专利名称：Dna过氧化物酶及其制备方法、用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶学领域，具体地说是一种二重复单元DNA G-四链体-血红素DNA过氧化物酶及其制备方法、用途。
背景技术：
众所周知，酶是具有催化功能的生物大分子，它的特点是具有高度的专一性和很高催化活性。过去人们以为酶只能由蛋白质组成，但1981年T.R. Cech等发现了核酸也具有催化反应的能力，提出了核酶的概念。1994年R. R. Breaker证明了 DNA也具有酶的活性。1996年Dipankar Sen课题组发现了 DNA过氧化物酶,它不仅能够催化核酸链上的反应，还能像普通催化剂那样参与催化氧化反应。目前发现了各种各样的DNA过氧化酶具有不同的催化活性。DNA过氧化物酶能够氧化显色底物发生颜色的变化，在分析检测不同类型的靶分子中表现出十分优良的特性。首先，与蛋白质构成的酶相比，DNA过氧化物酶稳定性更高，而且DNA的合成与纯化过程远比蛋白质容易得多，最重要的是在操作过程中不容易失活；其次，DNA过氧化物酶的获得比较方便，只需将DNA片段在适当的条件下与Hemin (血红素)混匀即可。
随着对DNA过氧化物酶深入研究，人们发现能形成G-四链体的核酸序列就有可能存在DNA过氧化物酶活性。2009年Chengde Mao课题组发现很多物种的端粒DNA序列与Hemin结合后可以具有DNA过氧化物酶的活性，其中也包括了能够形成G-四链体的人类端粒DNA (TTAGGG)n序列。首先DNA G-四链体-Hemin DNA过氧化物酶能够催化H2O2氧化ABTS2.生成绿色ABTS'可作为一种新型的颜色反应标签应用于检测之中。其次DNA G-四链体-Hemin DNA过氧化物酶具有酶的活性，能够放大反应信号，从而提高检测的灵敏度。研究表明85%以上的肿瘤细胞中端粒酶表达呈阳性，而正常细胞中几乎检测不到端粒酶，这说明端粒酶与细胞的恶性转化及维持分裂增殖具有密切的关系。端粒DNA G-四链体结构的形成能够有效地抑制端粒酶的活性，因而靶向端粒DNA G-四链体并使其稳定的配体成为抗癌药物研究的新方向。在G-四链体稳定剂类抗癌药物的开发过程中，建立一种既简便又快速的药物大批量筛选方法是必不可少的。G-四链体可以与Hemin结合而显示出较强的酶活性，并且文献报道，Hemin主要作用于G-四链体末端的G-四分体上；G_四链体稳定剂也需要与G-四链体结合而对该结构起到稳定作用，若两者在G-四链体的结合位点相同或相接近，G-四链体稳定剂与G-四链体结合有可能有效的阻碍Hemin与G-四链体结合，导致体系中酶的催化活性降低，并且文献报道，G-四链体稳定剂也主要堆积在G-四链体末端的G-四分体上。利用体系中信号强度随时间的变化关系，比较不同药物与G-四链体的作用能力，可实现G-四链体稳定剂类抗癌药物的大批量筛选。但过去研究的都是单体DNA G-四链体稳定剂，这些单体DNA G-四链体一般由21-26个碱基组成，然而3’末端单链人类端粒DNA实际上由100-200碱基组成，很多研究表明其能够形成连续的多重复单元DNA G-四链体。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有的技术不足，提供一种二重复单元DNA G-四链体-血红素DNA过氧化物酶，具有更高的催化活性，从而在检测中可以扩大反应信号，提高检测灵敏度，降低最低检测下限的范围，可以实现多重复单元DNA G-四链体稳定剂类抗癌药物的大批量筛选及高灵敏度的分析检测不同类型的靶分子，利用二重复单元DNA G-四链体-Hemin DNA过氧化物酶比较出了不同配体与二重复单元DNA G-四链体的结合能力。本发明解决上述技术问题采用的技术方案是一种DNA过氧化物酶，其特征是其分子结构如下述通式(I ):
权利要求
1.一种DNA过氧化物酶，其特征是其分子结构如下述通式(I ):
2.一种制备权利要求1所述DNA过氧化物酶的方法，其特征是包括下列步骤 (1)试剂和缓冲液 血红素溶解于二甲基亚砜中制备成血红素溶液，2 8°C保存； 用去离子水配制氯化钾溶液； 用去离子水配制PH值为7. O 8. OTris-HCl缓冲液； (2)T8 DNA的预处理 固体样品T8 DNA在4 °C经离心机以12000 r .mirf1高速离心5 10 min,并在一20°C保存，使用前用去离子水配制成T8 DNA溶液，4°C保存,3天内使用； (3)二重复单元DNA G-四链体的制备 取步骤(2)配制的T8 DNA溶液放入到5ml离心管中，加入步骤(I)配制的氯化钾溶液、Tris-HCl缓冲溶液，使T8 DNA处于含KCl浓度100mM、含Tris-HCl浓度25mM、pH值为7. O 8. O的溶液中，混均，在90°C水浴锅中加热5 lOmin，缓慢冷却至室温； (4)二重复单元DNA G-四链体-血红素DNA过氧化物酶的制备 在步骤(3)的离心管中加入步骤(I)配制的血红素溶液，轻轻摇晃使其混均，静置2 3h。
3.一种如权利要求1所述DNA过氧化物酶，其特征是作为大批量筛选多重复单元DNAG-四链体稳定剂类抗癌药物及高灵敏度的分析检测不同类型靶分子的应用。
全文摘要
本发明涉及一种酶学领域，具体地说是一种DNA过氧化物酶，其分子结构如下述通式(Ⅰ)(Ⅰ)，本发明二重复单元DNAG-四链体-血红素DNA过氧化物酶具有更高的催化活性，从而在检测中可以扩大反应信号，提高检测灵敏度，降低最低检测下限的范围，可以实现多重复单元DNAG-四链体稳定剂类抗癌药物的大批量筛选及高灵敏度的分析检测不同类型的靶分子，利用二重复单元DNAG-四链体-血红素DNA过氧化物酶比较出了不同配体与二重复单元DNAG-四链体的结合能力。
文档编号C12Q1/28GK103060282SQ201210582990
公开日2013年4月24日 申请日期2013年2月25日 优先权日2013年2月25日
发明者赵艳, 高丹丹 申请人:威海东宝制药有限公司