修整的重组酶用于治疗逆转录病毒感染的用途的制作方法

专利名称：修整的重组酶用于治疗逆转录病毒感染的用途的制作方法
修整的重组酶用于治疗逆转录病毒感染的用途
本发明涉及用于制备编码修整的(tailored)重组酶的表达载体的方 法，其中所述修整的重组酶使插入宿主细胞的基因组内的逆转录病毒的 原病毒DNA的LTR内的不对称靶位点重组。识别原病毒DNA的LTR 内的不对称粑位点的此种修整的重组酶是用于从宿主细胞的基因组中 切除原病毒的工具。本发明进一步涉及修整的重组酶用于制备用于减少 受逆转录病毒感染的受试者中的病毒量的药物组合物的用途。最优化受 试者的逆转录病毒感染的治疗的体外方法是本发明的进一步目的，所述 体外方法包括修整特异性识别和重组不对称靶位点序列的重组酶，所述 不对称耙位点序列在受试者由其感染的逆转录病毒的原病毒DNA内。
背景技术：
逆转录病毒感染例如经由人免疫缺陷病毒(HIV)的感染仍是最重 要和最普遍的人疾病之一。
就AIDS而言，估计39,500,000人与引起AIDS的逆转录病毒HIV 一起生活。近期数据显示甚至在2006年，对于世界上的某些区域存在 约4,300,000例新感染，在所述区域中感染率自2004年以后已升高超过 50% 。此外，在2006年，根据由WHO (在2006年12月)公开的2006 年AIDS流行最新资料，约2,900,000人死于AIDS相关疾病。
应用的抗逆转录病毒治疗的主要目标是减少HIV相关的发病率和 死亡率，生活质量的改善，免疫功能的恢复和保持，以及病毒量的最大 和持久抑制。当今的抗逆转录病毒治疗，更确切地针对HIV的治疗方案 主要依赖于抑制病毒-细胞融合的病毒酶抑制剂和分子。
在这点上存在用于治疗AIDS的目前可用的4类抗HIV药物。这些 药物类别靶向HIV复制过程中的特定步骤。
融合抑制剂(FI)是第一类活性剂，其在宿主细胞外起作用，以阻 止HIV与这些细胞融合、进入这些细胞并且感染这些细胞。相关方法是 阻止HIV经由在靶细胞表面上的CD4受体和称为CCR5或CXCR4的共 同受体与靶细胞的结合。
其他3类活性剂在细胞内起作用。在宿主细胞已感染HIV后，所谓
8的核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)和 蛋白酶抑制剂(PI)用于阻止病毒在宿主细胞内复制。
阻止HIV制备其遗传信息的拷贝(因此产生所谓的原病毒DNA) 的NRTIs和NNRTIs例子是3TC (拉米夫定，贺普丁 )、阿波卡韦(赛 进(Ziagen) ) 、 AZT (齐多夫定，叠氮胸苷)、d4T (司他夫定，泽瑞 特)、ddC (扎西他宾，唑西他宾(Hivid) ) 、 ddl (双脱氧腺苷，去羟 肌苷(Videx) /VidexEC ) 、 FTC (恩曲他滨(emtricitabine ) , Emtriva)、 依非韦伦(Sustiva)和奈韦拉平(Vi腦une)。
PIs靶向涉及病毒装配的HIV蛋白酶。关于这些活性剂的例子是氨 》发刃，韦(Agenerase)、阿4L"，韦(atazanavir) ( Reyataz) 、 p夫山另[5韦 (fosamp腿vir) ( Telzir)、吲咮那韦(英地那韦)、洛匹那韦(lopinavir)、 奈非那韦(Viracept)、利托那韦(Novir)和沙喹那韦(曱磺酸沙喹那 韦/复得维)。
目前使用的涉及使用超过一种活性剂的 一类组合疗法是靶向病毒 逆转录酶、蛋白酶和融合的高效抗逆转录病毒疗法(HAART ) ( GULICK 等人，1997; LALEZARI等人，2003 )。这种疗法的应用已导致使HIV-1 感染转化成慢性疾病，所述慢性疾病已减少受感染个体的发病率。
然而，所有目前治疗策略的 一个缺点是它们仅抑制病毒生活周期而 不根除感染。此种疗法中的主要障碍看起来是HIV-1长寿命储库 (reservoir)的确立，特别是在潜伏感染的静息CD4+T细胞中(CHUN 等人，1998; FINZI等人，1997),需要终身的HAART。
不幸的是，在越来越多数目的患者中，长期HAART伴随显著的不 利副作用，包括线粒体毒性、脂质营养不良、糖尿病和骨质疏松症 (DYBUL等人，2002)。基本药物毒性通常导致不足够的粘附，导致 病毒复制的亚最佳抑制。因此，正在出现对抑制治疗有抵抗力的HIV-1 的新毒抹(LITTLE等人，2002)。考虑到越来越多数目的抗性HIV毒 株，新活性剂是必需的且目前在开发中。此外，其他的病毒靶和新型抑 制策略就改善的HIV-1控制进行测试(DONZELLA, 1998; CHIU等人， 2005; HAZUDA等人，2004; HAUBER等人，2005 )。
在本领域中讨论的可替代方法耙向插入宿主细胞的基因组内的原 病毒。从宿主的基因组中切除原病毒DNA例如将阻止进一步的HIV复 制，并且不同于目前方法，因为它具有根除甚至存在于宿主的基因组中的休眠病毒的潜力。
考虑用于在这种可替代方法中使用的一类蛋白质是位点特异性重
组酶(FLOWERS等人，1997)。位点特异性重组酶在自然界中介导从 基因重排到基因组分离的许多功能，例如限定DNA单位的切除、倒转 或整合(在STARK等人，1992中综述)。
最简单和最了解的重组酶之一是来自噬菌体Pl的Cre重组酶，其 通过在特定序列的2个相同双链DNA位点之间重组使基因组二聚体解 离成单体(HOESS & ABREMSKI， 1985 )。 Cre重组酶已在小鼠遗传学 中发现了广泛用途(NAGY, 2000) 。 Cre是以其功能命名的38kDa蛋 白质，因为它引起重组(STERNBERG & HAMILTON, 1981)。关于这 种重组的先决条件是在反平行方向上由Cre识别的2个重组位点的排 列，所述重组位点随后由连接以构成环的4个相同的Cre亚单位结合， 其中每个亚单位接触2个邻近亚单位和一个重组位点的一半位点 (HOESS & ABREMSKI, 1985 )。由Cre识别的重组位点是称为/ojcP (来自交换(x)的基因座，PI; STERNBERG & HAMILTON, 1981) 的34-bp双链DNA序列，除了其8个最里面的碱基对(称为间隔区) 外它是回文的，这对位点赋予方向性。
一些位点特异性重组系统包括Cre/loxP系统，无需辅助蛋白质或辅 因子而发挥作用，并且在广泛多样的细胞条件下发挥作用。然而，因为 位点特异性重组酶通过重组酶亚单位与其相关DNA靶序列的特定相互 作用而发挥作用，所以这些酶的使用受下述必要条件限制耙向的DNA 区域必须包含合适定位的靶位点(LEWANDOSKI, 2001 )。迄今为止， 尚未鉴定识别天然逆转录病毒序列作为其DNA靶序列的野生型重组酶。 近年来已进行位点特异性重组酶的广泛突变和结构分析，以改变其 性质且达到对这些酶的复杂机制的良好理解(关于综述参见VAN DUYNE, 2001;和COATES等人，2005 )。许多研究集中于Cre重组 酶以4笨究其可进化性(evolvability)。几项研究证实当Cre的/o义P识别 位点中的少数核苷酸改变时，Cre革巴特异性可以改变(BUCHHOLZ & STEWART, 2001; SANTORO & SCHULTZ, 2002; RUFER & SAUER, 2002)。进一步的研究致力于工程改造包含来自HIV-1的LTR的序列的 突变/oxP靶位点，以开发可能的靶位点用于使用Cre作为抗病毒策略 (LEE & PARK, 1998; LEE等人，2000)。然而，迄今为止，仍不能产生识别天然不对称HIV序列作为其DNA靶序列的重组酶。
定向进化的方法是选择具有改变特异性的酶的有力方法(在Yuan 等人，2005;和JOHANNES & ZHAO, 2006中综述)。最初，这种方 法通过选择具有改变的底物位点的RNA分子用于基于RNA来分离改善 的酶。基于PCR的方法的使用允许筛选非常大的文库并且从候选物库中 回收成功的编码区。在蛋白质的定向进化中，相比之下，关于通过蛋白 质的性质中的改变进行鉴定的改善突变体的筛选和回收，需要用于寻找 编码蛋白质的核酸序列的方法。蛋白质及其编码序列之间的关联通常已 通过区室化进行维持。因此，定向蛋白质进化中的文库筛选已限于维持 区室的"一个一个地(one-by-one)"方法，并且与筛选候选物库相关的 优点仍不可用。
这种局限性已通过这样的方法的开发而得到克服，所述方法允许使 用mRNA-蛋白质融合和核糖体展示使蛋白质与其分别的信使RNAs (mRNAs )交联。关于改善的蛋白质性质的功能筛选因此与相应编码分 子的直接寻找偶联，并且大库已在体外进行筛选(参见例如BUCHHOLZ 等人，1998)。定向蛋白质进化的进一步改善通过所谓的底物关联的蛋 白质进化(SLiPE; BUCHHOLZ & STEWART, 2001 )而达到，其中将 重组酶的底物置于与蛋白质编码区相同的DNA分子上。以这种方式， 当重组酶在区室内表达时，它的作用改变与其自身编码区领接的DNA 底物。因此，文库可以作为库通过PCR进^f亍筛选，以但J又扩增与改变的 底物领接的候选编码区。这允许筛选对于成功编码区的快速寻找方便的 大文库。应用这种方法以改变Cre重组酶的DNA特异性，并且4吏其适 应新识别把位点(BUCHHOLZ & STEWART, 2001 )。
然而，使用任何重组酶用于切除逆转录病毒DNA的决定性缺点是 需要关于对称靶位点的重组酶，所述对称靶位点一般在原病毒DNA中 未发现至少2次，以允许使用现有重组酶。
考虑到位点特异性重组酶的潜力和发现从宿主细胞的基因组中根 除HIV-1原病毒的AIDS疗法的需要，作为本发明基础的问题因此在于 提供用于制备修整的重组酶的方法，所述修整的重组酶使插入宿主细胞 的基因组内的逆转录病毒的原病毒DNA的LTR内的不对称革巴位点重 组，从而/人宿主细月包的基因组中切除原病毒。发明概述
根据本发明的第一个方面，提供了用于制备编码修整的重组酶的表 达载体的方法，所述修整的重组酶使插入宿主细胞的基因组内的原病毒
DNA的LTR内的不对称靶位点重组，所述方法包括下述步骤，
(a) 测定原病毒DNA的LTR序列，鉴定其中与重组酶的已知靶 位点的左半位点和右半位点序列具有至少30%同源性的序列，其中同源 序列由5-12个核苷酸的间隔区分开，并且其中与已知靶位点具有最高同 源性的同源LTR序列代表不对称靶序列；
(b) 制备2种合成序列，其中第一种合成序列对应于步骤(a)与 所述已知把位点的左半位点同源的不对称靶序列的序列加上间隔区序 列，且称为"半位点序列1"，且其中第二种合成序列对应于间隔区序列 加上步骤(a)与右半位点同源的不对称靶序列的序列，且称为"半位点 序列2";
(c) 测定在步骤(b)的合成序列内偏离步骤(a)的已知同源靶 位点的相应同源左半位点和右半位点序列的核香酸；
(d) 基于步骤(b)的合成序列产生2种靶序列的第一个子集 (subset)，其中第一个子集中的第一种靶序列包含由通过间隔区序列
分开的步骤(a)的半位点序列l和半位点序列l'组成的反向重复，且其 中第一个子集中的第二种靶序列包含由通过间隔区序列分开的半位点 序列2'和步骤(b)的半位点序列2组成的反向重复，其中半位点序列 l'和2'代表步骤(b)分别的半位点序列l和2的反向重复；
(e) 基于步骤(d)的第一个子集中的靶序列产生靶序列的第二个 子集，其中通过基于所选择的半位点序列构成反向重复，步骤(d)的 笫 一个子集中的靶序列的每个半位点序列连同分别的间隔区序列用于 产生第二个子集的独立靶序列，从而使得间隔区序列使构成反向重复的 2个序列分开，其中源于步骤(d)的第一个子集中的靶序列之一的2个
列的反向重复前改变，、从而使得在左半位点序列中，偏离曰步骤(a)的 已知粑位点的相应同源半位点序列的核苦酸部分由已知粑位点中发现 的天然核苷酸替换，并且在右半位点序列中，偏离相应同源左半位点的 其余核苷酸由已知靶位点中发现的天然核苷酸替换，从而使得合起来看 在源于步骤(d)的第一个子集的一种靶序列的2个半位点序列中，可
12以发现所有偏离核苷酸，而所述半位点序列无一单独包含所有偏离核苷
酸；
(f) 通过逐步重复步骤(e)的过程，从步骤(e)中获得的所述第 二个子集中的靶序列开始产生靶序列的进一步子集，每次产生靶序列的 一个新子集，直至在每个所产生的靶序列内构成反向重复的半位点序列 包含偏离已知靶位点的相应同源半位点序列的1、 2或3个核苷酸；
(g) 将分子定向进化应用于识别步骤(a)中所选择的已知同源靶 位点的重组酶，其中使用步骤(f)中获得的最终子集的耙序列作为底物， 所述靶序列包含偏离所述已知同源耙位点的相应同源半位点序列的1 、 2 或3个核苷酸；
(h) 改组步骤(g)中进化的重组酶文库；
(i) 将分子定向进化应用于步骤(h)中获得的改组文库，其中使 用根据步骤(f)的邻近更高子集的粑序列；
(j)重复步骤(h)和(i)，直至通过分子定向进化取得至少一种 重组酶，其对于步骤(a)的在逆转录病毒DNA的LTR内的不对称革巴序 列有活性；
(k)从文库中分离步骤(j)中获得的至少一种重组酶的核酸；和 (1)将步骤(k)中获得的核酸克隆到合适的表达载体内。
在优选实施方案中，在步骤(g)和(i)中分子定向进化应用于其 的重组酶衍生自丝氨酸整合酶家族或酪氨酸整合酶家族，并且优选是来 自噬菌体Pl的经^修饰的Cre重组酶、来自酵母的经^^饰的FLP重组酶 或来自噬菌体D6的经修饰的Dre重组酶。优选地，分子定向进化是底 物关联的蛋白质进化(SLiPE)。编码修整的重组酶的表达载体优选是 逆转录病毒载体、慢病毒载体、泡沫病毒载体或腺病毒载体。
本发明的第二个方面涉及编码修整的重组酶的表达载体、或包含所 述表达载体的成体干细胞在制备药物组合物中的医学用途，所述药物组 合物用于减少受逆转录病毒感染的受试者中的病毒量。药物组合物可以 施用于受试者，以治疗经由广泛多样的逆转录病毒例如HIV的感染。本 发明的药物组合物优选用于与高效抗逆转录病毒疗法(HAART )的其他 活性剂伴随施用，或者用于与总体免疫激活疗法或原病毒基因表达的特 异性激活伴随或在其之后施用。
根据本发明的第三个方面，提供了最优化受试者的逆转录病毒感染的治疗的体外方法，其中所述方法包括下述步骤
(a) 测定患者血样中存在的逆转录病毒DNA的核酸序列；
(b) 就已知重组序列扫描步骤(a)的序列的LTR序列，对于所述 重组序列已制备特异性修整的重组酶；
(c) 倘若至少一种所述已知重组序列存在，那么将选自下述的化 合物制备为药物组合物，以用于减少受试者中的病毒量包含特异性识 别所述已知重组序列的修整的重组酶的核酸的表达载体、所述修整的重 组酶、包含所述修整的重组酶的氨基酸序列的融合蛋白或包含所述表达 载体的成体干细胞；否则鉴定与重组酶的已知靶位点的左半位点和右半 位点序列具有至少30%同源性的序列，并且命名为"不对称靶序列"，其 中同源序列通过5-12个核苷酸的间隔区分开；
(d) 执行用于制备编码修整的重组酶的表达载体的前述方法的步 骤(b)至(1)，所述修整的重组酶使原病毒DNA的LTR内鉴定的不 对称靶序列特异性重组；和
(e) 将步骤(d)中获得的表达载体、由所述表达载体表达的蛋白 质或融合蛋白或者由所述表达载体转染或感染的干细胞制备为药物组 合物，用于减少受试者中的病毒量。
在优选实施方案中，将步骤(d)中应用的定向分子进化应用于修 整的重组酶，所述修整的重组酶已识别与野生型重组酶的那种不同的粑 位点。
在另一个优选实施方案中，在前述方法中获得的修整的重组酶包括 在特异性修整的重组酶的集合内。
本发明进一步涉及各自识别原病毒的基因组内的不同粑位点的修 整的重组酶集合。
发明详述
本发明人首次提供了使用组合底物关联的蛋白质进化方法产生修 整的重组酶的方法，所述修整的重组酶识别整合到宿主细胞的基因组内 的原病毒序列内的不对称序列。
适应的实验室方法。因此，它是选择具有改变特异性的酶的有力方法 (YUAN等人，2005, JOHANNES & ZHAO, 2006)。定向进化的一个先决条件是起始酶具有残余活性以允许进化策略成功(BLOOM等人， 2005 )。对底物没有活性的酶不太可能产生目前作用于远缘靶的变体。 本发明的方法还可以应用于修整一般而言的DNA修饰蛋白质。然 而，重组酶是优选的。术语"DNA修饰蛋白质"意欲包括其活性引起核酸 的序列或结构中的变化的任何蛋白质。适合于通过本发明的方法修整的 DNA修饰蛋白质的例子包括涉及同源重组的蛋白质、外切核酸酶、DNA 甲基化酶、DNA连接酶、限制性内切核酸酶、拓朴异构酶、转座酶和解 离酶。
尽管通过定向进化获得的修整的重组酶的潜力已得到广泛公认(参 见例如Collins等人，2003 ),然而，迄今为止没有方法在改变重组酶 使天然存在的逆转录病毒序列重组的性质方面是成功的。FLOWERS等 人(1997)已显示当病毒包含野生型/o;cP位点时，Cre可以减少细胞中 的病毒量。LEE等人(2000)进一步证实，Cre可以使选自HIV-1基因 组的间隔区序列重组。这些方法中的关键问题是一般HIV-1 LTRs不携 带由天然存在的重组酶识别的对称靶位点，例如Cre重组酶识别具有8 bp间隔区的对称的13 bp反向重复。这种局限性已由SARAF-LEVY等 人(2006)解决，他们开发了异种特异性重组酶，各自与在序列中不同 的靶序列的一半侧结合。作者显示在此种方案中，2种不同的重组酶可 以一起4吏不对称^/f立点重组。然而，这种方法具有2种不同重组酶将必 须存在于靶细胞中的主要缺点。总之，本领域迄今为止开发的方法无一 能够递送单一重组酶，所述重组酶能够使逆转录病毒基因组中天然存在 的序列重组。
本发明人首次认识到重组酶可以进行修整，以识别与其天然对称靶 位点不同的不对称耙位点，这通过将底物分裂成与原始靶具有较小差异 的许多新子集，并且逐步修整重组酶以识别这些子集来实现(参见

图1 )。 此外，组合方法随后允许选择识别给定序列内的不对称靶位点的功能分 子。因此，使用在定向分子进化过程中穿过底物中间体的新方法，本发 明人能够生产具有远缘的新不对称靶特异性的酶。
本发明用于制备编码使插入宿主细胞的基因组内的原病毒DNA的 LTR内的不对称耙位点重组的修整的重组酶的表达载体的方法产生编 码修整的重组酶的表达载体，所述修整的重组酶使与野生型重组酶的草巴 位点不同的不对称耙位点重组。本发明的方法包括下述步骤
15(a) 测定原病毒DNA的LTR序列，鉴定其中与重组酶的已知靶 位点的左半位点和右半位点序列具有至少30%同源性的序列，其中同源 序列由5-12个核苷酸的间隔区分开，并且其中与已知靶位点具有最高同 源性的同源LTR序列代表不对称靶序列；
(b) 制备2种合成序列，其中第一种合成序列对应于步骤(a)与 所述已知靶位点的左半位点同源的不对称靶序列的序列加上间隔区序 列，且称为"半位点序列1"，且其中第二种合成序列对应于间隔区序列 加上步骤(a)与右半位点同源的不对称耙序列的序列，且称为"半位点 序列2";
(c) 测定在步骤(b)的合成序列内偏离步骤(a)的已知同源靶 位点的相应同源左半位点和右半位点序列的核苷酸；
(d) 基于步骤(b)的合成序列产生2种靶序列的第一个子集，其 中第 一个子集中的第 一种靶序列包含由通过间隔区序列分开的步骤(a) 的半位点序列l和半位点序列l'组成的反向重复，且其中第一个子集中 的第二种耙序列包含由通过间隔区序列分开的半位点序列2'和步骤(b) 的半位点序列2组成的反向重复，其中半位点序列l'和2'代表步骤(b) 分别的半位点序列1和2的反向重复；
(e) 基于步骤(d)的第一个子集中的靶序列产生靶序列的第二个 子集，其中通过基于所选择的半位点序列构成反向重复，步骤(d)的 第 一个子集中的靶序列的每个半位点序列连同分别的间隔区序列用于 产生第二个子集的独立靶序列，从而使得间隔区序列使构成反向重复的 2个序列分开，其中源于步骤(d)的第一个子集中的靶序列之一的2个
列的反向重复前改变，从而使得在左半位点序列中，偏离步骤(a)的 已知把位点的相应同源半位点序列的核普酸部分由已知耙位点中发现 的天然核芬酸替换，并且在右半位点序列中，偏离相应同源左半位点的 其余核苷酸由已知耙位点中发现的天然核苷酸替换，从而使得合起来看 在源于步骤(d)的第一个子集的一种靶序列的2个半位点序列中，可 以发现所有偏离核苷酸，而所述半位点序列无一单独包含所有偏离核苷 酸；
(f) 通过逐步重复步骤(e)的过程，从步骤(e)中获得的所述第 二个子集中的靶序列开始产生靶序列的进一步子集，每次产生靶序列的一个新子集，直至在每个所产生的靶序列内构成反向重复的半位点序列
包含偏离已知靶位点的相应同源半位点序列的1、 2或3个核苷酸；
(g) 将分子定向进化应用于识别步骤(a)中所选择的已知同源靶 位点的重组酶，其中使用步骤(f)中获得的最终子集的靶序列作为底物， 所述靶序列包含偏离所述已知同源靶位点的相应同源半位点序列的1 、 2 或3个核苷酸；
(h) 改组步骤(g)中进化的重组酶文库；
(i) 将分子定向进化应用于步骤(h)中获得的改组文库，其中使 用根据步骤(f)的邻近更高子集的靶序列；
(j)重复步骤(h)和(i),直至通过分子定向进化取得至少一种 重组酶，其对于步骤(a)的在逆转录病毒DNA的LTR内的不对称靶序 列有活性；
(k)从文库中分离步骤(j)中获得的至少一种重组酶的核酸；和 (1)将步骤(k)中获得的核酸克隆到合适的表达载体内。 在本发明方法的步骤(a)中，测定原病毒DNA的LTR序列，例 如通过使用链终止剂的DNA测序(SANGER等人，1977)。然而，如 果插入宿主的基因组内的逆转录病毒DNA的LTR序歹'j已得到测定，那 么这个步骤可以省略。进一步可能使用可从序列数据库中获得的已知序 列。基于序列信息，进行序列信息的基于计算机的分析，以鉴定其中分 别与已知重组酶的已知靶位点的左半位点和右半位点序列具有至少30 %同源性的序列，所述序列由5-12个核苦酸的合适间隔区分开。
如本文所使用的，术语"重组酶"指涉及重组的蛋白质。同样地，重 组酶识别且结合2种特定DNA序列，所述DNA序列称为"重组位点"或 "耙位点"，并且介导这2个耙位点之间的重组。因此，术语"重组酶，，意 指任何重组系统的任何蛋白质组分，其介导特定DNA基因座中的DNA 重排。天然存在的重组酶识别由2个相同序列组成的对称把位点，所述 相同序列称为"半位点"，具有约9-20bp,构成反向重复，其中半位点序 列由5-12bp的间隔区序列分开。
应当指出在本发明中以及在本领域中，术语"靶序列"、"靶位点，，和 "重组位点"可互换使用。
与识别对称靶位点的天然存在的重组酶相反，本发明的方法提供了 识别耙位点的修整的重组酶，所述耙位点不由通过间隔区分开的回文序列组成。相反，在不对称靶位点中，序列不构成对称反向重复。因此， 能够识别不对称耙位点的修整的重组酶应识别靶位点且使靶位点重组， 所述耙位点由各种序列的半位点组成。
在不对称把位点内，分别称为"左半位点"和"右半位点"的序列通过
其与已知靶位点的左和右半位点的同源性进行限定。位于与已知靶位点 的左和右半位点同源的序列之间的序列称为间隔区。
然而，如果在LTR中发现仅与已知靶位点的左或右半位点序列具有 同源性的序列，那么这些序列仍可以在本发明的实践中使用。属于重组 酶的耙位点的大小是技术人员已知的，所述重组酶的天然靶序列显示与 LTR内的序列的同源性。例如，如果在LTR序列内发现与由Cre重组酶 识别的耙序列的同源性，那么由Cre重组酶识别的不对称靶位点应由34 个核苦酸组成，其具有13个核苦酸的2个半位点序列，各自由8个核 苦酸的间隔区分开。因此，LTR内的同源序列定义为不对称耙位点的左 或右半位点或间隔区，这依赖于与已知靶位点的序列的同源性。因此， 与已知耙序列的左半位点具有同源性的序列定义为左半位点，与已知靶 序列的右半位点具有同源性的序列定义为右半位点。从这个定义开始， 不对称耙位点的其他部分考虑已知耙位点的结构进行定义。因此，已关 于与/oxP位点(由Cre重组酶识别)的同源性定义了例如在LTR内的 右半位点序列后，对应于不对称把序列的间隔区和左半位点的其他序列 可以容易地进行定义。间隔区序列例如通过计数定义为右半位点序列的 序列的5'末端上游的8个核苷酸进行定义，而左半位点序列通过计数先 前定义的间隔区序列5'末端上游的13个核普酸类似地进行定义。
在这个背景中以及在整个申请中的同源性意指序列相似性或同一 性，其中同一性是优选的。用于同源性目的的优选比较是使用本领域已 知的标准技术比较至少2个序列，所述标准技术包括但不限于，SMITH & WATERMAN ( 1981 )的局部同源性算法、NEEDLEMAN & WUNSCH (1970 )的同源性比对算法、或PEARSON & LIPMAN ( 1988 )的搜索 相似性方法。为了本申请的目的，同源性优选使用可从欧洲生物信息学 会(European Bioinformatics Institute ) ( EBI)获得的ClustalW计算机 程序进行测定，除非另有说明。
考虑到原病毒的基因组中必须存在2个相同靶位点以允许重组酶切 除这2个靶位点之间的序列的必要条件，在本发明方法的步骤(a)中
18扫描在基因组中至少出现2次的原病毒DNA序列。此种序列是例如原 病毒DNA的LTR序列。因此，优选扫描LTR序列，因为原病毒DNA 的5'-LTR和3'-LTR是相同的。5'-LTR中存在的不对称靶位点也存在于 3'-LTR中，且因此允许切除位于LTRs之间的原病毒DNA。
在LTR序列内鉴定的与已知靶位点具有足够同源性的序列中，优选 选择与已知重组酶的靶位点的序列具有最高同源性的序列。然而，也可 能选择除具有最高同源性的那些外的序列。
应当指出本发明方法的潜力甚至允许修整识别与已知靶位点具有 小于30%同源性的不对称靶位点的重组酶。然而，为了确保关于分别的 不对称耙位点的残余重组活性的存在，优选扫描与已知重组酶的已知靶 位点的左半位点和右半位点序列具有至少30%同源性的序列。在进一步 优选的实施方案中，扫描与已知重组酶的已知靶位点的左半位点和右半 位点序列具有31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80%,更优选85 % ,特别优选90 %和最优选95 %同 源性的序列。
在本发明的优选实施方案中，在LTR内选择的序列与由位点特异性 重组酶Cre识别的对称/o义P耙位点具有同源性。在更优选的实施方案中， 不 对 称 靶 位 点 的 序 列 是 5'-ACAACATCCTATTACACCCTATATGCCAACATGG-3' ( SEQ ID NO: 2 )(图2A)。
在步骤(b)中，在LTR内所选择的与已知粑位点同源的序列用于 制备2种合成序列。这些合成序列通过本领域已知的方法制备为寡核苷 酸序列。第一种合成序列(称为"半位点序列1")的序列对应于在原病 毒的LTR内与已知靶位点的左半位点同源的所选择的不对称靶位点的 序列，并且包括在代表左和右半位点的序列之间称为间隔区的序列。第 二种合成序列对应于间隔区序列和在原病毒的LTR内与已知靶位点的 右半位点同源的所选择的不对称靶位点的序列。这个第二种寡核普酸序 列称为"半位点序列2"。
2种合成序列中的间隔区序列优选是相同的，并且对应于代表或定 义为不对称靶位点的间隔区序列的LTR序列。然而，在进一步的实施方案中，2种合成序列的间隔区序列包含一个或两个序列差异。差异优选 是保留间隔区序列的原始长度的核苷酸置换。
在步骤(c)中，偏离所选择的已知靶的相应同源左半位点和右半 位点序列的序列，分别在步骤(b)的合成序列的第一个子集的"半位点 序列l"和"半位点序列2"内的核苷酸通过序列比对和序列比较进行测 定。在这个背景中，"半位点序列l"的序列与相应的天然半位点进行比 较，这优选是左半位点序列，而"半位点序列2"的序列与构成回文天然 耙位点的另 一半位点进行比较，这优选是右半位点序列。
这种方法不必定在本发明方法的步骤(b)后和在步骤(d)前进行， 而也可以在步骤(a)后和在步骤(e)前方法的不同阶段中进行。
在步骤(d)中，使用步骤(b)的合成序列产生2种靶序列的第一 个子集。第 一个子集的靶序列是具有对称靶位点的结构的回文寡核苷酸 序列。这些人工对称靶位点基于步骤(b)的半位点序列进行合成，这 通过补充每个寡核苷酸序列中缺失的半位点序列作为反向重复来实现， 其中"半位点序列l"和"半位点序列2"的序列分别用于在间隔区序列的 相反末端处补充第二个半位点序列。因此，第一个子集中的第一种靶序 列(称为"靶序列1")包含由通过间隔区序列分开的"半位点序列l"和反 向重复的"半位点序列r"组成的反向重复，而第一个子集中的第二种靶 序列(称为"靶序列2")包含由通过间隔区序列分开的反向重复的"半位 点序列2'"和"半位点序列2"组成的反向重复(参见图1 )。在"靶序列1" 中，序列如下排列5'-"半位点序列l"-间隔区-"半位点序列l'"-3',在"靶 序列2"中，序列如下排列5'-"半位点序列2'"-间隔区-"半位点序列2"-3'。
类似于上文步骤(b)中所述的那种，在第一个子集的每2个合成 耙序列内的间隔区序列优选是相同的，并且对应于代表或定义为不对称 耙位点的间隔区序列的LTR序列。然而，在进一步的实施方案中，间隔 区序列可以包含源于核苷酸置换的一个或两个序列差异。
一般地，这个步骤代表选择用于修整特定重组酶的不对称耙位点的 序列的第一次分裂(参见图1)。在这个步骤中产生具有衍生自不对称 耙位点的半位点的对称耙位点的序列，所述不对称耙位点选择用于修整 特定重组酶(参见图1)。因此，所述不对称靶位点的一半位点中存在 的每个突变(即，与由野生型重组酶识别的靶位点不同)目前已扩展到 第 一个子集中的对称靶序列之间。在本发明方法的步骤(e)中，第一个子集的靶序列用于产生靶序 列的第二个子集。步骤(d)的第一个子集中的靶序列的半位点序列和 分别的间隔区各自独立地用于产生新靶序列(即构成第二个子集)，这 通过基于所选择的半位点序列产生反向重复，从而使得间隔区序列使构 成反向重复的2个序列分开来实现(参见图1)。因此，"靶序列l"的左
半位点序列用于产生第一个新对称靶位点，"靶序列r的右半位点序列
用于产生第二个新对称靶位点，"靶序列2"的左半位点序列用于产生第 三个新对称靶位点，且"靶序列2"的右半位点序列最后用于产生第四个
新对称靶位点，其中每次亲本靶序列的间隔区序列都包括在新对称靶位 点内(参见图1)。然而且最重要的，衍生自第一个子集的每个靶序列 的半位点序列在其合成过程中且在使用其用于产生得到完全新靶序列 的反向重复前改变，(例如通过执行核苷酸置换)。在新靶序列的左半
位点序列(衍生自第一个子集的靶序列)中，偏离步骤(a)的已知靶 序列的相应同源半位点序列的核苷酸部分由已知靶序列中发现的天然 核普酸替换，并且在相应的右半位点序列(衍生自第一个子集的相同靶 序列)中，偏离相应同源左半位点的其余核苷酸由已知靶序列中发现的 天然核苦酸替换(参见图1)。在左半位点中改变的核苷酸不同于右半 位点中修正的那些，从而使得偏离核普酸仅在源于第 一 个子集的 一 种靶 序列的2个半位点序列中出现1次，在基于左半位点构成的耙序列中或 在基于右半位点构成的靶序列中(参见图1)。此外，序列改变如此进 行，从而使得每个偏离核苦酸在半位点之一中保留1次。最后，半位点 序列应无一单独包含所有偏离核苷酸。
如上文步骤(b)和(d)中已描述的，在衍生自更高子集的合成靶 序列的新子集的每2个合成靶序列内的间隔区序列优选是相同的，并且 对应于4戈表或定义为不对称輩巴位点的间隔区序列的LTR序列。然而，在 进一步的实施方案中，间隔区序列可以包含源于核苷酸置换的一个或两 个序列差异。
使用这种方法，代表每个子集的粑序列中的突变数目(即与由野生 型重組酶识别的粑位点的差异)小于起始不对称耙序列中的，但所有突 变仍在靶序列之一中呈现(参见图1)。
如本文所使用的，术语"偏离核苷酸"指在LTR内鉴定或限定的不对 称靶序列内或在根据本发明产生的子集的靶序列内的核苷酸，其偏离
21(即不同于)在本发明方法的步骤(a)中所选择的已知重组酶的已知 同源对称耙序列的相应同源序列中的相同位置处存在的核苷酸。在这个 背景中，术语"偏离核苷酸"和"突变"可互换使用。
靶序列的子集产生的例子在图1中更一般地显示。基于HIV原病毒 的LTR内的不对称序列的更具体的例子显示于图2A中。
在步骤(f)中，通过逐步重复步骤(e)的过程，从第二个子集的 耙序列开始产生粑序列的进一 步子集，即将靶序列分裂成分别的半位点 序列，并且在改变衍生自第二个子集的靶序列的半位点序列后，基于这 些半位点序列产生新回文结构，每次产生靶序列的一个新子集，直至用 于产生反向重复的半位点序列包含偏离已知靶位点的相应同源半位点 序列的1、 2或3个核香酸。
本发明人认识到重组酶可以使用分子定向进化进行修整，其中使用 靶序列作为底物，如果用作底物的靶序列与天然靶序列相差不超过3个 核普酸的话。因此，上文描述的不同顺序的子集产生用于使每个靶序列 的偏离核苷酸数目减少至3或更少(参见图1)。偏离核苷酸数目的逐 步减少最终产生具有减少数目的偏离核苷酸的不同顺序的许多靶序列 子集，直至产生可以用作分子定向进化的底物的最终子集。在产生不同 子集且因此减少偏离核苷酸的数目时，与由野生型重组酶识别的耙位点 的差异散布在各自不包含这些偏离核苷酸的超过3个的几种靶序列之 间，而最终顺序的靶序列整体仍表现所有偏离核苷酸(参见图1)。
从步骤(e)中获得的耙序列的第二个子集开始产生第三个子集， 如果必要，那么随后产生第四个、第五个、第六个子集等。然而， 一般 产生第三个子集仅在如果第二个子集的靶序列仍包含超过3个偏离核苷 酸的情况下是必需的。下一个子集的产生同样如此，其仅在如果先前子 集的靶序列仍包含超过3个偏离核苷酸的情况下是必需的。应当指出在 一个实施方案中，将产生靶序列的子集，直至最终子集的靶序列仅包含 一个偏离核苷酸。因此，依赖于每个半位点序列中的偏离核苷酸数目， 对于不对称靶位点的每个半位点序列产生的子集数目可以不同。例如对 于左半位点序列可能必须产生仅2个子集，而对于右半位点必须产生3 个或4个子集，以在几种耙序列之间散布偏离核苦酸，从而使得单个耙 序列不包含这些偏离核普酸的超过3个。
产生靶序列的进一步子集以用于使偏离核普酸数目减少至低于3个的原则在图1中举例说明。
在步骤(g)中，将分子定向进化方法应用于识别步骤(a)的已知 同源耙位点的重组酶，其中使用步骤(f)中获得的最终子集的靶序列作 为底物，所述靶序列包含偏离所述已知同源靶位点的相应同源半位点序 列的1、 2或3个核苷酸。
如本文所使用的，术语"最终子集"指在步骤(f)中产生的最后子集。 依赖于不对称靶位点中的偏离核苷酸数目和必须产生以使每个靶序列 的偏离核苷酸数目减少至低于3的子集数目，"最终子集"可以对应于任 何子集，例如第二个、第三个、第四个或更后的子集，并且对于LTR内 的不对称靶序列的半位点序列可以不同。
分子定向进化方法也称为实验室进化或体外进化，是本领域已知的 (关于综述参见YUAN等人，2005及其中的参考文献；JOHANNES & ZHAO, 2006)。
在分子定向进化的第 一个步骤中，随机突变的重组酶序列的文库通 过本领域已知的方法来产生，例如通过使用易错PCR和DNA改组(在 例如YUAN等人，2005中综述)，或国际专利申请WO 02/44409中公 开的方法。包含突变的重组酶的每个文库的质粒也包含步骤(f)中包含 的最终子集的靶序列之一 。在将所产生的质粒文库转染到合适的细胞内 后，重组酶的表达成为可能，并且通过本领域技术人员如已知的进行分 子定向进化。
在优选实施方案中，在本发明方法的步骤(g)中采用的分子定向 进化是底物关联的蛋白质进化(SLiPE; BUCHHOLZ & STEWART, 2001; 国际专利申请WO 02/44409)。底物关联的蛋白质进化如实施例中详细 描述的进行。简言之，将步骤(f)中获得的靶序列连同随机突变的关于 重组酶的编码序列一起克隆到质粒(所谓的的进化载体)内。随机突变 通过易错PCR来进行(参见BUCHHOLZ & STEWART, 2001 )。所产 生的质粒文库随后转染到大肠杆菌(￡. co/,')细胞内，以允许表达重组 酶。通过使用诱导型启动子以驱动重组酶的表达，可能调整表达水平。 过夜温育后，从细胞中分离质粒DNA,并且用消化以切除未重组 的质粒，并且仅重组的质粒随后用引物进行扩增。重组形式的质粒的 PCR产物产生1.7 Kb条带。PCR产物用SwGI和A^al进行消化，并且 亚克隆回相似消化的进化载体内，用于下一个进化循环。
23在步骤(h)中，步骤(g)中进化的重组酶文库进行组合且改组。 DNA改组的技术是本领域已知的(关于综述，参见MINSHULL & STEMMER， 1999; STEMMER, 1994)。
随后将组合且改组的文库克隆到新世代的载体内，所述新世代的载 体包含步骤(f)中产生的邻近更高子集的靶序列。
如本文所使用的，术语"邻近更高子集"指用于产生某一子集的子 集。例如，第三个子集基于第二个子集的靶序列而产生。因此，从第三 个子集开始，"邻近更高子集"将是第二个子集。此外，从第二个子集开 始的邻近更高子集是第一个子集。第三个、第四个(等等)子集同样如 此，并且从这个第一个子集开始的邻近更高子集是具有LTR序列的不对 称靶序列。
在步骤(i)中，将分子定向进化方法应用于步骤(h)中获得的改 组文库，其中使用根据步骤(f)的邻近更高子集的靶序列。在这个步骤 中，可以使用与步骤(g)之前应用的那些相同的分子定向进化方法， 但在本发明方法的这个步骤中也可能使用不同的分子定向进化方法。不 同分子定向进化方法的例子例如由YUAN等人(2005 )描述。
优选地底物关联的蛋白质进化方法也应用于组合且改组的文库。
这个步骤产生识别且重组靶序列的重组酶，所述靶序列具有来自更 低子集的不同靶序列的突变组合(且因此增加数目的突变)。本发明人 首次显示来自靶序列的更低子集的不同文库的突变组合导致协同效应， 且导致重组酶的产生，所述重组酶现在重组更高子集的靶序列，从而证 实穿过中间体的进化策略可以用于取得所需活性。
在步骤(j)中，重复步骤(h)即重组酶文库的重组且改组和(i) 即分子定向进化应用于组合且改组的文库，直至取得至少一种重组酶， 其对于在原病毒DNA的LTR中存在的不对称耙序列有活性。例如，在 其中必须产生靶序列的3个子集以产生仅具有1、 2或3个核苷酸偏离 的靶序列的方法中，例如对于靶序列的第三个子集进化的重组酶文库进 行组合且改组，并且将分子定向进化应用于这个改组的文库，其中使用 第二个子集的靶序列。因此进化的重组酶文库随后进行组合且改组，并
且将分子定向进化应用于这个文库，其中使用第一个子集的靶序列。在 下一个(和最后)步骤中，步骤(a)的在原病毒DNA的LTR内的不对 称靶序列用于进化重组酶文库，所迷重组酶文库包含识别第 一个子集的靶序列的重组酶，这通过分子定向进化进行以获得至少一种重组酶，所
述重组酶对于在逆转录病毒DNA的LTR内的不对称靶序列有活性。 在这个步骤中，分子定向进化方法优选是底物关联的蛋白质进化方法。
在步骤(k)中，从文库中分离至少一种重组酶的核酸，所述重组 酶对于步骤(a)的在逆转录病毒DNA的LTR内的不对称靶序列有活性。 使用合适的限制酶从文库内分别的质粒中分离核酸。限制性内切核酸酶 消化方法是本领域:技术人员已知的。编码重组酶的核酸可以通过已知方 法例如凝月交电泳进4亍回收。
核酸可以进行贮存(优选通过低于-80。C的温度)，或可以任选在步 骤(1)中克隆到表达载体内用于在进一步的分析中使用，在蛋白质表达 方法中用于给受试者施用以治疗AIDS。合适的表达载体在下文定义。
优选地，最终获得的重组酶在哺乳动物细胞中进行测试，以确保它 们在哺乳动物环境中发挥作用。此外，为了获得在哺乳动物细胞中的良 好表达，重组酶可以就这些细胞中的表达进行最优化(例如使用本领域 众所周知的方法的密码子选择。参见例如SHIMSHEK等人，2002 )或 用于将蛋白质导入哺乳动物细胞的核内所必需的信号序列，例如NLS 序列(MACARA, 2001 )可以加入+务整的重组酶的核酸中。
在本发明的优选实施方案中，其靶序列在步骤(a)中使用并且在 步骤(g)和(i)中在其上应用分子定向进化的已知重组酶，属于丝氨 酸整合酶家族。属于丝氨酸整合酶家族的优选重组酶选自phiC31整合 酶(COMBES等人，2002) , Gin或Hin重组系统的任何组分，大丝氨 酸重组酶的Tn3解离酶(KRASNOW & COZZARELLI， 1983 )或任何其 他成员，VDJ重组系统的Ragl、 Rag2或任何其他组分或其变体。
在另一个优选实施方案中，所述重组酶属于酪氨酸整合酶家族。属 于酪氨酸整合酶家族的优选重组酶选自来自噬菌体Pl的Cre (ABREMSKI等人，1983, 1984)、来自酵母的FLP重组酶(VOLKERT & BROACH， 1986 )、来自噬菌体D6的Dre ( SAUER & MCDERMOTT, 2004)、来自鲁氏接合糖酵母(Z^ga^ccAaraw^cw raw;c")质粒pSRl 的R重组酶、来自果蜗克鲁维氏酵母(A7m^ramyc^ ^asop/n7anwm )质 粒pKDl的A重组酶、来自A7wvwom，yc^ vra/"7质粒pKWl的重组酶、 来自芽孢杆菌属(Bacillus)转座子Tn4430的T叩I、 XInt重组系统的任何组分或其变体。
来自酪氨酸整合酶家族的重组酶的特征在于具有酪氨酸作为用于
DNA切割的活性位点亲核体，而来自丝氨酸整合酶家族的重组酶使用丝 氨酸代替酪氨酸。
在这个背景中的术语变体指通过氨基酸的缺失、置换和/或添加而衍 生自上述蛋白质，且保留它们由其衍生的蛋白质中固有的一些或所有功 能的蛋白质。
在优选实施方案中，已知重组酶是通过例如如由CRAMERI等人 (1998)描述的"家族改组"获得的嵌合重组酶。关于使用家族改组的先 决条件是用于产生嵌合重组酶的重组酶之间的显著同源性。关于可以在 本发明中使用的嵌合重组酶的例子是由分别地重组酶Cre和重組酶Dre 的序列组成的嵌合重组酶。
在更优选的实施方案中，重组酶是由识别称为/o;cP的34bp对称萆巴 位点的Cre重组酶。/o;cP位点(以及野生型重组酶的其他重组位点)是 具有由8个最里面的碱基对分开的2个13 bp重复的回文，所述8个最 里面的碱基对代表对位点赋予方向性的所谓的间隔区。重组通过在间隔 区序列内切割而发生。依赖于2个参与loxP位点的相对定位和定向， Cre催化DNA整合、切除或重排(HOESS & ABREMSKI, 1985 )。
优选地步骤(a)中鉴定的不对称靶序列位于原病毒的5'-LTR和 3'-LTR中，以允许从宿主细胞的基因组中切除原病毒DNA。
本发明人鉴定了原病毒HIV DNA的LTR序列内与/o义P位点具有 50%同源性的序列。这种序列称为/o义LTR (SEQ ID NO: 1)，并且属 于原始HIV-1毒林TZB0003的LTR ( BLACKARD等人，1999 ),是其 调节U3区域的部分(序列位置-262至-229;其中转录起始的位点是+1 )。 /oxltr位点是与/o;cP位点的序列具有50%序列相似性的34 bp不对称序 列，在左元件中具有4个错配，右元件中具有6个错配和具有完全不同 的间隔区(参见图2A)。
使用底物关联的定向进化和/oxLTR序列作为底物，本发明人已能 够产生修整的重组酶，其使HIV-1长末端重复序列中存在的这种不对称 DNA耙序列重组。这是首次产生使不对称耙位点重组的单个Cre相关的 位点特异性重组酶。与本领域已知的重组酶形成对比，本发明的重组酶 识别这样的粑位点，其是不对称的且与天然Cre重组酶的原始靶位点非常远缘。特异性靶向HIV-1 LTR内的不对称序列的修整的重组酶的开发 允许从其染色体整合位点切除分别的原病毒，如由本发明人显示的。
然而，对于本领域技术人员显而易见的是，可以产生其他修整的位 点特异性重组酶，其使插入宿主细胞的基因组内的逆转录病毒原病毒的 基因组中发现的趋异耙位点重组。候选序列可以例如基于与存在的 /oxLTR序列的同源性进行测定。与/oxLTR序列具有同源性的衍生自其 他HIV毒林的LTR的此种LTR序列的例子显示于图2A中。
插入宿主细胞的基因组内的原病毒DNA优选是逆转录病毒的 DNA。逆转录病毒包含大和不同的有包膜RNA病毒家族。家族的标志 特征是它的复制策略，这包括下述基本步骤病毒RNA逆转录成线性 双链DNA,以及这种DNA (原病毒DNA)随后整合到宿主细胞的基因 组内。逆转录病毒再分成由进化关联性限定的7个组。这些组中的5个 (a、卩、5、 e和Y逆转录病毒)代表具有致癌潜能的逆转录病毒，且另 2个组是慢病毒和泡沫病毒。人致病性人T细胞白血病病毒I型和II型 (HTLV-I和HTLV-II)属于5逆转录病毒组，而AIDS病毒人免疫缺陷 病毒1型和2型(HIV-1和HIV-2 )属于慢病毒组(关于综述参见COFFIN JM， HUGHES SH, VARMUS HE (编辑)1997, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York的标准教科书"Retroviruses")。
在优选实施方案中，插入宿主细胞的基因组内的原病毒DNA是选 自下述的逆转录病毒的DNA:小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、摩-傅猴病 毒(MPMV)、人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)、人T细胞白血病 病毒II型(HTLV-II)、猴T细胞白血病病毒I型(STLV-I)、猴T细 胞白血病病毒II型(STLV-II)、牛白血病病毒(BLV)、猫白血病病 毒(FeLV)和莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)。
在进一步优选的实施方案中，逆转录病毒是选自下述的慢病毒人 免疫缺陷病毒l型(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、猴免疫 缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、 Maedi-visna病毒(MVV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和山羊关节炎 脑炎病毒(CAEV)。
在更优选的实施方案中，在本发明方法的步骤(a)中鉴定的不对 称靶序列位于HIV原病毒的5'-LTR和3'-LTR中。优选地，位于HIV原 病毒的5'-LTR和3'-LTR中的所述不对称耙序列具有如SEQ ID NO: 1中所示的序列。这个序列称为/odtr。
在优选实施方案中，在本发明方法中应用的分子定向进化方法是底 物关联的蛋白质进化方法(SLiPE; BUCHHOLZ & STEWART, 2001; 还参见W0 02/44409 )。
在本发明的方法中，将编码至少一种修整的重组酶的核酸克隆到表 达载体内，所述修整的重组酶对逆转录病毒DNA的LTR内的不对称靶 序列有活性。表达载体是用于表达由载体内的核酸编码的蛋白质的遗传 构建体。此种表达载体可以是自我复制的染色体外载体或整合到宿主基 因组内的载体。 一般地，这些表达载体包括与编码本发明的修整的重组 酶的核酸可操作地连接的转录和翻译调节核酸。
术语"控制序列，，指用于表达特定宿主生物中可操作地连接的编码 序列所必需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、 任选地操纵基因序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多 腺苷酸化信号和增强子。
当核酸置于与另 一种核酸序列的功能关系内时，它是"可操作地连 接的"。例如，启动子或增强子与编码序列可操作地连接，如果它影响 序列的转录的话；或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，如果它 如此放置以便促进翻译的话。连接通过在方便的限制位点处连接来完 成。如果此种位点不存在，那么依照常规实践使用合成寡核苷酸衔接子 或接头。转录和翻译调节核酸将一般对于用于表达修整的重组酶的宿主 细胞是合适的。用于多种宿主细胞的众多类型的合适表达载体、和合适 的调节序列是本领域已知的。
在本发明中使用的表达载体可以是逆转录病毒载体、慢病毒载体、 泡沫病毒载体或腺病毒载体。然而，在优选实施方案中，表达载体是选 自HIV-l-、 SIV-、 FIV-或EIAV-衍生的慢病毒载体的慢病毒载体。慢病 毒载体例如由SCHAMBACH等人(2006)描述。
在本发明的优选实施方案中，表达载体包含细胞、细菌、病毒或杂 种启动子。
一般而言，为了本发明的目的，启动子可以是组成型或诱导型启动 子。此外，启动子可以是天然存在的启动子，例如细菌、细胞或病毒启 动子或杂种启动子。使超过一种启动子的元件组合的杂种启动子是本领 域已知的，并且在本发明中有用。此外，在本发明中使用的启动子还可
28以是天然存在的启动子的衍生物。如本文所使用的，天然存在的启动子 的"衍生物"可以是得自启动子的顺式活性元件或不同来源的序列的组 合，或可替代地，可以通过特定天然存在的启动子内的顺式活性元件的
缺失或突变而获得(EDELMAN等人，2000; ALPER等人，2006; HARTENBACH & FUSSENEGGER, 2006)。
在本发明的更优选的实施方案中，组成型启动子或其衍生物选自或 衍生自巨细胞病毒、劳斯肉瘤病毒、鼠白血病病毒相关逆转录病毒、磷 酸甘油激酶基因、鼠脾脏病灶形成病毒或人延伸因子la的启动子。
在本发明的进一步更优选的实施方案中，诱导型启动子或其衍生物 选自或衍生自LTR或其衍生物，所述LTR或其衍生物衍生自慢病毒、
泡;末病毒禾口 s逆4争录病毒。
在这个背景中，术语"LTR，，指具有启动子功能的原病毒的5'和3'长 末端重复序列(关于综述参见标准教科书"Retroviruses" ( COFFIN JM, HUGHES SH, VARMUS HE (编辑)1997, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York))。
优选地诱导型启动子或其衍生物选自或衍生自LTR或其衍生物，所 述LTR或其衍生物衍生自HIV-1、 HIV-2、 MVV、 EIAV、 CAEV、 SIV、 FIV、 BIV、 HTLV画I和HTLV國II。
本发明进 一 步提供了用于制备修整的重组酶的方法，其中所述方法 包括用于制备编码修整的重组酶的表达载体的前述方法，和在合适的宿 主细胞中表达修整的重组酶或融合多肽的进一步步骤，所述融合多肽包 含来自插入表达载体内的编码重组酶的核酸的所述修整的重组酶的氨 基酸序列，所述表达载体在用于制备编码修整的重组酶的表达载体的前 述方法中获得。
根据用于制备编码修整的重组酶的表达载体的方法的步骤(1),克 隆到表达载体内的编码修整的重组酶的核酸的表达可以使用例如细菌、 昆虫或哺乳动物表达系统来进行。然而，也可以使用本领域已知的其他 表达系统。将外源核酸引入哺乳动物、昆虫或细菌宿主以及其他宿主内 的方法也是本领域众所周知的，并且将随着所使用的宿主细胞而改变。 技术包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺(polybrene)介导的 转染、原生质体融合、电穿孔、病毒感染、多核苦酸包嚢在脂质体中、 和DNA直接显樣i注射到核内。融合蛋白通过本领域众所周知的方法进行制备。例如，编码修整的 重组酶的核酸已克隆到其内的表达载体包含编码第二种多肽或蛋白质 的核酸序列。通过将编码修整的重组酶的核酸与第二种多肽或蛋白质的
序列符合读框地克隆，2种序列将作为融合蛋白进行表达。
用于表达来自表达载体的修整的重组酶的宿主细胞优选是宿主细 胞，其包括原核细胞，例如细菌细胞或酵母细胞，或真核细胞，例如昆
虫细月包或喷乳动物纟田月包。
本发明进一步提供了用于制备经转化的成体干细胞的方法，其中所 述方法包括用于制备编码修整的重组酶的表达载体的前述方法，和在 体外将表达载体引入合适的成体干细胞内的进一步步骤，所述表达载体 在用于制备编码修整的重组酶的表达载体的前述方法中获得。
在进一步的方面，本发明涉及如可由本发明的前述方法获得的核酸。
如本文所使用的，"核酸"是包含共价连接的称为核苷酸的亚单位的
聚合化合物。核酸包括聚核糖核酸(RNA)和聚脱氧核糖核酸(DNA), 这二者可以是单链或双链的。DNA包括cDNA、基因组DNA、合成DNA 和半合成DNA。
在其最广泛的方面中，通过本发明的方法获得的核酸是编码修整的 重组酶的核酸，其中修整的重组酶使插入宿主细胞的基因组内的原病毒 DNA内的不对称靶序列重组，从而导致从宿主细胞的基因组中切除原病 毒，其中不对称靶序列不同于野生型重组酶的靶位点。
在实施方案中，通过本发明的方法获得的核酸具有如SEQIDNO: 2中所示的核酸序列，并且识别且重组如SEQIDNO: l中所示的/ox^ 序列。
在核酸的定义内还包括的是通过本发明的方法获得的核酸序列的 变体，其与如SEQIDNO: 2中所示的核酸序列具有至少50 %相似性、 优选至少60%相似性、更优选至少70%相似性、甚至更加优选至少80 %相似性和最优选至少90%相似性。在一些实施方案中，相似性将高达 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98或99 %。
在进一步的方面，本发明还涉及如可由本发明的前述方法获得的表 达载体。
本发明的进一步的方面是如可由本发明的前述方法获得的修整的
30如本文所使用的，术语"蛋白质"包括蛋白质、多肽和肽。如将由本 领域技术人员理解的，本发明的核酸序列可以用于产生蛋白质序列。
在优选实施方案中，修整的重组酶蛋白质具有如SEQIDNO: 3中 所示的氨基酸序列。这种重组酶因LTR重组酶而命名为Tre。
修整的重组酶蛋白质的实施方案内还包括的是如SEQIDNO: 3中 所示的氨基酸序列的氨基酸变体。优选地，变体将与如SEQ ID NO: 3 中所示的序列具有至少70%的序列相似性、更优选至少80%相似性的 序列相似性、和最优选至少90%的序列相似性。在一些实施方案中，相 似性将高达91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98或99 %。关于核酸，在 这个背景中的相似性意指序列同源性或同 一性，其中同 一性是优选的。 这种相似性将使用本领域已知的标准技术进行测定，如上文对于核酸同 源性概述的。
在进一步优选的实施方案中，修整的重组酶蛋白质还可以使用本领 域众所周知的技术作为融合多肽进行制备。在优选实施方案中，修整的 重组酶蛋白质与笫二种多肽连接。优选地融合多肽由本发明的前述方法 获得，其中修整的重组酶与第二种多肽连接。
优选地，修整的重组酶蛋白质制备为融合多肽，以增加表达。在进 一步优选的实施方案中，修整的重组酶蛋白质制成融合多肽，以允许将 多肽引入活细胞内。 一般地，纯化的蛋白质不能进入细胞内，因为由于 其大小，它们不能通过细胞膜。然而，特定肽序列与蛋白质的融合可以 导致这些融合蛋白摄取到细胞内。在细胞中，蛋白质然后可以执行其功 能。位点特异性重组酶，包括Cre重组酶，已用这种方法成功地递送到 细胞内(peitz等人，2002)。细胞渗透性重组酶已由nolden等人(2006 ) 和LlN等人(2004)进一步描述。因此，这种策略可以用于将修整的重 组酶递送到细胞内，以从受感染细胞中去除原病毒。
因此，在融合多肽中的第二种多肽可以包含信号肽。信号肽可以是 蛋白质转导结构域例如TAT肽，或来自触角足同源域(derossi等人， 1994, 1996; Vives等人，1997; Vives, 2003; Richard等人，2005 ) 的第三个螺旋的肽，或用于将融合多肽递送到真核细胞的核内的NLS (核定4立序歹寸)(Macara, 2001 )。
本发明的进一步的方面涉及如可由前述方法获得的成体干细胞，所述前述方法用于制备本发明的经转化的成体干细胞。干细胞优选用根据 本发明的表达载体进行感染或转染。
在优选实施方案中，成体干细胞是来自造血谱系的干细胞，其表达 修整的重组酶、前述融合多肽或包含前述表达载体。
造血干细胞(HSC)是骨髓衍生的CD34+细胞，这可以通过常规白 细胞清除术(scherr & eder, 2002)由供体(例如HIV感染的患者) 的G-CSF动员的外周血进行纯化。随后将体外基因修饰细胞再输入患者 内。
在本领域工艺水平中，术语"干细胞"指这样的细胞，其(a)具有自 我更新的能力，和(b)由于其不对称分裂的能力，形成至少一种且通 常多种特化细胞类型的能力(Donovan&Gearhart， 2001 )。成体干 细胞可以从成体的不同组织中，即从分化的个体中进行分离。此种干细 胞在本领域工艺水平中称为"多能成体干细胞"。在胚胎多潜能干细胞和 成体多能干细胞之间的基本差异在于分化组织的数目，这可以由分别的 细胞获得。
在进一步优选的实施方案中，本发明涉及HIV感染患者的CD4+初 双纟田月包(jk纟田月包)。
在本发明方法的进 一 步步骤中，通过本发明方法获得的包括编码修 整的重组酶的核酸序列的表达载体、重组酶蛋白质、融合蛋白或成体干 细胞，制备为药物组合物用于减少受逆转录病毒感染的受试者中的病毒 量。
本发明的进一步主题是通过前述方法获得的药物组合物。药物组合 物优选以适合于静脉内应用(输注)的溶液形式存在。
药物制剂可以进一步包含一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂 和/或佐剂。适合于在药物组合物中使用的载体、赋形剂和佐剂是本领域 已知的。
当施用于受试者时，本发明的药物组合物使受逆转录病毒感染的受 试者中的病毒量减少至低于5.000基因组当量/ml血浆，优选低于500 基因组当量/ml血浆，和更优选低于50基因组当量/ml血浆。
因此，包含编码修整的重组酶的表达载体(或作为蛋白质或融合多 肽的修整的重组酶或包含表达载体的干细胞)的本发明药物组合物能够 减少受逆转录病毒感染的受试者中的病毒量，这通过根除宿主细胞内的
32逆转录病毒的遗传储库，从而阻止病毒的进一步生活周期来实现。
如本文所使用的，术语"病毒量"指与1 ml的患者血浆相关的HIV RNA当量(即基因组)(Dybul等人，2002 )。因此，病毒量通过测 量得自患者的样品中的病毒DNA含量进行测定。目前，存在3种主要 类型的可用的病毒量测定
1) HIVRNA逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) : Amplicor HIV-1 Monitor Test; Roche Diagnostics
2 )支链DNA ( bDNA ) : Versant HIV RNA Assay; Bayer Diagnostics; 和
3 )基于核酸序列的扩增(NASBA ) : NucliSens Assay ; bioMcri6ux。
在优选实施方案中，本发明的药物组合物能够使受逆转录病毒感染 的受试者中的病毒量减少至低于5.000基因组当量/ml血浆，优选低于 500基因组当量/ml血浆，和更优选低于50基因组当量/ml血浆。具有 低于5000基因组当量/ml血浆的病毒量的患者视为对医学处理相对良好 调整的。然而，在目前的AIDS治疗中的目标是使病毒量减少至病毒量 测定的检测极限，这目前低于约50基因组当量/ml血浆。
在这个背景中，本发明人首次显示修整的重组酶可以用于从哺乳动 物宿主细胞的基因组中切除完全大小的原病毒DNA,而不负面影响细胞 生存力(参见图9)。用根据本发明的修整的重组酶处理受感染细胞后， 不再能检测出(1 )宿主的基因组内的逆转录病毒DNA和(2)来自受 感染细胞的病毒颗粒出芽，显示静息细胞中的病毒储库被破坏。
药物组合物优选减少选自下述的逆转录病毒的病毒量小鼠乳腺瘤 病毒(MMTV)、摩-傅猴病毒(MPMV)、人T细胞白血病病毒I型 (HTLV-I)、人T细胞白血病病毒II型(HTLV-n)、猴T细胞白血病 病毒I型(STLV-I)、猴T细胞白血病病毒II型(STLV-n)、牛白血 病病毒(BLV)、猫白血病病毒(FeLV)和莫洛尼小鼠白血病病毒 (MoMLV)。
在另外进一步优选的实施方案中，待用本发明的药物治疗的逆转录 病毒是慢病毒。所述慢病毒优选选自人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、 人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷 病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV) 、 MaecH-visna病毒(MVV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)。
然而，对于本领域技术人员显而易见的是，本发明还可应用于由除
上文描述那些外的其他逆转录病毒的逆转录病毒感染。
此外，药物组合物施用于其的受逆转录病毒感染的受试者选自人、
灵长类动物、猴、牛、马、山羊、绵羊和家猫。然而，受试者优选是人类。
在优选实施方案中，药物组合物用于与高效抗逆转录病毒疗法 (HAART)的其他活性剂伴随施用。
高效抗逆转录病毒疗法HAART是靶向病毒逆转录酶、蛋白酶和融 合的组合疗法(Gulick等人，1997; Lalezari等人，2003 )
在另一个优选实施方案中，药物组合物用于与总体免疫激活疗法或 原病毒基因表达的特异性激活伴随或在其之后施用。
免疫激活疗法的前提基于下述假设潜伏HIV感染的细胞的有意激 活可以加速持续的病毒储库的根除。根除将通过活跃表达HIV-1 (凋亡
前)产物的那些细胞的程序性死亡经由免疫清除而发生(kulkosky &
Bray, 2006)。总体免疫激活(免疫细胞包括静息细胞的激活)通常通 过例如免疫毒素、细胞因子(例如IL-2 )或T细胞激活抗体(例如OKT3 ) 的施用而达到。
考虑到下述事实由于总体T细胞激活看起来还诱导病毒复制并且 使潜在HIV-1耙细胞数目增加超过可以由HAART包含的水平(Fraser 等人，2000)的事实，对于有意激活HAART抗性潜伏储库进行的免疫 激活确实不幸地未能永久消除HIV-1和病毒回弹(关于综述参见 Kulkosky & Bray 2006; Marcello， 2006; Shehu-Xhilaga等人， 2005 ),需要进一步的特异疗法以治疗HIV。 一种方法是不然的话休眠 的病毒基因组的转录激活。潜伏原病毒基因表达的特定激活可以通过施 用佛波酯Prostmtin或人细胞因子IL-7来达到，这二者看起来在不存在 细胞增殖的情况下再激活潜伏HIV-1 (Marcello， 2006)。此外，HIV-1 的选择性转录激活也可以通过组蛋白脱乙酰酶(HDAC1 )抑制剂例如丙 戊酸(valproic acid)来达到，其在不存在细胞激活的情况下最终诱导来 自静息细胞的HIV-1过度生长(Marcello, 2006; Lehrman等人， 2005 )。
然而，总体免疫激活疗法或原病毒基因表达的特异性激活或类似治除极大地获益，从而减少患者中的受感 染细胞库。
在进一 步的方面，本发明涉及最优化受试者的逆转录病毒感染治疗 的体外方法。
这种方法包括下述步骤
(a) 测定患者血样中存在的逆转录病毒DNA的核酸序列；
(b) 就已知重组序列扫描步骤(a)的序列的LTR序列，对于所述 重组序列已制备特异性修整的重组酶；
(c) 倘若至少一种所述已知重组序列存在，那么将选自下述的化 合物制备为药物组合物，以用于减少受试者中的病毒量包含特异性识 别所述已知重组序列的修整的重组酶的核酸的表达载体、所述修整的重 组酶、包含所述修整的重组酶的氨基酸序列的融合蛋白或包含所述表达 载体的成体干细胞；否则鉴定与重组酶的已知靶位点的左半位点和右半 位点序列具有至少30%同源性的序列，并且命名为"不对称耙序列"，其 中同源序列通过5-12个核苷酸的合适间隔区分开；
(d) 执行用于制备编码修整的重组酶的表达载体的前述方法的步 骤(b)至(1),所述修整的重組酶使原病毒DNA的LTR内鉴定的不 对称靶序列特异性重组；和
(e) 将步骤(d)中获得的表达载体、由所述表达载体表达的蛋白 质或融合蛋白或者由所述表达载体转染或感染的干细胞制备为药物组 合物，用于减少受试者中的病毒量。
在这种方法中，提供了用于在患有逆转录病毒感染的患者治疗中使 用的修整的重组酶，所述修整的重组酶进行特异性修整，以使患者由其 感染的逆转录病毒的特定耙序列重组。考虑到在各种逆转录病毒的LTR 序列内发现的序列多样性，进行修整以使特定逆转录病毒的特定不对称 耙序列重组的重组酶将不必定识别在其他逆转录病毒的原病毒DNA内 的靶序列，并且因此与它就其进行修整的那些相比较，在切除其他原病 毒DNAs方面较不有效或甚至无效。然而，为了解决这个问题并且提供 用于治疗基本上每个受试者的逆转录病毒感染的个别修整的重组酶，本 发明人提供了允许最优化待施用的重组酶的功效的体外方法，这通过选 择或修整将特异性识别受试者由其感染的个别原病毒基因组内的靶序 列的重组酶来实现。在本发明最优化逆转录病毒感染的治疗的体外方法的步骤(a)中， 测定患者的血样中存在的逆转录病毒DNA的核酸序列。在这个第一个 步骤中，患者由其感染的逆转录病毒优选通过在得自患者的血样内的病 毒颗粒的基因组的DNA测序进行测定，其中使用链终止剂(Sanger等 人，1977)。还可以使用提供关于逆转录病毒序列的信息的本领域技术
人员众所周知的其他方法。
在体外方法的步骤(b)中，就已知重组序列扫描步骤(a)中获得 的LTR序列，对于所述重组序列已制备特异性修整的重组酶。这种搜索 通过使用例如基于计算机的序列分析如上所述来进行。
如果在血样中发现的病毒颗粒的LTR包含对应于已知不对称靶序 列的至少一种序列，对于所述不对称靶序列已存在修整的重组酶，那么 将选自下述的化合物制备为药物组合物，以用于减少患者中的病毒 量包含特异性识别所述已知重组位点的修整的重组酶的核酸的表达 载体、所述修整的重组酶、包含所述修整的重组酶的氨基酸序列的融 合蛋白或由如上所述的表达载体转染或感染的成体干细胞。这允许用有 效的重组酶快速和个别治疗特定逆转录病毒感染。
然而，如果先前未制备此种修整的重组酶，那么在步骤(c)中， 在血样中发现的病毒颗粒的LTR序列用于鉴定其中与重组酶的已知靶 位点的左半位点和右半位点序列具有至少30%同源性的序列，其中同 源序列通过5-12个核苷酸的间隔区分开。如上，此种同源序列命名为"不 对称靶序列"。上文关于用于制备编码修整的重组酶的表达载体的方法 的步骤(a)提供的详细描述也在此处应用。
在体外方法的步骤(d)中，执行上文描述的制备编码修整的重组 酶的表达载体的方法的步骤(b)至(1),以用于制备编码使血样中发 现的逆转录病毒的LTR内鉴定的不对称靶序列特异性重组的修整的重 组酶的表达载体。这允许在极短时间内制备使患者患有的逆转录病毒的 原病毒DNA重组的新重组酶。
上文关于用于制备编码修整的重组酶的表达载体的方法的步骤(b) 至(1)提供的详细描述也在此处应用。
最后，在体外方法的步骤(e)中，将所获得的编码重组酶的表达 载体制备为药物组合物，以用于减少所述患者中的病毒量，所述重组酶 特异性识别且重组患者由其感染的逆转录病毒的原病毒DNA。在这个背景中，在进一步的实施方案中，药物组合物优选可以包含作为由表达 载体表达的蛋白质或融合蛋白或者由所述表达载体转染或感染的干细 胞的个别修整的重组酶。在更优选的实施方案中，药物组合物包含表达 载体，所述表达载体包含编码个别修整的重组酶的核酸。
在上文描述的体外方法中，定向分子进化方法应用于其的重组酶选 自野生型重组酶或已+务整的重组酶。然而，重组酶优选是纟多整的重组酶
(识别与现有的原病毒DNA的LTR内发现的那些略微不同的不对称靶 序列)。选择依赖于不对称靶序列的同源性。尽管定向分子进化可以应 用于识别与原病毒DNA的LTR内的序列具有低同源性的靶序列的重组 酶(野生型或修整的)，但这将需要另外的进化循环以获得特异性修整 的重组酶，并且因此将更耗时。因为更可能现有修整的重组酶识别与 LTR中发现的序列具有紧密序列同源性的不对称靶序列，所以定向分子 进化优选应用于此种修整的重组酶。在靶序列内的更少差异需要更少的 进化循环，以"改变"重组酶(先前修整以识别不同的耙序列)对于LTR 内的靶序列的特异性，从而节省时间且允许更快速治疗逆转录病毒感 染。
在体外方法的优选实施方案中，就切除患者受试者由其感染的逆转 录病毒的原病毒DNA而言，任选在体外测试在体外的步骤(c)中鉴定 的已存在的修整的重组酶或在步骤(d)中特异性修整的重组酶的功效。 这种测试在将所述重组酶制备为药物组合物前扭J亍。
进行重组酶功效的测试，以确保分别的重组酶在哺乳动物细胞中也 识别且重组特定的不对称粑序列。这种测试优选在哺乳动物细胞例如 HeLa细胞、PM1细胞、Jurkat T细胞、CEM T细胞和外周血单核细胞 (PMNCs)中进行。
在最优化受试者的逆转录病毒感染治疗的体外方法的进一步任选 步骤中，最后获得的修整的重组酶包括在特异性修整的重组酶的集合 内。这个步骤允许构建不同修整的重组酶的集合，所述修整的重组酶各 自识别与其他的那种不同的特定把序列。在这个集合中渐增数目的修整 的重组酶增加可获得这样的修整的重组酶的可能性，所述修整的重组酶 识别与需要重组酶的原病毒DNA的LTR序歹'J内的序列紧密相关的耙序 列。因此，随着集合中重组酶数目的增加，必须在更耗时的方法中对野 生型重组酶进行修整的可能性减少，而可能从另 一种更紧密相关的修整
37的重组酶开始更快速产生(即需要更少的进化循环)特异性修整的重组 酶的可能性增加。
在最后一个方面，本发明涉及修整的重组酶的集合，其中所述集合
的成员各自通过本发明的方法而获得。
因此，本发明的修整的重组酶集合优选包含编码修整的重组酶的表 达载体、包含含有编码修整的重组酶的核酸的载体的细菌、蛋白质形式 的修整的重组酶或包含编码修整的重组酶的核酸的病毒载体，所述修整 的重组酶根据良好制造实践制备。
在优选实施方案中，本发明的集合包含编码核酸的表达载体，所述 核酸编码特异性修整的重组酶。表达载体随后进行冻干或将贮存于至少
-7(TC的温度下。细菌、蛋白质或病毒载体的贮存通过本领域众所周知的 方法来进行。
对于本领域技术人员将显而易见的是，上文描述的本发明的方法包 含循环过程，并且每个循环的方面或整个循环顺应自动化。
附图简述
图1。不对称靶序列的分裂策略。灰色阴影箭标描述通过间隔区序 列(黑色条)分开的不对称靶位点的反向重复。在不对称靶位点内的数 字和字母代表偏离同源对称靶位点的核苷酸。弯箭标代表基于半位点序
列和间隔区序列产生反向重复。在第二个和第三个子集中的靶位点中的 灰色阴影框代表替换偏离核苷酸的来自同源对称耙位点的核苷酸。不同
使用白色背景上的黑条紋进行:i)、。5该i^仅例示了核苷酸替换。、其 他核普酸和不同数目核苷酸的替换同样是可能的且是优选的。缩写hsl =半位点序列1; hs2=半位点序列2, hsl'=由半位点序列1产生的反 向重复；hs2^由半位点序列2产生的反向重复；
图2。组合定向进化策略。(A)描述了在组合底物关联的进化过 程中使用的重组酶靶位点。以灰色突出显示的碱基代表不同于loxP( SEQ ID NO: 35)的那些。/axltr的左和右13 bp序列分别用于构成回文34 bp 子集loxltrl和1oxltr2。 loxltrsla和lb衍生自loxltrl，并且特征在于各自 对应于回文臂的2个半位点突变。1oxltrs2a和2b衍生自1oxltr2,并且特 征在于各3个半位点突变。(B)显示了进行的126个底物关联的定向进化循环以获得Tre重组酶的概要。关于每个/o;cltr子集的进化循环数 目显示在箭标里，其中最终循环数目显示在箭头上。靶位点的第一个和 最后一个循环的重组酶文库活性显示为在分别靶下面的质粒DNA的限 制性分析(在200 pg/ml L-阿拉伯糖诱导下的BsrGI/Xbal消化)。未重 组的(4.9kb的上部条带)和重组的(4.2kb的下部条带)分别用具有2 个三角或1个三角的线指出。
图3。显示了用于进化/o;cltr特异性重组酶的定向进化策略的图示。 进化载体卩￡￥0-/0义1加基于pBAD33载体，并且包含2个同向重复的重 组酶粑位点(/oxltrs)。在/oxltrs处的重组导致包含独特的M&I限制位 点的间插区域的缺失，并且在MfeI消化后，成功的候选物可以使用PCR 用引物P1 (SEQIDNO: 19 )和P2 ( SEQ ID NO: 20)寻找。PCR产生 可以用于将成功的重组酶亚克隆回起始载体用于下一个循环的1.7Kb条 带。质粒库用AWeI的限制酶切消化确保未重组质粒(在图中未显示) 的去除，且因此消除无功能的重组酶。
图4。在Cre 二级结构上的进化重组酶的突变的作图。突变的出现 以指明的色码(colour code)显示。将出现超过一次的氨基酸突变加入 柱中。Cre的结构元件对于a螺旋(A至N)显示为条和对于卩折叠(1 至5)显示为箭称，这基于Cre重组酶的晶体结构。催化酪氨酸由"Y" 指示。实心三角标记与DNA特异性接触的氨基酸。高变密码子由柱上 的氨基酸位置指示。
图5。显示了 Tre重组酶(SEQIDNO: 3)的氨基酸序列。对于Tre 在哺乳动物细胞中的核定位加入的NLS序列是有下划线的。以淡灰色和 深灰色突出显示的突变(AA 131、 244、 245、 259和262 )描述了基于 Cre晶体结构分别DNA接触和非接触的残基。对应于图3中呈现的Cre 序列和突变分析的氨基酸数目显示在突变上方。
图6。 /axltr序列与其他HIV-1 LTR序列的比较。随机选择的27种 HIV-1 LTR序列与34bp/axltr序列进行比对，并且计算相似性。结果显 示为loxltr与文库中所有分别的LTRs相比的百分比序列同源性。HIV-1 LTR序列的登记号显示于横坐标中。
图7。 Tre重组酶在大肠杆菌中的活性。(A)基于LacZ的报道分 子测定的示意图示。位点特异性重组导致大肠杆菌启动子的去除，从而 导致LacZ表达的去除。(B)使用基于lacZ的报道分子切除质粒进行举例说明的Tre的重组特异性。指示了所使用的基于/oxP或/o;dtr的报 道质粒和重组酶的不同组合。由于在重组后驱动lacZ表达的启动子去除 而产生白包菌落。(C)对应于不同靶位点的pEVO形式和Tre的质粒 DNA在50 |Lig/ml L-阿拉伯糖浓度下过夜培养后，Tre重组酶对不同靶位 点的活性，以及用^sKH和Zk I消化。4.2Kb的下部重组条带指示为具 有l个三角的线，且上部未重组条带指示为具有2个三角的线。每个耙 的重组质粒的计算百分比在泳道下显示。
图8。关于HeLa细胞中的瞬时重组酶活性的测定。(A) HeLa细 胞用所指示的重组酶和报道质粒进行共转染(参见图6)。细胞进行固 定，并且在转染后48小时用X-gal进行染色。重组使间插终止区缺失， 并且导致由蓝色细胞反映的lacZ表达的激活。(B)在用所指示的重组 酶和报道质粒共转染的HeLa细胞的细胞裂解物中的p-半乳糖普酶活性 的测量。在用重组形式的报道质粒pSVApaX和pSVAloxltr平行转染后， )3-半乳糖苷酶活性呈现为细胞的酶活性百分比。(C)在稳定的/o;dtr HeLa报道细胞系中，由Tre介导的重组。细胞系用模拟品、Cre和Tre 表达载体进行转染，并且在转染后48小时测量细胞裂解物中的(3-半乳 糖苷酶活性。(D)用Cre和Tre表达载体转染后，在(C)中描述的/oxltr 细胞系中的重组的PCR 4全测。显示了关于未重组和重组对照质粒 (pSVloxltr和pSVAloxltr)以及在用Cre和Tre表达载体转染后的PCR 产物。下部重组条带用具有1个三角的线指示，并且上部未重组条带用 具有2个三角的线指示。指出了PCR产物的长度。
图9。在HeLa细胞中的HIV-l Tat反式激活测定。(A)包含在HIV-1 HXB3 LTR的U3区域内的/o;dtr序列(由白色三角指示)的报道载体 pHIV/T2/LUC的示意图。在pHIV/Tl/LUC对照载体中不存在的/o;cltr序 列的另一个拷贝位于萤光素酶基因的3'。 LTR启动子在其R区中编码 Tat应答性TAR区。Tat反式激活由增加的萤火虫萤光素酶表达反映。 Ll和L2指示用于重组的PCR检测的引物对(黑色三角)。经由/oxltr 位点的重组将使萤光素酶编码区缺失。(B)在Tre的存在和不存在下， 在HeLa细胞用对照载体pHIV/Tl/LUC转染后的相对HIV-1 LTR活性。 在转染后48小时时测量来自分别的转染细胞裂解物的愛火虫萤光素酶 活性。活性就转染率进行校正，这通过使用LacZ载体作为内部对照且 测量来自细胞裂解物的P-半乳糖苷酶活性来实现。(C )在Tre的存在和不存在下，在HeLa细胞用pHIV/T2/LUC载体转染后的相对HIV-1 LTR 活性。细胞裂解物如前进行测定。(D)在用Tat表达质粒和所指示的 载体瞬时共转染的HeLa细胞中，Tre介导的重组的PCR 4企测。756 bp 的下部条带代表在萤光素酶编码区丧失后的重组片段，并且仅在用 pHIV/T2/LUC和Tre表达载体转染的细胞中可检测。
图10。 HIV-1原病毒DNA的Tre介导的重组。(A ) NLT2AenvPuro 原病毒的示意图。描述了位于5，和3， LTR中的/oxltr序列。间隔区序列 是有下划线的。nef编码区由噪呤霉素抗性基因(淡灰色框)取代，并 且env特异性序列被缺失(△)。代表性VSV-G假型用于感染HeLa细 胞。(B)在转染后第4、 6、 8和10周时，通过总基因组DNA的定量 实时PCR检测整合的原病毒(HIV-1 gag;上图)以及5，和3，LTR区的 重组(5，/3，LTR;下图)，所述总基因组DNA从感染的且Tre表达(Tre ) 或Tre缺乏(对照)细胞中分离。每个样品一式三份地进行检查。(C) 病毒颗粒释放和细胞生存力的分析。在所指示的转染后周数时，培养物 上清液中的抗原p24Gag水平通过ELISA进行测定(上图)。显示了与 对照细胞相比较，在Tre表达培养物内的病毒复制的抑制百分比。细胞 生存力通过alamarBlue测定同时进行监控(下图)。(D)在第4周时 在对照培养物(对照)中，或者在转染后第4、 6、 8和12周时在Tre 表达培养物中，通过间接免疫荧光检测Gag表达细胞(淡灰色标记)。 对照细胞与单独的Cy2偶联第二抗体的温育充当负染色对照(NC)。 核通过DRAQ5染色进行显现(黑色标记)。
图11。 Tre表达细胞对嘌呤霉素敏感。使来自Tre缺乏(对照)或 Tre表达(Tre)培养物的转染后第8周的细胞暴露于0.5 pg/ml噪呤霉 素，并且通过alamarBlue测定随着时间过去就细胞生存力进行监控。
本发明将经由实施例进一 步详细解释。
实施例1 重组酶表达和纟艮道质粒 使用标准方法和合成双链寡核苦酸或PCR技术，为了本发明的目的 产生了各种表达载体。
利用Mzd和SamHI限制位点将Cre和Tre cDNAs克隆到载体 pIRESneo3 (Clontech)内，以用于在哺乳动物细胞中表达。多宿主报道载体pSVpaX和pSVloxltr是相同的，除了分别在pac 区侧面同向重复的/似P或/o;cLTR位点外。pSVpaX先前已得到描述 (buchholz等人，1996)。 pSVloxltr通过用/oxLTR序列替换/o;cP位 点而由pSVpaX产生。
通过将HIV-1 HXB3 LTR连接到真核表达载体pcDNA3( Invitrogen) 的印d和///wdll位点之间，以及将萤火虫萤光素酶基因连接到其 和X/zoI位点之间，来构建Tat应答性报道基因质粒pHIV/Tl/LUC。随后， 通过PCR将原始HIV-1毒株TZB0003的/o;cLTR序列(Genbank登记号 AF096641 )引入HXB3 LTR内。通过将萤光素酶基因3'的双链/o;cLTR 编码寡核苷酸插入pHIV/Tl/LUC的ATzoI和j/7al位点之间，来获得质粒 pHIV/T2/LUC。 HIV-1 Tat表达载体pcTat、亲本载体pBC12/CMV和内 部对照载体pBC12/CMV/卩Gal先前已得到描述(Malim等人，1988; ruhl等人，1993 )。通过将Tre cDNA( SEQ ID NO: 2 )连接到pcDNA3 的W"^in和SamHI位点之间，来产生载体p3Tre。质粒pNLT2AenvPuro 是pNL4-3原病毒DNA ( Genbank登记号M19921 )的衍生物，并且通 过经由PCR将分别的NL4-3 LTR序列转变到HIV-1 TZB0003的/o义LTR 序列内进行构建。随后，使em;基因内的537 bp片段(核普酸位置6712 至7249)缺失。最后，用嘌呤霉素抗性基因替换^/编码序列。表达水 疱性口炎病毒的包膜糖蛋白的载体pCMV-VSV-G已得到描述(Beyer 等人，2002)。
实施例2
识别且重组HIV-1的LTR内的不对称耙序列的修整的重组酶的产生
I. 候选不对称靶序列的测定
为了起始进化过程，首先就与标准loxP位点具有相似性的序列扫描 HIV-1 LTR序列。所选择的序列属于原始HIV-1毒林TZB0003的LTR (Blackard等人，1999)，并且是其调节U3区的部分(序列位置-262 至-229;其中转录起始的位点是+1 )。所选择的/o义LTr位点是与loxP 具有50%序列相似性的34bp不对称序列，在左元件中具有4个错配， 右元件中具有6个错配和具有完全不同的间隔区(参见图2A)。
II. 在大肠杆菌中在底物关联的定向蛋白质进化中/o义LTR序列的检
查/ojcLTR序列如所述的(Buchholz & Stewart, 2001 )在底物关联 的定向蛋白质进化中进行检查(还参见图3)。
通过PCR产生包含侧面为/oxLTR位点的Ndel限制位点的6卯碱 基对片段，其中使用下述寡核普酸，使用质粒卩￡￥0-1(^ (81]011 )1^& Stewart, 2001 )作为模板
关于/oxLTR的引物序列
(SEQ ID NO : 4> 和 5'-TTGAGATCTACAACATCCTATATGCCAACATGGTCGAACTGTACCGGTTG-TTAGTGAJ' (SEQ ID NO : 5)
关于/oxLTRl的引物序列
(SEQ ID NO : 6> 和 5'-TTGAGATCTACAACATCCTATTACACCCTAAATAGGATGTTGTTCGAACTG-TACCGGTTGTTAGTGA-3' (SEQ ID NO : 7>
关于/oxLTR2的引物序列
(SEQ ID NO : 8) 和 5'-TTGAGATCTCCATGTTGGCATAACACCCTATATGCCAACATGGTCGAACTG-TACCGGTTGTTAGTGA-3' (SEQ ID NO : 9>
关于/oxLTRla的引物序列
(SEQ ID NO : 10) 和 5'-TTGAGATCTACAACATCGTATAACACCCTATATACGATGTTGTTCGAAC-TGTACCGGTTGTTAGTGA-3' (SEQ ID NO : 11>
关于/oxLTRlb的引物序列
(SEQ ID NO : 12> 和 5'-TTGAGATCTATAACTTCCTATTACACCCTAAATAGGAAGTTATTCGAA-CTGTACCGGTTGTTAGTGA-3, (SEQ ID NO : 13)
关于/oxLTR2a的引物序列(SEQ ID NO : 14) 和 5,-TTGAGATCTCCATCTTCGTATAACACCCTATATACGAAGATGGTCGAACT-GTACCGGTTGTTAGTGA-3' (SEQ ID NO : 15)
关于/oxLTR2b的引物序列:
(SEQ ID NO : 16> 和 5,-TTGAGATCTATAAGTTGGCATAACACCCTATATGCCAACTTATTCGAACT-GTACCGGTTGTTAGTGA—3' (SEQ ID NO 17〉
pcr片段用6g/n进行消化，并且克隆到用相同酶消化的进化载体
内。使用引物5，-CAATAACCCTGATAAATG-3， (SEQ ID NO: 18)通 过测序就正确序列验证克隆。
如Buchholz & Stewart ( 2001 )中描述的，通过易错PCR产生克 隆到进化载体pEVO-ZoxLTR内的重组酶的起始文库。进化载体基于 pBAD33载体(Guzman等人，1995 ),并且包含2个同向重复的重组 酶靶位点(/oxltrs )。质粒还包含允许阿拉伯糖诱导型重组酶表达的araC 启动子，和用于在大肠杆菌中繁殖的氯霉素抗性标记(Cm)。质粒还 提供了重组酶的方便克隆，其中使用在重组酶编码区侧面的^rGI和 X6al位点。将文库转移到大肠杆菌DH5a细胞内，并且在包含以25jig/ml 浓度的氯霉素的LB液体培养物中生长。使用进化载体(参见图3)和 i秀变处理的Cre的Cre库(archive ),如所述的(Buchholz & Stewart, 2001 )就重组活性测试文库。
重组和后续PCR将产生反映重组的1.7kb条带(参见图3)。然而， Cre以及文库未能使/ojcLTR位点重组，并且未获得PCR产物(数据未 显示)，从而反映/ox;LTR中的不对称性和突变太严重而无法导致重组。
III.不对称靶序列/ojcLTR的子集的制备
为了测试去除靶位点的不对称性是否将导致重组活性，将原始 /oxLTR靶分裂成2个子集。基于原始不对称/o;cLTR序列产生回文耙位 点loxltrl和1oxltr2,其中左和右半位点序列分别用于构成反向重复(参 见图2A)。然而，当/ojcLTR1和/o;cLTR2使用Cre或文库就重组进行 测试时，未观察到重组(数据未显示)。因此，在这些位点中的突变对 于起始文库显示任何活性而言仍太多，并且这使得/oxLTRl和/oxLTR2 的进 一 步分裂成为必需，这通过均匀地划分半位点突变以形成4个新子集来实现，命名为/o;cLTRla、 /oxLTRlb、 /oxLTR2a和/o义LTR2b (参见 图2A)。
IV. 使用不对称靶序列/wLTR的子集进行底物关联的蛋白质进化 如上所述产生克隆到进化载体pEVO-loxltrla、 pEVO-loxltrlb、
pEVO-loxltr2a和pEVO-loxltr2b内的重组酶的起始文库(参见实施例 2.II),并且将其独立地转移到在包含25昭/ml浓度的氯霉素的LB液体 培养物中生长的大肠杆菌DH5a细胞内。
在进化循环开始时(循环1 )的重组酶文库用200pg/ml L-阿拉伯糖 进行诱导，并且阿拉伯糖浓度在后续循环过程中降低，直至在L-阿拉伯 糖的最低限度诱导(0-5pg/ml)下达到满意的重组。
在每个进化循环后分离的质粒DNA用进4亍消化，并且在50^1 PCR混合物中用引物Pl( 5，-TCTACTGTTTCTCCATA-3，； SEQ ID NO: 19)和P2 (5'陽TGTCGCCCTTATTCCCT-3，； SEQ ID NO: 20)才广i曾已 4吏进化载体成功重组的重组酶编码序列，所述PCR混合物包含IX PCR 緩冲液、250iuM每种dNTP、 3mM MgCh和1.5单位BioTaq DNA聚合 酶，根据下述程序于94。C变性60秒；于55。C退火60秒和于72。C延 伸90秒的35个循环。重组形式的质粒的PCR产物产生1.7kb条带。这 种PCR产物用^^GI和；^)al进行消化，并且亚克隆回合适的pEVO-LTR 载体内用于下一个进化循环。对于所有文库，文库维持超过25000个个 别克隆。
Cre仅以极低水平4吏loxltrla重组(数据未显示)，从而反映其高耙 特异性。相比之下，诱变处理文库的表达导致在所有/oxLTR子集的低 重组活性。分裂突变促进经由Cre文库的识别，并且因此充当用于随后 定向进化循环的起始点。反复定向进化循环导致具有功能候选物的重组 酶文库的富集(参见图2B)。获得对于每种/oxLTR有效的重组酶所需 的进化循环数目在/ojcLTR子集之间不同，但最终对于所有子集观察到 文库的有效重組活性。
V. 文库的合并以及DNA改组以允许邻近更高子集的重组
为了测试组合方法目前是否将允许邻近更高子集的重组，分别合并 文库la和lb以及2a和2b并且进行改组。
执行DNA改组(Stemmer, 1994),以在每第三个进化循环后在 体外使获得的Cre突变体重组，以及也使更低子集的重组酶文库重组，以起始针对更高/o义LTR粑位点的进化。简言之，包含重组酶基因的DNA 片段通过超声处理进行随机片段化，其中使用12%波幅5分钟，伴随 30秒脉冲开和5秒脉冲关，使用来自Branson的450-D Digital Sonifier。 超声处理的片段(大小100-400 bp)使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)进 行纯化。为了重新装配片段，将2)iig超声处理的DNA加入50^1 PCR混 合物中，并且使用上文描述的相同程序进行扩增(参见实施例2.IV)。 将3|nl这种无引物PCR反应产物用作模板用于下一轮PCR，其中使用引 物PI ( 5，-TCTACTGTTTCTCCATA-3，， SEQ ID NO: 19 )和P3 ( 5，國 GCGGATGAGAGAAGATT-3，； SEQ ID NO: 21 ),在50(il PCR混合物中 使用相同的循环条件。改组的文库(最终PCR产物)用BsrGI和Z6al 进行消化，并且克隆回分别具有/o;cLTRl和/o;cLTR2的合适pEVO载体 内。来自不同文库的突变组合导致协同效应，且导致重组酶的产生，所 述重组酶现在重组/oxLTRl和/oxLTR2 (参见图2B ),从而证实穿过中 间体的进化策略可以用于取得所需活性。
VI.文库的合并以及DNA改组以允许在LTR内的不对称耙位点的
重组
/o;cP序列是2个Cre单体结合的对称位点。使不对称耙位点重组的 重组酶因此必须识別各种序列的半位点。为了测试通过解决使不对称 /ojcLTR靶位点重组的问题的底物关联的蛋白质进化是否可以获得重组 酶，使来自/wLTRl和/oxLTR2的文库合并且改组，并且就具有不对称 /ojcLTR耙序列的进化载体中的重组进行测定。在第 一个循环中检测出极 低的重组活性，其在随后循环中就功能候选物进行富集(参见图2B), 从而证实靶位点中的对称性不是关于位点特异性重组反应的先决条件。
总共126个进化循环后，进化过程停止，并且个别/ojcLTR特异性 重组酶就其重组性质进行检查。50种个别重组酶使用限制性分析在大肠 杆菌中进行功能分析(数据未显示)。
当在基于lacZ的报道分子测定中进行测试时，最活跃的重组酶(因 LTR重组酶而命名为Tre )显示/oxLTR位点的有效重组，对于/oxP具 有一些残留活性(参见图7A和B)。为了定量Tre的粑特异性，在所 有/o义LTR子集的进化载体中检查其重组性质(参见图7C)。如在报道 分子测定中，Tre使/o;cLTR序列有效重组，并且显示对于/ojcP的残留 活性(参见图7C )。Tre还显示对于/oxLTR2b的有效重组和对于/oxLTR2的残留活性，但未观察到对于/o义LTRla、 /o;cLTRlb、 /oxLTRl和 /o义LTR2a的重组(参见图7C )。当考虑到Tre由这些子集进行进化时， 这是值得注意的。这个观察证实先前的发现靶特异性在定向进化中最 初放松后经过许多世代循环恢复(Buchholz & Stewart ， 2001; Santoro & Schultz, 2002) ; Matsu而ra & Ellington, 2001 )。 VII.进化的重组酶的测序
来自所有子集的进化的重组酶和/oxLTR进行测序以监控进化过程。 序列揭示起于不同子集的突变的聚类，其通过进化过程组合并且通过在 更高子集中的新簇补充(参见图4和表1 )。
表1显示关于所指出的进化的重组酶的/o;cltr子集在测序的重组酶 中的氨基酸突变。有阴影的残基在Cre晶体结构中接触DNA。以粗体字 母显示关于DNA接触和非接触位点的高变残基(也在图5中显示)。
表i
进化的重组酶
氨基酸突变
1a,1 1a.2 1a.3 1a.4
1a.5 1a.6 1aJ 1a.8
1b.1 1b.2 1b.3 化.4 1b.5 化.6 1b.7 1b.8
2a.1 2a.2 2a.3 2a.4 2a.5 2a.6 2a.7 2a.8
2b.1
2b.2
K25E, D29G, A127V, E138G, M149I. D341N M28A, ^g, V125I, I166T, G229D, D232V G82S， E150A. U71V, V204A, I320M
N3D, V7L, K62R, E138G. D329A
D29A, VH5I, ^^TS305P, T316A —
S2T, N3K, L4S. N60S, M97I, R179G, F239L, D278G, ,320S
N3D, V7L, K62R, V204A, P234L. S305P
N59T, I88V, I166V, j^^g, S186T, S214I, P234L. S^^'絮錢 V7L, K62N, A112V, R146C, U61Q, F163L, G208R.為24游,; V7L, Q94L, S10BG, E123K, N151T, T268A, N317T, I320M V7L, C155R.MPE N317T, I320S N3D, V7L, S1086, D143N,職顯，N317T, I320S N3D, V7L, S114P, D189G, pl幾，I306T N3D, V7L, S108C, D143N, ^^1， N317T, I320S L4I, V7L, S108G, E210K. I320S, D343E
L5P, L14F,斑繊,D189G, M193A, L215Q， I320S G93A, A112T， E1云8G, D143G, D278G, T316A V7L, Q94L, A127P, D153N, A178P, N319S
N湖，P107I, T253S, T316A, I320S T6S, D21E, Q9礼，L98I, E138G, G198S', A231V T19M. Q35R, E150V, G191E， G198S, S254C, D278G T6S, D21E. Q94L, L98I, E138G， G198S, A231V T19M, Q35R, E150V, G191E, G198S, S254C, D278G
蹈，D341G
V7L, V16A, M30V, Q35P, N59S, SW9, D157E, A249T,短鹏,
N317T, I320S, T332A — —
V7L, R24H, M28I, A36V, f5"范D73Y, Y77H, P107L,,汉T206A, 'S^P^,2b.3 2b.4
2b.5 2b.6 2b.7 2b.8
D277G, N317T, I320S _ _ —
V7L. V16A, M30V, Q35P, S108G, G2Q§R, fe"^lp, N317T, I320S,顿^i( _
V7L, V16A, M30V, V71A, N111S, Q255R, E^5S,
N317T, I320S —
N3D, V7L， M30V, Q35P, S108G, A249T, I!^項,A267G, N317T. I320S V7L, V16A, M30V, Q35P, Y77H, G93C,鄉6iCp^6. ^H§, N317T, I320S V7L, V16A, M30V, Q35P. S108G, G208R, E^iCKil^T. 1320S, G342!一 V7L, R24H, M28I, A36V, F37L, D73Y, Y77fTTl07L, A131V. T206A, D277G, N317T, I320S
进化的重组酶
氛基酸突变
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
Tre
Loxltr.1 Loxltr.2 Loxltr.3 Loxltr.4 Loxltr.5 Loxltr.6 Loxltr.7
L75F, VB5A, Q94L, S108G, C155R, GJ^^JI^, D278G, N317H, I320S
V85A, Q94L, S108G, G198S, D232E,缀錢"""
V48I, R50Q, Q94L, V230A, S257T,踪^T^317T, ,320S
V23A, L75F, V85A. Q94L， R101Q, Sl68G, G230A, N317T, I320S
V"7L, Q9H, N10S, V23A, D29E, R34H, K62E, L75F, V85A, Q94L,
S108G, L1S4P, T206A, F239L, V247A, ^~
,,N317T, I320S
V85A, Q94L, S108G, D153N, G198S, D232E上^^, N317T, I320S V85A, Q94L, S10BG, I174M. T206A, F239L. jj^嚴D278G, N317T, I320S L75F, V85A, Q94L, S108G, G198S, D27BG, N317T, I320S
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M44T, S51 L, Y77H, G93C， P107L, S^^,鹏驟.職逸,G263R. N3D' V7L, yi—6-A, q"P, K57E, Y77H, G93C, P107L, A131V, S147L, S M1S,11^. G263R, N317T, I320S
V7L' V16A， V23A, M30V, Y77H, G93C, P107L, R243G, N雜S.
V7L, G93C:Bli. IK E222G, ^gg, | ， G263R, N317T.
I320S
Q35P, Y77H, G93C,鹏狭.F@^,殿邵L赶鄉'G263R,.N317T, I320S M28I, M30V， Q35P, Y77H,G93C一, A，31V, N2称^!p,隨超,G263R K57E, G93C, '^^, G263R, N317T, I320S
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MS5P, Q281R, N317T, I320S. L5Q, V7L. P12S, L14S, P15L, V23A, A80V. V85A, Q94L, S108G, N245Y, R259Y, E262Q, G263R, T268A, N317T, W20S. T61' V7L，.,Q9H,. N.10,S, V23A' V85A' Q9礼'K132N' I166V' S^ '， SHIEG263R, N317T, I320S. N59W, Y77H, V85A, Q94L, S10BG, N245Y, R259Y， E262Q, G263R, t320S.
V7L, Q9H, N10S, K57E, V85A, Q94L, S108G, G198S, N245Y. R259H, G263R, Q281R, N317T, I320S.
Y^L, Q9Hj^N10S, V23A, V85A, I88V, Q94L, S108G, M149I, I166V, 疫翻，经顿,G263R, N317T, I320S.
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I225V,,沐欧诉,W敏G263R, N317T. I320S.
G198S, D232G, N317T, E262Q,
脇@,
总之，当与Cre比较时，Tre具有19个氨基酸变化，其中这些突变 中的许多源于不同子集(参见图5)。
实施例3 Tre重组酶的表征 I. Tre在哺乳动物细胞中的重组性质
除非另有说明，HeLa细胞于37。C在5%C02下在DMEM中进行培养，所述DMEM包含100单位/ml青霉素和链霉素并且补充有10%FCS。
通过使用Effectene转染试剂(Qiagen)根据制造商的说明书用8 |ig 报道质粒转染2 x06细胞，并且用5jug/ml噪呤霉素(Invivogen )选择， 来获得噪呤霉素抗性pSVloxltr报道细胞系。最终稳定细胞系在3pg/ml 嘌呤霉素的存在下生长。
HeLa细胞用重组酶表达和报道质粒以1: 2比以6孔形式使用 Effectene (Qiagen)进行共转染。总共0.6昭DNA用于转染。进行用重 组形式的报道质粒的平行转染，以计算重组报道质粒的百分比。
根据制造商的规程，通过使用Tropix Galacto-Light试剂盒(Applied Biosystems, Bedford, MA)测定转染后48小时的相对p-半乳糖苷酶活 性，评估转染后48小时的重组酶活性。简言之，转染后48小时HeLa 细胞用PBS进行洗涤，并且用2%甲醛和0.1%戊二醛进行固定，用0.5 %Triton-X 100进行渗透化处理，并且用包含lmg/ml X-gal、2mM MgCl2、 5mM铁氰化钾和5 mM亚铁氰化钾的染色溶液于37。C染色过夜。重组 效率就通过BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce, Rockford, IL)测量的细 胞裂解物中的总蛋白质含量进行校正。
如在大肠杆菌测定中，Cre使/oxP报道分子有效重组，但不使/oxLTR 重组，并且Tre显示对于/oxLTR报道分子的有效重组，和对于/o;cP的 一些残留活性(参见图8A和B)。为了研究Tre是否可以在基因组背 景中使其靶重组，在用Tre表达质粒转染后，稳定的/wLTR报道细胞 系就重组进4亍测试。
/oxLTR稳定细胞系通过用pSVloxltr质粒转染的HeLa细胞的喋呤 霉素选择(2jxg/ml)来产生。对于重组测定，这种细胞系用0.8吗才莫拟 品、Cre或Tre质粒使用Effectene以6孔形式进行转染，并且使用 Galacto-Light试剂盒(Applied Biosystems, Bedford, MA)就转染后48 小时的p-半乳糖苷酶活性进行测定。|3-半乳糖苷酶活性通过测量细胞裂 解物中的海肾(renilla)萤光素酶活性就转染率进行校正。
PCR测定和p-半乳糖苦酶活性测量证实Tre使包装在染色质中的 /oxLTR序列重组(参见图8C和D)。
对于PCR测定，/o义LTRHeLa细胞系用分别的重组酶表达载体使用 Effectene进行转染。转染的细胞在48小时后用PBS进行洗涤，并且进 行胰蛋白酶消化。基因组DNA使用QIAamp DNA Blood微型试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明书进行分离。基因组DNA (3jxg)就重组 进行分析，其中使用引物P，(5，-GCCTCGGCCTAGGAACAGT-3，； SEQ ID NO: 22)和P"(5，-CCGCCACATATCCTGATCTT-3，； SEQ ID NO: 23),使用具有于95。C变性30秒；于62。C退火30秒和于72t:延伸40 秒的30个循环的PCR程序，在包含IX PCR緩冲液、250jliM每种dNTP、 3mM MgCl2和1.5单位BioTaq DNA聚合酶的50|il PCR反应中。PCR 产物在0.7%琼脂糖凝胶上进行显现。
II.在HIV-1 LTR背景中Tre介导的重组的4企查
产生HIVTat报道构建体并且在Tat测定中进行测试(参见图9)。 Tat蛋白质是必需的病毒反式激活蛋白，其调节HIVLTR启动子指导的 转录(EMERMAN & MALIM, 1998 )。对于后续分析，将/oxLTR序列引 入HIV-萤光素酶报道载体(pHIV/Tl/LUC;对照载体)中在HIV-1 HXB3 LTR内(Ratner等人，1985 )。此外，将/ojcLTR序列的另 一个拷贝插 入萤光素酶编码序列的3',以产生pHIV/T2/LUC (在图9A中描述)。 因此，Tat反式激活导致由这些载体中的LTR启动子驱动的萤火虫萤光 素酶的表达。
对于瞬时Tat反式激活测定，HeLa细胞以12孔形式使用Effectene 转染试剂(Qiagen)进行转染。转染混合物包含表达萤火虫萤光素酶的 0.16吗HIV/T2/LUC或HIV/T1/LUC、 0.16 plres-neo-Tre重组酶载体 或作为阴性对照的空载体、0,08 jLigTat载体或作为关于Tat的阴性对照 的pcDNA3。细胞在转染后48小时进行裂解，并且通过使用螢火虫和海 肾荄光素酶测定试剂盒(Biotium， Inc., Hayward, CA)就萤火虫萤光 素酶活性进行测定。活性就转染效率进行校正，这通过使用lacZ载体作 为内部对照且测量来自细胞裂解物的p-半乳糖普酶活性来实现。
当HeLa细胞用Tre表达载体连同Tat载体和pHIV/T2/LUC进行共 转染时，观察到萤光素酶活性减少到1/3 (参见图9C)。相比之下，当 使用pHIV/Tl/LUC对照执行相同实验时，未检测出萤光素酶表达中的减 少(参见图9B)。
为了证明所观察到的萤光素酶表达中的减少是重組的结果，而不是 经由重组酶阻断Tat活性或来自LTR启动子的转录的结果，执行PCR 分析，在Tat反式激活后就重组进行测定(参见图9D)。
对DNA进行关于Tat反式激活测定的重组的PCR分析，所迷DNA从在重组酶的存在或不存在下用HIV报道载体转染的HeLa细胞中分 离，其中使用引物L1 (5，画GAAGGTGGGTTTTCCAGTCA画3，； SEQ ID NO: 24 )和L2 ( 5'國AGGGAAGAAAGCGAAAGGAG画3，； SEQ ID NO: 25),使用具有于95。C变性30秒、于60。C退火30秒和于72t:延伸40 秒的30个循环的PCR程序，在包含1XPCR緩冲液、250^iM每种dNTP、 3mM MgCh和1.5单位BioTaq DNA聚合酶的25^1 PCR反应中。PCR 产物在0.7%琼脂糖凝胶上进行显现。PCR产物进行凝胶提取，使用凝 胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化且用于测序。
由于萦光素酶编码序列的去除，重组导致756 bp的条带大小，而在 不存在重组的情况下，条带大小是2.7kb。关于用仅包含1个/oxLTR位 点的pHIV/Tl/LUC载体转染的细胞的PCR,在Tre的存在和不存在下都 仅产生2.7kb条带。相比之下，关于用pHIV/T2/LUC载体转染的细胞的 PCR占优势地显示下部条带，从而证实Tac激活的减少是由于Tre介导 的萤光素酶盒的切除(参见图9D) 。 PCR片段的凝胶提取随后测序证 实/oxLTR侧面的序列的精确切除(数据未显示)。
实施例4
来自HIV-1感染的人细胞基因组的完全大小原病毒的切除 检查了 Tre切除来自HIV-1感染的人细胞基因组的完全大小原病毒 的能力。
为了测试这点，构建衍生自HIV-1毒林NL4-3 ( ADACHI等人，1986 ) 的原病毒DNA，其在其5，和3， LTR中包含/ojcLTR序列(在图10A中 描述)。在这个构建体中，对于细胞培养中的病毒复制不是必要的"e/ 读框由嘌呤霉素抗性基因取代。此外，总基因组长度中的增加通过e"v 特异性序列的缺失补偿。
通过用这种原病毒DNA和编码水疱性口炎病毒包膜糖蛋白
(VSV-G)的表达载体瞬时转染293T细胞来产生病毒假型。简言之， 通过在不含抗生素的OptiMEM I (Invitrogen)中用3 pNLT2AenvPuro 和3 pg pCMV-VSV-G瞬时共转染1 x 106 293T细胞来产生HIV-1假型， 其中使用4 pl聚乙烯亚胺(PEI; 1 mg/ml),根据制造商的规程
(Polysciences, Inc.)。在转染后第2天时，收集病毒上清液并且通过 0.2 pm孔径滤器，以确保任何病毒聚集物和细胞的去除，并且通过ELISA(Innotest HIV p24 Antigen mAb; Innogenetics N. V,)测定p24Gag抗原水平。
随后，在包含15%胎牛血清(Pansystems GmbH)和抗生素(青霉 素和链霉素)的DMEM中培养的5 x 105 HeLa细胞，在6孔板中通过 spinoculation ( O'DOHERTY等人，2000 )用1000 ng/ml假型病毒连同1 pg/ml聚凝胺(Sigma-Aldhch )在1,200 x g下在室温下感染90分钟。在 感染后24小时时，更换培养基，并且洗涤细胞以去除游离病毒。在感 染后第3天时，给细胞培养物补充1 pg/ml噤呤霉素(Sigma-Aldrich ) 2 周，并且补充0.5 pg/ml嘌呤霉素另外4周，以选择且克隆释放'感染的 病毒颗粒的细胞。每第2天更换培养基以消除死细胞。
释放感染的病毒颗粒的细胞随后用表达Tre的质粒或用亲本对照载 体进行转染，这二者还携带新霉素抗性基因。分别的新霉素抗性细胞库 就重组酶活性和病毒生产而言进行监控。
依照制造商的规程使用Blood & Cell Culture DNA Midi试剂盒 (Quiagen)，从受感染的HeLa细胞中分离总基因组DNA。定量实时 PCR揭示与对照细胞相比较，在细胞基因组中HIV-1 gag特异性序列的 存在在Tre表达细胞中随着时间过去持续下降(参见图10B，上图)。 如下进行对于 HIV-1 gag (gag- 正向 5'陽ATCAATGAGGAAGCTGCAGAA-3， ( SEQIDNO: 26), gag-反向 5'國GATAGGTGGATTATGTGTCAT-3， (SEQIDNO: 27) , gag國探针 5，-FAM-ATTGCACCAGGCCAGATGAGAGAA-TAMRA-3， ( SEQ ID NO: 28))和5V3， LTR重组(LTR-正向5，画GATGGTGCTAC-AAGCTAGTAC画3' ( SEQ ID NO :29 ) ,LTR画反向 5，-CTGTCAAACCTCCACTCTAAC-3， (SEQIDNO: 30), LTR-探针 5，-FAM-AAGGAGAGAACAACATCCTATTACAC-TAMRA國3' ( SEQ ID NO: 31 ))特异的定量PCR:在Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System中，使用Platinum qPCR Super Mix UDG (Invitrogen)的包含 100ng基因组DNA、 300 nM正向引物、900 nM反向引物和200 nM杂 交探针的40个循环。每个样品一式三份地进行测试，并且结果使用相 同基因组DNA由人p-珠蛋白引物的扩增进行标准化(HBG-正向 5，-CTTAATGCCTTAACATTGTGTATAA-3， (SEQIDNO: 32) , HBG曙 反向5，誦GAATATGCAAATAAGCACACATATAT-3， (SEQ ID NO:33 ) , HBG- 探 针
5,國FAM-ACTTTACACAGTCTGCCTAGTACATTAC-TAMRA國3， ( SEQ ID NO: 34))。
培养IO周后，再也无法检测出gag序列。这个结果通过其中测定5' 和3，LTR的重组的类似分析进行紧密反映(参见图10B;下图)。
此外，通过测定培养物上清液中的p24Gag抗原水平跟踪的颗粒出 芽的停止,伴随略微延迟的动力学而发生，从而导致在第12周时与Tre 缺乏对照培养物相比较，颗粒释放的100%抑制(参见图10C,上图)。 用alamarBlue ( Serotec )的平行细胞毒性测定未能记录任何Tre诱导的 对细胞代谢的毒性作用(参见图10C,下图)。
通过激光扫描免疫荧光显微镜术显现Gag表达证实，在Tre阳性培 养物中随着时间过去生产性感染的细胞的完全消失(参见图10D)。对 于间接免疫荧光显微镜术，HIV-1感染的HeLa细胞在盖玻片上生长， 用不含Ca"和MgW的PBS进行洗涤，并且随后用3%多聚曱醛固定25 分钟。所有温育步骤都在环境温度下进行。与100mM甘氨酸/PBS温育 IO分钟后，细胞在0.1。/。TritonX-100/PBS中渗透化处理4分钟，并且在 1%BSA/PBS中温育30分钟。蛋白质在1%BSA/PBS中染色45分钟， 其中使用识别HIV-1 p55Gag的第一抗体(1: 100稀释，由B. Chesebro 和K. Wehrly， AIDS Research and Reference Reagent Program, Division AIDS, NIAID, NIH提供的Gag特异性HIV-1小鼠单克隆抗体 183-H12-5C)或兔抗Cre ( 1: 500稀释)，随后为与Cy2偶联的合适的 第二山羊抗小鼠或山羊抗兔抗体(二者来自 Rockland Immunochemicals, Inc.; 1: 150稀释)。核通过DRAQ5染色(1: 1000 稀释，Alexis Biochemicals ) 10分钟进行显现。细胞封固在moviol介质 中，并且使用Zeiss LSM 510 Meta激光扫描显微镜进行分析。有趣的是， 在第8周时将这些培养物再暴露于噤呤霉素后对照细胞还活着，但在Tre 阳性培养物中导致严重的毒性作用和最终的细胞死亡(参见图11)。这
个观察可以通过Tre介导的编码噪呤霉素抗性的原病毒基因的去除得到 解释(与图IOA相比较)。参考文献列表
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Yuan L, Kurek 工, English J, Keenan R (2005) "Laboratory-directed protein evolution" AfioroixioJ. AfoJ, S_iol, 只ev. 69, 373-92 *
权利要求
1.用于制备编码修整的重组酶的表达载体的方法，所述修整的重组酶使插入宿主细胞的基因组内的原病毒DNA的LTR内的不对称靶序列重组，所述方法包括下述步骤(a)测定所述原病毒DNA的LTR序列，鉴定其中与重组酶的已知靶位点的左半位点和右半位点序列具有至少30％同源性的序列，其中所述同源序列由5-12个核苷酸的间隔区分开，并且其中与已知靶位点具有最高同源性的所述同源LTR序列代表不对称靶序列；(b)制备2种合成序列，其中所述第一种合成序列对应于步骤(a)与所述已知靶位点的左半位点同源的不对称靶序列的序列加上所述间隔区序列，且称为“半位点序列1”，且其中所述第二种合成序列对应于所述间隔区序列加上步骤(a)与右半位点同源的不对称靶序列的序列，且称为“半位点序列2”；(c)测定在步骤(b)的合成序列内偏离步骤(a)的已知同源靶位点的相应同源左半位点和右半位点序列的核苷酸；(d)基于步骤(b)的所述合成序列产生2种靶序列的第一个子集，其中所述第一个子集中的所述第一种靶序列包含由通过所述间隔区序列分开的步骤(a)的半位点序列1和半位点序列1′组成的反向重复，且其中所述第一个子集中的所述第二种靶序列包含由通过所述间隔区序列分开的半位点序列2′和步骤(b)的半位点序列2组成的反向重复，其中半位点序列1′和2′代表步骤(b)分别的半位点序列1和2的反向重复；(e)基于步骤(d)的所述第一个子集中的靶序列产生靶序列的第二个子集，其中通过基于所选择的半位点序列构成反向重复，步骤(d)的所述第一个子集中的靶序列的每个半位点序列连同分别的间隔区序列用于产生所述第二个子集的独立靶序列，从而使得所述间隔区序列使构成反向重复的2个序列分开，其中源于步骤(d)的所述第一个子集中的靶序列之一的2个半位点序列的序列在其合成过程中且在使用其用于产生得到完全靶序列的反向重复前改变，从而使得在所述左半位点序列中，偏离步骤(a)的已知靶位点的相应同源半位点序列的核苷酸部分由已知靶位点中发现的天然核苷酸替换，并且在所述右半位点序列中，偏离相应同源左半位点的其余核苷酸由已知靶位点中发现的天然核苷酸替换，从而使得合起来看在源于步骤(d)的所述第一个子集的一种靶序列的2个半位点序列中，可以发现所有偏离核苷酸，而所述半位点序列无一单独包含所有偏离核苷酸；(f)通过逐步重复步骤(e)的过程，从步骤(e)中获得的所述第二个子集中的靶序列开始产生靶序列的进一步子集，每次产生靶序列的一个新子集，直至在每个所产生的靶序列内构成反向重复的半位点序列包含偏离已知靶位点的相应同源半位点序列的1、2或3个核苷酸；(g)将分子定向进化应用于识别步骤(a)中所选择的已知同源靶位点的重组酶，其中使用步骤(f)中获得的最终子集的靶序列作为底物，所述靶序列包含偏离所述已知同源靶位点的相应同源半位点序列的1、2或3个核苷酸；(h)改组步骤(g)中进化的所述重组酶文库；(i)将分子定向进化应用于步骤(h)中获得的所述改组文库，其中使用根据步骤(f)的邻近更高子集的靶序列；(j)重复步骤(h)和(i)，直至通过分子定向进化取得至少一种重组酶，其对于步骤(a)的在逆转录病毒DNA的LTR内的不对称靶序列有活性；(k)从所述文库中分离步骤(j)中获得的至少一种重组酶的核酸；和(l)将步骤(k)中获得的核酸克隆到合适的表达载体内。
2. 根据权利要求1的方法，其中其靶序列在步骤(a)中使用并且 在步骤(g)和(i)中在其上应用分子定向进化的已知重组酶属于丝氨 酸整合酶家族。
3. 根据权利要求1的方法，其中其靶序列在步骤(a)中使用并且 在步骤(g)和(i)中在其上应用分子定向进化的已知重组酶属于酪氨酸整合酶家族。
4. 根据权利要求3的方法，其中所述重组酶选自来自噬菌体P1的 Cre重组酶、来自酵母的FLP和来自噬菌体D6的Dre。
5. 根据权利要求1-4中任一项的方法，其中步骤(a)中鉴定的所 述不对称耙序列位于所述原病毒的5'-LTR和3，-LTR中。
6. 根据权利要求5的方法，其中插入宿主细胞的基因组内的所述原 病毒DNA是选自下述的逆转录病毒的DNA:小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、摩-傅猴病毒(MPMV)、人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)、人T 细胞白血病病毒II型(HTLV-II)、猴T细胞白血病病毒I型(STLV-I)、 猴T细胞白血病病毒II型(STLV-II)、牛白血病病毒(BLV)、猫白 血病病毒(FeLV)和莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)。
7. 根据权利要求6的方法，其中所述逆转录病毒是选自下述的慢病 毒人免疫缺陷病毒l型(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、 猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV )、 Maedi-visna病毒(MVV )、马传染性贫血病毒(EIAV)和山羊关节炎 脑炎病毒(CAEV)。
8. 根据权利要求7的方法，其中步骤(a)中鉴定的所述不对称靶 序列位于HIV原病毒的5'-LTR和3'-LTR中。
9. 根据权利要求8的方法，其中位于HIV原病毒的5'-LTR和 3'-LTR中的步骤(a)中筌定的所迷不对称耙序列具有如SEQIDNO: 3 中所示的序列。
10. 根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所使用的分子定向进 化是底物关联的蛋白质进化。
11. 根据权利要求1-10中任一项的方法，其中步骤(1)中的所述 表达载体是选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、泡沫病毒载体和腺病毒 载体的表达载体。
12. 根据权利要求11的方法，其中所述表达载体是选自HIV-l-、 SIV-、 FIV-或EIAV衍生的慢病毒载体的慢病毒载体。
13. 根据权利要求1-12中任一项的方法，其中步骤(1)中的所述 表达载体包含细胞、细菌、病毒或杂种启动子。
14. 根据权利要求13的方法，其中所述启动子是组成型启动子或其 衍生物。
15. 根据权利要求14的方法，其中所述组成型启动子或其衍生物选 自巨细胞病毒、劳斯肉瘤病毒、鼠白血病病毒相关逆转录病毒、磷酸甘 油激酶基因、鼠脾脏病灶形成病毒或人延伸因子la的启动子。
16. 根据权利要求13的方法，其中所述启动子是诱导型启动子或其 衍生物。
17. 根据权利要求16的方法，其中所述诱导型启动子或其衍生物选 自LTR或其衍生物，所述LTR或其衍生物衍生自慢病毒、泡沫病毒和S逆转录病毒。
18. 根据权利要求17的方法，其中所述LTR或其衍生物衍生自 HIV-1 、 HIV-2、 MVV、 EIAV、 CAEV、 SIV、 FIV、 BIV、 HTLV-I和HTLV-II。
19. 用于制备修整的重组酶的方法，其中所述方法包括根据权利要 求1-18中任一项的方法，和在合适的宿主细胞中表达所述修整的重组酶 或融合多肽的进一步步骤，所述融合多肽包含来自插入表达载体内的编 码重组酶的核酸的所述修整的重组酶的氨基酸序列。
20. 用于制备经转化的成体干细胞的方法，其中所述方法包括根据 权利要求1-18中任一项的方法，和在体外将所述表达载体引入合适的成 体干细胞内的进一步步骤。
21. 根据权利要求19的方法，其中所述宿主细胞选自细菌细胞、酵 母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
22. 核酸，其可由根据权利要求1-18中任一项的方法的步骤(k) 获得。
23. 根据权利要求22的核酸，其中编码所述修整的重组酶的所述核 酸具有如SEQIDNO: 2中所示的核酸序列。
24. 表达载体，其可由根据权利要求1-18中任一项的方法获得。
25. 修整的重组酶，其可由根据权利要求19的方法获得。
26. 根据权利要求25的修整的重组酶，其中所述蛋白质具有如SEQ ID NO: 3中所示的氨基酸序列。
27. 融合多肽，其可由根据权利要求19的方法获得，其中所述修整 的重组酶与第二种多肽连接。
28. 根据权利要求27的融合多肽，其中所述笫二种多肽包含信号肽。
29. 根据权利要求28的融合多肽，其中所迷信号肽是蛋白质转导结 构域。
30. 根据权利要求29的融合多肽，其中所述蛋白质转导结构域是 TAT肽或来自触角足同源域的笫三个螺旋的肽。
31. 成体干细胞，其可由根据权利要求20的方法获得。
32. 根据权利要求31的成体干细胞，其中所述成体干细胞是来自造 血i普系的干细月包。
33. 根据权利要求1-21中任一项的方法，其进一步包括将所迷表达载体、所述蛋白质、融合蛋白或所述成体干细胞制备为用于减少受逆转 录病毒感染的受试者中的病毒量的药物组合物的步骤。
34. 根据权利要求33的方法，其中所述药物制剂进一步包含药学上 可接受的载体、赋形剂和/或佐剂。
35. 药物组合物，其可由根据权利要求33或34的方法获得。
36. 根据权利要求35的药物组合物，其中所述药物组合物使受逆转 录病毒感染的受试者中的病毒量减少至低于5.000基因组当量/ml血浆， 优选低于500基因组当量/ml血浆，和更优选低于50基因组当量/ml血 浆。
37. 根据权利要求36的药物组合物，其中所述逆转录病毒是选自下 述的逆转录病毒小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、摩-傅猴病毒(MPMV)、 人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)、人T细胞白血病病毒II型(HTLV-II)、猴T细胞白血病病毒I型(STLV-I)、猴T细胞白血病 病毒II型(STLV-II)、牛白血病病毒(BLV)、猫白血病病毒(FeLV) 和莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)。
38. 根据权利要求36的药物组合物，其中所述逆转录病毒是选自下 述的慢病毒人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免 疫缺陷病毒(BIV) 、 Maedi-visna病毒(MVV)、马传染性贫血病毒(EIAV) 和山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)。
39. 根据权利要求35-38中任一项的药物组合物，其中所述受试者 选自人、灵长类动物、猴、牛、马、山羊、绵羊和家猫。
40. 根据权利要求35-39中任一项的药物组合物，其中所述药物组 合物用于与高效抗逆转录病毒疗法(HAART)的其他活性剂伴随施用。
41. 根据权利要求35或40中任一项的药物组合物，其中所述药物 组合物用于与总体免疫激活疗法或原病毒基因表达的特异性激活伴随 或在其之后施用。
42. 最优化受试者的逆转录病毒感染的治疗的体外方法，其包括下 述步骤(a) 测定患者血样中存在的逆转录病毒DNA的核酸序列；(b) 就已知重组序列扫描步骤(a)的序列的LTR序列，对于所述 重组序列已制备特异性修整的重组酶；(C)倘若至少一种所述已知重组序列存在，那么将选自下述的化合物制备为药物组合物，以用于减少所述受试者中的病毒量包含特异 性识别所述已知重组序列的修整的重组酶的核酸的表达载体、所述修整 的重组酶、包含所述修整的重组酶的氨基酸序列的融合蛋白或包含所述 表达载体的成体干细胞；否则鉴定分别与重组酶的已知靶位点的左半位 点和右半位点序列具有至少30%同源性的序列，并且命名为"不对称靶 序列"，其中同源序列通过5-12个核苷酸的合适间隔区分开；(d) 执行用于制备编码修整的重组酶的表达载体的根据权利要求 1-18中任一项的方法的步骤(b)至(1)，所述修整的重组酶使原病毒 DNA的LTR内鉴定的不对称靶序列特异性重组；和(e) 将步骤(d)中获得的表达载体、由所述表达载体表达的蛋白 质或融合蛋白或者由所述表达载体转染或感染的干细胞制备为药物组 合物，用于减少所述受试者中的病毒量。
43. 根据权利要求42的方法，其中在步骤(d)中将定向分子进化 应用于》务整的重组酶，所述^f奮整的重组酶已识别与野生型重组酶的那种 不同的把位点。
44. 根据权利要求42或权利要求43的方法，其中在将所述重组酶 制备为药物组合物前执行任选步骤，所述步骤为就切除所述受试者由其 感染的逆转录病毒的原病毒DNA而言，在体外测试在权利要求42的方 法的步骤(c)中鉴定的重组酶或在权利要求42的方法的步骤(d)中 获得的特异性修整的重组酶的效率。
45. 根据权利要求42-44中任一项的方法，其进一步包括将步骤(e) 中获得的修整的重组酶包括到特异性修整的重组酶的集合内的步骤。
46. 修整的重组酶的集合，其中所述集合的成员各自通过权利要求 1-19中任一项或权利要求42-45中任一项的方法而获得。
47. 根据权利要求46的集合，其中所述集合中的所述修整的重组酶 作为编码修整的重组酶的表达载体、作为编码修整的重组酶的核酸、作为包含质粒载体的细菌细胞、作为病毒载体或作为蛋白质进行贮存。
全文摘要
本发明涉及用于制备编码修整的重组酶的表达载体的方法，其中所述修整的重组酶使插入宿主细胞的基因组内的逆转录病毒的原病毒DNA的LTR内的不对称靶位点重组，并且作为用于从宿主细胞的基因组中切除原病毒的工具有用。本发明进一步涉及最优化受试者的逆转录病毒感染的治疗的体外方法，以及修整的重组酶用于制备药物组合物用于减少受逆转录病毒感染的受试者中的病毒量的用途。
文档编号C12N15/867GK101622356SQ200880001846
公开日2010年1月6日 申请日期2008年1月3日 优先权日2007年1月8日
发明者A·F·斯图尔特, F·巴克霍尔茨, I·萨卡, I·豪伯, J·豪伯 申请人:汉堡大学海因里希-佩蒂实验性病毒和免疫学研究所