每个梯度做31块平板。对滴加孢子悬液的平板利用无菌刮棒进行涂布。将涂布后平板包好置培养箱中37°C培养40小时，选取菌丝白色、表面突起、边缘整齐、菌落较小、皱褶较深、孢子穗大而稀疏的黑曲霉菌落进入试管斜面。对不同菌落进行编号，分别为1#、2#、3#。实施例21#菌种摇瓶筛选情况1.摇瓶发酵培养基的制备将玉米粉按22%的粉浆比调浆，加入0.Γ0.5mL/L α -淀粉酶，由水浴锅控制液化温度，分段液化(65°C保温45min，然后升温至90°C后保温，直至终点)，以碘液不变色为液化终点(液化液含糖量为15-16%)，过滤后得液化清液，加入总重量1(Γ14%的玉米蛋白粉的有机氮源。2.接种培养条件:
摇瓶培养基121°C灭菌30min，冷却后备用。在净化台上按无菌操作每只摇瓶接入一环黑曲霉孢子。接种后摇瓶置摇床上，转速为400rpm/min, 39°C培养96hr,离心后测酸。3、检测结果发酵周期在24、36小时时，将发酵瓶从摇瓶机上取下，将发酵醪液用滤纸过滤，取滤液进行糖化酶酶活的测定。发酵96小时后，将发酵瓶从摇瓶机上取下，将发酵醪液用滤纸过滤，取滤液Iml用
0.1429mol/L的氢氧化钠溶液滴定终点(以酚酞为指示剂)。1#试管斜面菌种摇瓶筛选见表1，以3次结果的平均值计量。表11#试管斜面菌种摇瓶筛选结果
权利要求
1.一种利用糖化酶筛选高产柠檬酸菌株的方法:其特征在于，通过测定柠檬酸发酵过程中糖化酶和朽1檬酸含量，筛选朽1檬酸高产菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，测定24小时、36小时的发酵醪液中的糖化酶含量。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，测定96小时的发酵醪液中的柠檬酸含量。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，具体包括以下步骤: (1)将黑曲霉孢子接入柠檬酸发酵摇瓶中，发酵培养； (2)将24小时、36小时发酵醪液中菌丝体过滤，测定滤清液中糖化酶含量； (3)将96小时发酵醪液中菌丝体过滤，测定滤清液中柠檬酸含量； (4)筛选糖化酶与朽1檬酸含量高的朽1檬酸高产菌株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，筛选糖化酶含量高的柠檬酸高产菌株的标准为糖化酶含量:24小时酶活力大于2500u/100ml、36小时酶活力大于1800u/100ml。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,筛选朽1檬酸含量高的朽1檬酸高产菌株的标准为:96小时朽1檬酸的含量大于15g/100ml。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中的发酵培养基含有玉米液化液。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中的发酵培养条件为发酵条件为发酵温度36-39°C，摇瓶转速为350-400r/min，培养时间96h。
全文摘要
本发明涉及一种利用糖化酶在筛选高产柠檬酸菌种中的方法。包括通过测定柠檬酸发酵过程中糖化酶和柠檬酸含量，筛选糖化酶含量高的柠檬酸高产菌株。本发明方法筛选的发酵菌株性能稳定，发酵前期产糖较快，柠檬酸积累速度较快，尤其突出表现为发酵终点发酵残糖低，残总糖在1.0%以下。
文档编号C12R1/685GK103074235SQ20121058365
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者李荣杰, 尚海涛, 杨为华, 邓远德, 穆晓玲, 李维理 申请人:安徽丰原发酵技术工程研究有限公司