专利名称：钌视紫质生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物传感器，该生物传感器能够用于检测化学物质，例如，嘌呤及嘌呤的衍生物(如自黄嘌呤、腺苷、三磷酸腺苷(ATP)和/或肌苷)。本发明要求于2007年1月4日提交的英国专利申请GB0700157.1的优先权，并将该申请的全文在此一并引入作为参考。
背景技术：
生物传感器含有具有生物识别分子(例如，酶、抗体、细胞器和全细胞)的电极，以允许对分析物(例如代谢产物、离子、气体和有机蒸汽)进行特异性的识别。这种生物识别元件典型地附着于传感器(如电化学设备、压电设备、光电子设备、光纤设备、电热设备、二极管设备或表面声学设备)上，从而能够对生物识别元件与待检测的分析物的结合进行检测。例如，Palmisano F等评价了安培生物传感器(Fresenius J.Anal.Chem.(2000)，Vol.366，pages 586-601)。可以使用广泛的介导化合物(mediator compound)和介导聚合物，使电子能够从合适的生物识别元件(例如酶)中转移至电极。
Clark和Lyons早期制作的生物传感器(Clark and Lyons，1962)已经经过了不断的改进，并在很多领域中成为有效的工具。通过不同的方式已经实现了对生物传感器的操作至关重要的活性酶的固定化(Cass，1990)。然而，将酶包埋在电子聚合物基质中在产生具有较小和自定义形状的传感元件的生物传感器中具有特别的优势。这些类型的生物传感器对检测中枢神经系统中释放的神经递质来说是理想的，因为它们的侵入程度被最小化。
Cosnier和合作者开发出了吡咯衍生物，该吡咯衍生物适用于将酶引入微电极，并使用这些方法开发了多种生物传感器，包括对谷氨酸敏感的传感器(Poitry et al.，1997)和对多巴胺敏感的传感器(Cosnier et al.，1997)。事实上，使用生物素化的(biotinised)衍生物的生物传感器在Cosnier的美国专利US 6,197,881 B中有记载。虽然这些是神经系统中重要的信号因子，但这些传感器上的聚合物膜不够结实，从而不能完好地植入到神经组织中(Poitry et al.，1997)，并且所述传感器在检测从生物组织的释放中具有多种功能(Poitry et al.，1997；Cosnier et al.，1997)。然而，Cosnier开发的这些方法能够进行一般性的应用，并且本发明人也曾尝试过这些方法，以构建能够允许对从神经系统中释放出的嘌呤进行空间定位的且快速的检测的结实的且敏感的微电极生物传感器。嘌呤、ATP和腺苷在周边神经系统和中枢神经系统中均具有极其重要的信号通信功能。在周边，它们参与控制平滑肌的收缩，并且是强力的血管舒张剂(McMillan et al.，1999)。在中枢，它们的多种作用包括脊柱疼痛途径的调节(Sawynok，1998)；局部缺血过程中的神经保护(Dale et al.，2000)；递质释放(transmitter release)的控制(Brundege andDunwiddie，1997)；脊柱运动模式发生的调控(Dale，1998；Dale and Gilday，1996)；睡眠的诱导(Porkka-Heiskanen，1999)。特别是，腺苷并不遵从神经系统的化学神经传递的常规方式。不像大多数的递质一样直接被释放出，腺苷通常在统称为外核苷酸酶的特定酶的作用下由之前释放的ATP在细胞外空间中产生(Zimmermann and Braun，1999)。腺苷的生成-它的空间域和累积动力学对它在神经系统内的功能来说是十分重要的，因此，期望它在空间域和累积动力学上与常规的神经递质具有显著的不同。对收集的浇注液的HPLC分析被用于研究腺苷的释放，然而，该方法的时间和空间分辨率是非常有限的(Pedata et al.，1993)。因此，用于直接检测腺苷生成的新方法在了解腺苷对神经功能的作用上是十分有价值的。
近来，通过3-酶生物传感器(标记-1)实现了对生理活动期间产生的腺苷的检测，所述3-酶生物传感器利用微量渗析电极(250mm直径)来捕获位于半透膜后的所需的酶。这种传感器是WO 99/07877的主题，并且是敏感的，并成功地对腺苷在运动过程中从非洲蟾蜍胚胎脊髓中的释放(Dale，1998)以及在组织缺氧过程中从哺乳动物海马中的释放(Dale et al.，2000；Pearson et al.，2001)进行了检测。然而，这种传感器过大而不能够在不引起损害以及后续的组织反应的情况下引入到神经组织中，所述组织反应可能打乱生理学检测或使生理学检测失效。此外，检测装置的较大尺寸(当以最终构建的形式使用时为500μm)引起扩散的延迟，减慢了传感器的应答。为了扩大这种检测技术的应用范围，并且为了快速产生腺苷及有关的嘌呤，需要更小且能够产生更快的应答的生物传感器。
监控嘌呤(如次黄嘌呤)水平的能力在医学中也是非常重要的。例如，次黄嘌呤能够提供出生期间婴儿氧水平的指示，并能够作为对不良应激的早期预警系统。
如果婴儿脑部缺氧，助产师和医生将会明确地知道有关何时需要进行剖腹产手术的信息。因此，监控次黄嘌呤水平的能力将有助于防止不必要的紧急剖腹产手术，因为如果担心婴儿会发生能够导致婴儿脑瘫或其它生理缺陷的缺氧或窒息时，医生会时常进行这种紧急的剖腹产手术。每升血液中含有高于5μM的次黄嘌呤的婴儿处于婴儿缺氧的严重危险中。15μM或更高的水平将表明较严重缺氧和脑损伤的缺氧危险。
当前，血液样品需要被送入实验室进行分析，这将导致获得结果的延迟。因此，在产房中就能够为医生提供有关未出生的婴儿所面对的缺氧危险的即时数据的生物传感器是有益的。
WO 03/087801中讨论了一种替代性的电极。其公开了在铂或铂合金衬底上结合使用糖衍生的吡咯和包括两性吡咯的第二层。发现这种方式能够改善传感器的弹性。
WO 2004/048603中给出了所述传感器的一种替代性设置，该申请的全文在此一并引入作为参考。这件申请中描述了在导电衬底上产生溶胶凝胶的方法。例如，它能够允许将酶包埋到用于制备生物传感器的溶胶凝胶基质中。
EP 0537761中公开了一种生物传感器，该生物传感器包括位于聚对苯二甲酸乙二醇酯衬底上的电极。酶(如黄嘌呤氧化酶)与电极通过电极电子受体(如被称作普鲁士蓝(PB)的铁氰化钾)结合。
然而，使用PB作为电子受体存在问题，主要是由于它对生理液体中存在的Na+存在不耐受性。Na+在生理液体(如血液)中是大量存在的，这使得PB不适于用作生物传感器的材料。
因此，需要开发一种对生理液体中存在的Na+具有耐受性并且在这种环境中仍能够实现其功能的生物传感器。
发明内容
与PB有关的化合物，具有通式KFeRu(CN)6或Fe4[Ru(CN)6]3的钌视紫质(Ruthenium Purple，RP)也可以用在生物传感器中。然而，在迄今为止的文献中公开的仅仅由RP改性的生物传感器均为葡萄糖生物传感器，并且在这些生物传感器的结构中使用粘土、沸石或煤渣来锚定RP(例如，见Zenet al，Anal.Chem.，2003，75，2703-2709)。
RP不具有PB显示出的对Na+离子的不耐受性。虽然，Na+离子的存在对电位的影响较小，但RP仍然能够有效地起到电子受体的作用。在相似的环境中，包括PB的相似的生物传感器终止了功能。
在电化学中说明了上述性质。在含有显著浓度的Na+离子的普通磷酸盐缓冲液中对RP的电化学没有太大的影响(见图2)。为了维持PB的电化学活性，已知需要适合PB晶格的阳离子，例如，K+、Rb+、Cs+和NH4+。缓冲液中其它较小的阳离子(例如，Na+、Mg2+、H+和Ca2+)用作阻断阳离子，对PB的电化学性能具有副作用，影响传感器的操作电位。因此，广泛地用于生物分析的Na+离子的应用对PB在生物传感器中的应用具有显著的限制作用。
与PB以及它的其它类似物相似，RP具有可溶形式和不可溶形式。然而，RP比PB更易溶于水，并且RP的不可溶的氧化形式非常稳定。在RP改性的生物传感器的最佳操作电位(通常为0或50mV vs Ag/AgCl)，RP为可溶形式，这种形式容易沥取(leaching)并能够导致活性损失。在这些传感器中总能够观察到应答的减少。因此，稳定RP以抗沥取和提高应答的能力是期望得到的。
因此，根据本发明，提供了一种生物传感器，该生物传感器包括 (i)导电衬底； (ii)形成在所述衬底上的第一层，该第一层包括钌视紫质； (iii)形成在所述第一层上的第二层，该第二层包括聚苯胺或具有一个或多个非极性取代基的聚苯胺衍生物； (iv)形成在所述第二层上的第三层，该第三层包括一种或多种酶。优选情况下，所述酶被包埋在基质中，或被吸附在所述第二层上。最优选使用所述基质。
为了克服与RP生物传感器有关的沥取问题，本发明使用了先前未曾记载过的改性RP的形成方法。本发明的方法优选包括通过加热使RP层稳定；在RuCl3的溶液中使RP层进行电化学循环；使RP层与含有苯胺或苯胺衍生物的溶液接触。通过这种方式，将含有聚苯胺或具有一个或多个非极性取代基的聚苯胺衍生物的膜引入到RP改性的生物传感器。
图4描述了RP改性的生物传感器在不存在任何聚苯胺的情况下对次黄嘌呤的FIA应答。可以清楚地看出，对次黄嘌呤的应答随时间而出现了下降。这是由于RP的沥取。图5还清楚地显示出RP沥取的影响，不具有聚苯胺膜的生物传感器的循环伏安图谱与后续的循环相比明显减小。这与图5中显示较少沥取或未沥取的重复循环的循环伏安图谱B相反。
图6进一步确认了上述结论，因为在整个时间内对次黄嘌呤的FIA应答是一致的。聚苯胺基本上防止了RP在水溶液中的沥取且不对电化学产生干扰。
用于生物传感器的聚苯胺膜的例子包括Iwouoha E.I等(Biosensors &Bioelectronics(1997)，12(8)749-761，Chois J.、Park S.M.(J.ElectrochemicalSoc.(2002)，149(2)E26-E34)和Sun等(J.Chem.Soc.Chem.Commun.(1990)，529-531)。
优选所述聚苯胺的至少一部分为它的氧化状态。氧化苯胺的存在对预防RP的沥取来说是十分重要的。聚苯胺的氧化形式可以理解为传导性的。
因此，优选所述聚苯胺的至少一部分是被氧化的。例如，优选通过正电压(例如，至多+1.3V以氧化聚苯胺或聚苯胺的衍生物)对所述聚苯胺层进行循环来实现所述氧化。
虽然所述聚苯胺为所述膜的优选组分，但是还可以在本发明的范围内使用具有一个或多个非极性取代基的其它聚苯胺衍生物。通过非极性化，我们想要得到这样的官能团具有较低的偶极矩值，并且由具有非极性共价键或能够彼此相互抵消的极性共价键的元件所组成。特别地，这种取代基包括烃基链(优选C1-C12烃基链)和醚，优选含有C1-C12的烃基链。可以包括任何的直链或支链的烃基链，尤其是，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、n-Pe和正己基。
包括一个或多个极性取代基(例如羟基或氨基(如聚(氨基苯酚)或聚(苯二胺)))或其它取代的苯酚(例如聚酚类或聚吡咯)的其它的聚苯胺衍生物，在本发明能够的生物传感器中的功能并不很好，因为它们对电化学有影响或者不能预防沥取。
虽然RP改性的生物传感器是本领域公知的，但并没有将RP改性的传感器用于检测化学品(例如嘌呤和嘌呤衍生物，如次黄嘌呤、ATP、腺苷和/或肌苷)。防止微电极中的沥取是十分重要的。
优选情况下，所述导电衬底包括铂或铂合金、金或金合金、或碳。然而更优选的情况下，所述衬底为铂或铂-铱合金，例如含有90∶10比例的铂∶铱(重量∶重量)，或金。
优选情况下，所述基质层中的一种或多种生物材料为酶。所述酶优选独立地选自黄嘌呤氧化酶、葡萄糖氧化酶、乳酸酯氧化酶、胆固醇氧化酶、半乳糖氧化酶、谷氨酸氧化酶、辣根过氧化物酶、多酚氧化酶、D-果糖脱氢酶、L-谷氨酸脱氢酶、醇脱氢酶(如甲醇脱氢酶)、尿素酶、尿酸酶、乳酸酯脱氢酶、谷丙转氨酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、谷氨酰胺酶、核苷磷酸化酶、抗坏血酸氧化酶、细胞色素C氧化酶、腺苷脱氨酶、D-或L-氨基酸氧化酶、酪氨酸酶、过氧化氢酶、磷酸烯醇丙酮酸激酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸酯氧化酶、磷酸激酸激酶、乙酰胆碱酯酶、胆碱氧化酶、和/或胆碱脱氢酶。也可以使用本领域公知的其它酶。这些酶可以分别使用，或者两种或两种以上以的形式结合使用，以串联检测一种或多种不同的底物。典型地，这种电极使用了能够通过RP将电子转移到电极上的氧化还原酶。
优选情况下，所述分析物选自以下分析物，该分析物与优选用于它们检测的酶组合一起给出葡萄糖(葡萄糖氧化酶)、乳酸酯(乳酸酯氧化酶)、胆固醇(胆固醇氧化酶)、半乳糖(半乳糖氧化酶)、谷氨酸(谷氨酸氧化酶)、次黄嘌呤(黄嘌呤氧化酶)、过氧化氢(辣根过氧化物酶)、果糖(D-果糖脱氢酶)、谷氨酸(L-谷氨酸脱氢酶)、乙醇(乙醇脱氢酶)、甲醇(甲醇脱氢酶)、尿素(尿素酶)、尿酸(尿酸酶和辣根过氧化物酶)、乳酸酯(L-乳酸脱氢酶和谷丙转氨酶)、肌酸(肌酸酐酶和肌酸酶以及肌氨酸氧化酶)、谷氨酰胺和谷氨酸(谷氨酰胺酶或谷氨酸氧化酶)、腺苷(腺苷脱氨酶)、ATP(乙二醇激酶或乙二醇-1，3-磷酸酯氧化酶)、以及肌苷(核苷磷酸化酶)。
最优选的分析物为次黄嘌呤、ATP、腺苷和/或肌苷。
在同一时间诱导多个酶的能力能够改善所述生物传感器的产生速度以及由该生物传感器获得的应答速度。
其它的酶包括RNA酶、DNA酶、核酸酶、核糖核酸酶和过氧化氢酶。可以添加活性蛋白质，例如血红素、肌红蛋白、胶原或微管蛋白。还可以结合使用抗体或抗体片段，例如，IgG、IgM、Fab或F(ab1)2片段。
最优选情况下，所述生物传感器含有氧化还原酶，例如黄嘌呤氧化酶。所述生物传感器还可以包括核苷磷酸化酶和/或腺苷脱氨酶。所述酶可以为甘油激酶和甘油激酶与甘油-3-磷酸酯氧化酶。
例如，可以使用黄嘌呤氧化酶来检测次黄嘌呤。如果黄嘌呤氧化酶与核苷磷酸化酶一起使用，这种电极可以用于检测黄嘌呤、肌苷和次黄嘌呤。在酶中加入腺苷脱氨酶能够将嘌呤(腺苷)转变为肌苷，从而能够通过该传感器对嘌呤(如腺苷)进行检测。肌苷也可以被核苷磷酸化酶转变为次黄嘌呤。
最终，通过黄嘌呤氧化酶将链中的次黄嘌呤转换成尿酸和过氧化氢。这是由衬底检测到的过氧化氢。
使用所有三种酶能够实现对嘌呤的检测，例如，待检测的腺苷，以及肌苷、次黄嘌呤和黄嘌呤。仅仅使用核苷磷酸化酶和黄嘌呤氧化物酶，则可以检测肌苷、次黄嘌呤和黄嘌呤。选择性地，仅仅使用黄嘌呤氧化酶则可以检测次黄嘌呤。
优选情况下，使用相对于核苷磷酸化酶过量的黄嘌呤氧化酶。优选地，使用大约等量的核苷磷酸化酶和腺苷脱氨酶。
基于活力单位，腺苷脱氨酶核苷磷酸化酶黄嘌呤氧化酶的最优选比例为约1∶1∶5。发现这个比例是这类电极的最佳比例。
可以使用甘油激酶和甘油-1，3-磷酸酯氧化酶来检测ATP。可以通过肌酸激酶等来实现酶促扩增。
虽然在此举例说明了嘌呤生物传感器，但也可以使用其它的酶以及两种或两种以上酶的酶联级反应。
在本发明的生物传感器中，过氧化氢优选被作为生物反应产物在电极处被检测到。这种应答与待检测的物质的浓度有关。作为电化学介质的RP消除了直接在生物传感器电极的表面检测过氧化氢的超电位，这种超电位能够引起其它生化试剂(例如抗坏血酸和多巴胺)的共氧化，从而对得到的结果产生影响。
所述基质可以为本领域公知的用于包埋生物传感器所用的生物材料的任何合适的基质。例如，这种基质在Palmisano F.(2000)supra和WO 03/08721中进行了讨论。
所述酶还可以吸附在表面上，例如，使用戊二醛将蛋白质交联至牛血清白蛋白(BSA)的层上。选择性地，可以使用本领域公知的特定交联子来吸附这些酶，例如生物素、羧基或氨基基团。
本发明中，RP电沉积在电极表面，然后在RP层上生成含有生物材料的基质层。RP基本上不受此影响。可以根据在WO 2004/048603中描述的方法来生成所述基质层，该申请的全文在此一并引入作为参考。
在RP上生成最佳的基质层优选使用负电位。所述层还可以趋电位地生成或在预设的阴极电流下生成。
优选地，所述基质为溶胶凝胶层。然而，所述基质层还可以包括水凝胶、聚乙烯、聚丙烯酰胺、聚吡咯和糖衍生的聚吡咯。
溶胶凝胶是指一种溶胶颗粒的胶状悬浮液，它可以胶化形成固体。所述溶胶是由在凝胶化之前分散在流体(液体)中的胶体颗粒制成的。典型地，胶体颗粒的直径为1-100nm。
所述溶胶凝胶层优选包括含硅化合物的溶胶，例如，所述含硅化合物可以为硅酸脂或硅烷(如烷氧硅烷)、氧化铝、氧化陶瓷溶胶或胶体金属氢氧化物。
US 6303290公开了一种可以与酸化的盐溶液混合的陶瓷氧化物胶体溶胶。添加氢氧化物来调高pH，从而引发了溶胶凝胶的形成。通过本发明的方法，替代氢氧化物可以允许溶胶凝胶在衬底上电沉积。
因此，所述溶胶优选为陶瓷氧化物溶胶，例如，氧化钛。
还可以使用氧化锆陶瓷作为溶胶。Gheorghies C.等(Analele Stiintifice AleUniversitatii，Tomul XLV-XLVI，s.Fizica Starii Condensate(1999-2000)pages268-275)公开了氧化锆溶胶凝胶的阴极沉积物。使用电流来产生能够引发膜沉积的氢氧化物离子。优选的酸化溶胶为ZrO(NO3)。
选择性地，所述溶胶凝胶的层可以包括具有聚合物的水凝胶基质，例如，所述聚合物可以为聚乙烯、聚丙烯酰胺或聚吡咯基聚合物、或糖衍生的聚吡咯、以及它们的衍生物。
优选的溶胶为硅烷。优选具有以下通式
或(R9O)3-Si-CH2-CH2-Si-(OR9)3 其中 R1＝直链的、支链的、环状的、非环状的、饱和的或不饱和的、取代的或未取代的烃基；取代的或未取代的芳基；-NR5；或-COR6；所述烃基具有1、2、3、4、5或6个碳原子； R2、R3和R4独立地选自直链的、支链的、环状的、非环状的、饱和的或不饱和的烃基；-COR6；-O-烃基；-O-COR6；-R7R8；R7N(R6)2以及R7NHR6R8；优选具有1、2、3、4、5或6个碳原子； R5＝支链的或非支链的、环状或非环状的、饱和的或不饱和的烃基；或苯甲基，所述烃基优选具有1、2、3、4、5或6个碳原子； R6＝C1-C3的烃基； R7＝C1-C6烃基，尤其是C1烃基、C2烃基或C3烃基； R8＝环氧基、-NH2或-SH；尤其是
或
R9＝直链的或支链的C1-C6烃基，尤其是C1烃基、C2烃基或C3烃基。
优选地，R1为甲基、乙基、丙基、-NCHCH2CH3、-NC(CH3)CH2CH3、-NC(CH3)CH2CH(CH3)2、-COCH3或
以及，R2、R3和R4各自独立地为甲基、乙基、丙基、-O-甲基、-O-乙基、-O-丙基、-CHCH2，、苯甲基、-OCOCH3、或氨基烃基。优选地，所述氨基烃基为氨基丙基，特别是3氨基丙基。
优选的硅烷选自 四甲氧基硅烷(TMOS)、四乙氧基硅烷(TEOS)、四丙氧基硅烷、甲基三甲氧基硅烷、甲基三乙氧基硅烷、甲基三(甲基乙基酮肟)硅烷(MOS)、甲基三(丙酮肟)硅烷、二甲基二(甲基乙基酮肟)硅烷、三甲基(甲基乙基酮肟)硅烷、乙烯基三(甲基乙基酮肟)硅烷(VOS)、甲基三(甲基异丁基酮肟)硅烷、甲基乙烯基二(甲基乙基酮肟)硅烷、甲基乙烯基二(环己酮肟)硅烷、乙烯基三(甲基异丁基酮肟)硅烷、苯基三(甲基乙基酮肟)硅烷(POS)、甲基三乙酰氧基硅烷和四乙酰氧基硅烷。
优选地 R1＝-CH3，R2＝-OCH3，R3＝-OCH3，
R1＝-CH3，R2＝-OCH3，R3＝-OCH3，R4＝-(CH2)3NH2(APTMOS)； R1＝-CH2CH3，R2＝-OCH2CH3，R3＝-O-CH2CH3，R4＝-(CH2)3NH2(APTEOS)； R1＝-CH3，R2＝-OCH3，R3＝-OCH3，R4＝-(CH2)3SH(MPTMOS)； R9＝乙基(二-TEOS)；或R9＝甲基(二-TMOS)。
所述硅烷最优选为四甲氧基硅烷(TMOS)。
这种硅烷为本领域技术人员所公知并且可以商购得到。可以使用两种或两种以上的硅烷。
优选添加硅烷偶联剂。这种偶联剂含有反应基团，例如，氨基、巯基、氧基、丙烯酸酯基、乙烯基、或氯。这些可以被加入到酸化的溶胶悬浮液或中性的溶胶悬浮液中。这可以改善膜的稳定性。优选的偶联剂包括 3-氨基丙基二甲基甲氧基硅烷(MMS) 氨基丙基三乙氧基硅烷 氨基丙基三甲氧基硅烷 氨基丙基甲基二乙氧基硅烷 氨基丙基甲基二甲氧基硅烷 氨基乙基氨基丙基三甲氧基硅烷 氨基乙基氨基丙基三乙氧基硅烷 氨基乙基氨基丙基甲基二甲氧基硅烷 二乙烯基三氨基丙基三甲氧基硅烷 二乙烯基三氨基丙基三乙氧基硅烷 二乙烯基三氨基丙基甲基二甲氧基硅烷 二乙烯基三氨基丙基甲基二乙氧基硅烷 环己基氨基丙基三甲氧基硅烷 己烷基二氨基甲基二乙氧基硅烷 苯胺基甲基三甲氧基硅烷 苯胺基甲基三乙氧基硅烷 二乙基氨基氨基甲基三乙氧基硅烷 (二乙基氨基甲基)甲基二乙氧基硅烷 甲基氨基丙基三甲氧基硅烷 二(三乙氧基甲硅烷基丙基)四硫化物 二(三乙氧基甲硅烷基丙基)二硫化物 巯基丙基三甲氧基硅烷 巯基丙基三乙氧基硅烷 巯基丙基甲基二甲氧基硅烷 3-氰硫基丙基三乙氧基硅烷 甘油内醚基氧基丙基三甲氧基硅烷 甘油内醚基氧基丙基三乙氧基硅烷 甘油内醚基氧基丙基二乙氧基硅烷 甘油内醚基氧基丙基二甲氧基硅烷 甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷 甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷 甲基丙烯酰氧基丙基甲基二甲氧基硅烷 氯丙基三甲氧基硅烷 氯丙基三乙氧基硅烷 氯甲基三乙氧基硅烷 氯甲基三甲氧基硅烷 二氯甲基三乙氧基硅烷 乙烯基三甲氧基硅烷 乙烯基三乙氧基硅烷 乙烯基三(2-甲氧基乙氧基)硅烷 三甲氧基甲硅烷基氨基丙基氨基乙基三乙酸- (MeO)3SiCH2CH2CH2N(CH2COOH)CH2CH2N(CH2COOH)2 发现MMS尤其适用于腺苷传感器并且能够阻止所述基质的密度变得过大。因此，优选使用这种传感器。
优选使用的电位为约-900至-1500mV，尤其是约-900至-1200mV。根据需要的溶胶凝胶的厚度，所述电位可以施用约10-120秒，尤其是约20-60秒，更优选为约20-40秒。
优选的偶联剂为3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMOS)。
还可以优选将缩水甘油基丙基三甲氧基硅烷加入到中性的溶胶悬浮液中。
所述硅烷偶联剂优选包括一种或多种，尤其是两种或两种以上的反应基团，例如能够交联硅烷分子的氨基。
最初的结果显示含有硫醇的硅烷(如MPTMOS)的存在改善了由这种技术制备的生物传感器的敏感性，例如，通过降低生物传感器对分析混合物中的污染物的敏感性。这还能够改善生物传感器的储存稳定性。
最初的结果还显示，添加双官能硅烷(如双-TEOS或双TMOS)能够改善所述生物传感器的稳定性和机械强度。
因此，优选由包括具有巯基的硅烷和/或双功能硅烷的混合物得到溶胶凝胶。
本发明人发现，通过添加一种或多种稳定剂(如多羟基醇)能够使所述溶胶凝胶稳定。所述稳定剂的例子包括甘油、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇；多糖，如葡聚糖和壳聚糖；聚烯基亚胺；糖，如甘露糖醇、葡萄糖酸酯、葡萄糖酸内酯、海藻糖、拉克替醇(lactitol)或蔗糖、以及苯扎氯铵(benzylalkonium chloride)(BAC)。
还可以添加聚乙烯亚胺(PEI)。
任选地，根据本发明的生物传感器还可包括另一个基质层，并且在可以含有生物材料的基质层的顶部可以任选地不含有任何生物材料。
两种或两种以上的生物材料(如酶)可以联级使用，这些酶可以混合使用并且可以在同一时间施用。选择性地，它们可以被设置在不同的层上。第一层通过接通电极电位以形成基质的第一层。所述导电衬底放到含有第二酶的第二中性基质悬浮液中，并且通过再次接通电极电位来设置第二基质层。第二悬浮液中使用的基质可以与第一悬浮液相同或不同。
通常，在生物传感器的研发中，稳定性、选择性和敏感性是重要的因素。pH稳定性显示在图3的插图中，RP改性的生物传感器还显示出在连续检测的实验中对基质的稳定应答。图6显示出典型的次黄嘌呤传感器对加入10μM的次黄嘌呤溶液的FIA应答。在1个小时的检测过程中，该生物传感器对次黄嘌呤显示出稳定的、可重复的应答。
正如本领域所公知的，被包埋在生物传感器的基质层中的生物材料的活性并不损失。这归功于溶胶凝胶型基质的硬度和多孔性质。相应的，在长期的储存中，RP改性的生物传感器的外基质层中的生物材料的活性并不受RP层的影响。
可以使用血浆来检测所述生物传感器的选择性。图7显示了RP改性的生物传感器对ATP(40μM)、血浆、以及血浆与ATP(40μM)的混合物的安培应答。还可以看出，血浆几乎不对RP改性的生物传感器产生任何的干扰信号，说明在较低的操作电位上消除了干扰。因此，本发明的RP改性的生物传感器还显示出优良的选择性。
在常规的生物传感器中，由于血浆组分(如尿酸盐和抗坏血酸盐)在生物传感器中产生较大的应答，因此血浆干扰了对被检测物质的分析。使用本发明的生物传感器，极大地减少了由于提高了选择性而产生的应答。相似地，1mM的极端反应性邻苯二酚仅产生位于背景和标准水平之间的应答，并且该应答显著地小于得自目标物质的应答。
此外，RP的电化学行为基本不受到支持电解质的pH值的影响。如图3的循环伏安图谱中所示，在图中峰I和II的位置并不随pH的改变而显著变化。然而，PB改性的生物传感器的稳定性和活性则受到碱性pH值的严重影响，这限制了它们仅能够在中性和酸性溶液中使用。
图8中描述了次黄嘌呤生物传感器在具有不同的次黄嘌呤浓度的磷酸盐缓冲液中得到的时间-安培曲线，插图中显示出扩大的选择性。从该曲线中得到了次黄嘌呤传感器得334.17nA μM-1 cm-2的敏感性。
图9显示了电流与典型的ATP生物传感器的校准ATP浓度的曲线图，插图中显示出在操作电位0mV vs.Ag/AgCl处对ATP(40μM)产生典型的生物传感器应答。观察到清晰强烈的针对ATP的应答。
本发明另一方面还提供了一种制备本发明生物传感器的方法，该方法包括 提供导电衬底，该导电衬底包括铂或铂合金、金或金合金、或碳；以及 在所述导电衬底上沉积 (i)形成在所述衬底上的第一层，该第一层包括钌视紫质； (ii)形成在所述第一层上的第二层，该第二层包括聚苯胺或具有一个或多个非极性取代基的聚苯胺衍生物；以及 (iii)形成在所述第二层上的第三层，该第三层一种或多种酶，该一种或多种酶被包埋在基质中或吸附在第二层上。
优选地，该方法还包括加热和电化学循环的步骤。优选进行多于约20个循环，更优选多于约30个循环，最优选为约40个循环。所述循环过后优选在以下温度下加热一段时间(例如，过夜)，优选在约高于50℃下，更优选在约高于60℃下，进一步优选为约高于70℃下，最优选为至多约80℃。
优选地，第二层被至少部分地氧化，例如，在+1.3V附近循环4-7个循环。
所述衬底、聚苯胺或聚苯胺衍生物、基质和生物材料如本发明第一方面所述。
本发明的方法是非常可控的，在每个时间点的电沉积过程得到的层基本上是一致的。图1显示了监控RP在金电极上的生成的典型的循环伏安图谱。
另外，RP的使用使得能够使用特别小的生物传感器。尤其是，可以使用直径大约为50μm且长度约为0.1-2mm的生物传感器，优选直径小于25μm且长度约为300μm至2mm的生物传感器。
本发明的生物传感器的操作稳定性处于几小时的区间之内，这对于需要进行的检测试验来说是足够的。
根据本发明的另一个方面，所述生物传感器可以用作胎儿监护装置的部件。
如上所述，监控次黄嘌呤水平的能力提供了对分娩期间胎儿的供氧水平的指示以及对是否需要剖腹产手术的指示。本发明的生物传感器可以用于对胎儿还在子宫内时从胎儿头皮采到的血滴进行检测。在这种情况下选择的基质中的酶为能够代谢次黄嘌呤的酶，如黄嘌呤氧化酶，由此，指示出了胎儿血液中的量。
与现有的用于检测次黄嘌呤的(例如需要对pH变化为0.05进行鉴定的血液pH值检测)相比，本发明的生物传感器需要更少的细调，因此，本发明的生物传感器比现有的检测更加可靠。
所述生物传感器在检测化学物质(例如嘌呤，如次黄嘌呤、ATP、腺苷和/或肌苷)中的应用也包括在本发明的范围内。检测组织内或体液内化学物质(如嘌呤或嘌呤衍生物)的量的方法包括在体内或体外将本发明的生物传感器暴露于组织样品中，并且还提供了对由所述生物传感器产生的电流所进行的检测。优选地，所述组织为血液、脑、粗糙或平滑肌肉、或心脏组织。所述体液可以为唾液或尿液。
本发明另一方面提供了一种试剂盒，该试剂盒包括本发明所述的用于检测化学物质(如嘌呤或嘌呤衍生物)的存在或浓度的生物传感器。所述试剂盒可以包括用于记录生物传感器与标准电极相比所产生的电流的装置，还可包括用于将所述电流转换成指示待分析化学物质(嘌呤或嘌呤衍生物)的存在和/或浓度的指示的装置。所述试剂盒可以用于检测一种或多种化学物质，例如，嘌呤(如次黄嘌呤、腺苷、ATP和/或肌苷)。
选择性地，所述生物传感器可以被合并入更大的家用生物传感器中，以对患者的唾液、血液或尿液中的分析物(如嘌呤或嘌呤衍生物)进行监控。
下面以举例的方式并参考以下附图和实施例对本发明进行描述，这些附图和实施例仅起到说明的目的，并不用于限制本发明的范围。
图1显示了RP(钌视紫质)层在金电极上的生成。
图2显示了RP改性的电极在0.1M的磷酸钠缓冲液中的循环伏安图谱。
图3显示了RP改性的生物传感器在不同pH的磷酸盐缓冲液中的循环伏安图谱，插图中显示了Na+离子浓度和pH值在减小峰II的峰电位中的效果。
图4显示了次黄嘌呤(10μM)在不具有聚苯胺膜的RP改性的次黄嘌呤生物传感器上的流动注射分析(FIA)应答。施用电位-50mV(与Ag/AgCl相比)；支持电解质为pH7.4的磷酸盐缓冲液。
图5显示了在10μM的H2O2中连续检测1小时之前(实线)或之后(划线)，不具有聚苯胺膜的RP改性的生物传感器的循环伏安图谱(A)和涂敷有聚苯胺膜的RP改性的生物传感器的循环伏安图谱(B)的对比。
图6显示了RP和聚苯胺改性的次黄嘌呤生物传感器对次黄嘌呤(10μM)的FIA应答。施用电位-50mV(与Ag/AgCl相比)；支持电解质为pH7.4的磷酸盐缓冲液。
图7显示了具有RP和聚苯胺的ATP生物传感器对ATP(40μM)、血浆、以及血浆+ATP(40μM)的应答。操作电位0mV(与Ag/AgCl相比)；支持电解质为pH7.4的磷酸盐缓冲液。
图8显示了在-50mV(与Ag/AgCl相比)下极化了的包括RP和聚苯胺的生物传感器在具有不同浓度的次黄嘌呤的磷酸盐缓冲液中的应答。
图9显示了典型的ATP、RP和聚苯胺生物传感器的校准。图中显示了典型的生物传感器对ATP(40μM)的FIA应答。操作电位0mV(与Ag/AgCl相比)；支持电解质为pH7.4的磷酸盐缓冲液。
图10通过在酸性溶液中在扫描速率为100mV/s的条件下从-0.2V到1.3V(与AgCl相比)的扫描，显示了聚苯胺在金电极表面的涂敷。
实施例 设备 使用CHl 660B恒电位器来电化学沉积不同的聚合物并对生物传感器进行检测。使用通过A-D转换器(数据转换)与PC相连的恒电位器，在体内使用所述生物传感器。在所有的情况下，使用Ag/AgCl作为参比电极和Pt对电极。用于沉积的电化学电池由直径为1.5mm长度为2cm的毛细管组成。
RP在金电极表面的电极沉积 在三个电极系统中，将预处理的金工作电极浸渍在混合物(FeCl3(1mM)+KCl(40mM，pH 2)和K4Ru(CN)6(1mM)+KCl(40mM，pH 2)中，并随后在-0.2至+0.7V(与Ag/AgCl相比)的范围内以50mV/s循环四十个循环(图1)。将得到的RP改性的电极在80℃下过夜加热。为了使RP膜稳定，在RuCl3溶液中进行电化学循环。
使用10μm的苯胺+0.5M的H2SO4+0.5M的KCl，并在-0.2至+1.3V之间以100mV/s进行7个循环，形成聚苯胺。图10显示了聚苯胺的沉积。
溶胶凝胶层在RP改性的金电极上的电极沉积 预水解的硅烷混合物与合适的酶一起被电极沉积至RP改性的电极表面。使用不同的硅烷前体以获得不同的溶胶混合物，并使用不同的溶胶混合物来制备不同类型的生物传感器。
用于ATP生物传感器的典型组合物包括TMOS(60μl)+APTMOS(20μl)+BISTMOS(20μl)+GOPTMOS(20μl)+Tris(100μl)+甘油(100μl)+PEG(100μl)+PEI(100μl)+KCl(50μl)。
然而，对于腺苷和次黄嘌呤生物传感器，典型的组合物包括TMOS(60μl)+APTMOS(20μl)+BISTMOS(20μl)+GOPTMOS(20μl)+MMS(20μl)+Tris(100μl)+甘油(100μl)+PEG(100μl)+PEI(100μl)+KCl(60μl)+Ca(NO3)2(100μl)+BAC(10μl)。
优选通过在-0.9至+1.3V或6-8μA下电极沉积30秒，来包埋凝胶层。
次黄嘌呤生物传感器利用的酶为黄嘌呤氧化酶。ATP生物传感器利用甘油激酶和甘油-3-磷酸酯氧化酶的组合。
每微升组合物典型地使用0.1-0.5个单位的酶。
生物传感器的形成 与溶胶凝胶层在裸的金或铂电极表面的电极沉积相比，溶胶凝胶层在RP改性的金电极的聚苯胺层表面上的电极沉积更加困难。然而，最有效的方法是调节操作电位(恒电位法)或电流密度(趋电位法)。典型地，所述生物分子能够通过在约-0.9至-1.3V或约6-8μA的条件下电极沉积10-30秒而被包埋到凝胶层中。
在所述传感器中加入聚苯胺的作用在附图中已经清楚地得到了证明。显示出，聚苯胺改善了生物传感器。
权利要求
1、一种生物传感器，该生物传感器包括
(i)导电衬底；
(ii)位于所述衬底上的第一层，该第一层包括钌视紫质；
(iii)位于所述第一层上的第二层，该第二层包括聚苯胺或具有一个或多个非极性取代基的聚苯胺衍生物；以及
(iv)位于所述第二层上的第三层，该第三层包括一种或多种酶，该一种或多种酶优选被包埋在基质中或吸附在所述第二层上。
2、根据权利要求1所述的生物传感器，其中，位于所述聚苯胺衍生物上的所述非极性取代基包括一个或多个烃基链和/或醚基团。
3、根据权利要求2所述的生物传感器，其中，位于所述聚苯胺衍生物上的所述非极性取代基选自C1-C12烃基链和/或包括C1-C12烃基链的醚基团。
4、根据前述任意一项权利要求所述的生物传感器，其中，包括所述基质的层为溶胶凝胶层。
5、根据权利要求4所述的生物传感器，其中，所述溶胶凝胶层包括一种或多种硅基化合物、氧化铝、氧化物陶瓷、胶状金属氢氧化物。
6、根据权利要求1-4中的任意一项所述的生物传感器，其中，所述基质的层包括水凝胶、聚乙烯、聚丙烯酰胺、聚吡咯、或糖衍生的聚吡咯。
7、根据权利要求1-5中的任意一项所述的生物传感器，其中，所述基质的层包括选自具有以下通式的硅酸酯或硅烷中的一种或多种化合物
或(R9O)3-Si-CH2-CH2-Si-(OR9)3
其中
R1＝直链的、支链的、环状的、非环状的、饱和的或不饱和的、取代的或未取代的烃基，该烃基优选具有1、2、3、4、5或6个碳原子；取代的或未取代的芳基；-NR5；或者-COR6；
R2、R3和R4独立地选自直链的、支链的、环状的、非环状的、饱和的或不饱和的烃基；-COR6；-O-烃基；-O-COR6；-R7R8；R7N(R6)2；以及R7NHR6R8；优选为氨基烃基；其中，所述烃基优选具有1、2、3、4、5或6个碳原子；
R5＝支链的或非支链的、环状或非环状的、饱和的或不饱和的烃基，该烃基优选具有1、2、3、4、5或6个碳原子；或苯甲基；
R6＝C1-C3的烃基；
R7＝C1-C6烃基，尤其是C1烃基、C2烃基或C3烃基；
R8＝环氧基、-NH2或-SH；尤其是-CH2-CH2或-CH2CH2CH2
R9＝直链的或支链的C1-C6烃基，尤其是C1烃基、C2烃基或C3烃基。
8、根据权利要求7所述的生物传感器，其中，R1为甲基、乙基、丙基、-NCHCH2CH3、-NC(CH3)CH2CH3、-NC(CH3)CH2CH(CH3)2、-COCH3或
以及，R2、R3和R4各自独立地为甲基、乙基、丙基、-O-甲基、-O-乙基、-O-丙基、-CHCH2、苯甲基或-OCOCH3。
9、根据前述任意一项权利要求所述的生物传感器，其中，该生物传感器还包括位于基质的层中的硅烷偶联剂。
10、根据前述任意一项权利要求所述的生物传感器，其中，一种或多种生物材料包括所述一种或多种酶。
11、根据前述任意一项权利要求所述的生物传感器，其中，所述一种或多种酶能够实现对嘌呤及嘌呤衍生物的检测。
12、根据权利要求11所述的生物传感器，其中，所述嘌呤及嘌呤衍生物选自次黄嘌呤、腺苷、三磷酸腺苷和/或肌苷。
13、根据前述任意一项权利要求所述的生物传感器，其中，所述一种或多种酶选自黄嘌呤氧化酶、核苷磷酸化酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸酯氧化酶和/或腺苷脱氨酶。
14、根据前述任意一项权利要求所述的生物传感器，其中，所述导电衬底包括铂或铂合金、金或金合金。
15、根据权利要求14所述的生物传感器，其中，所述导电衬底包括铂或铂-铟合金、金或金合金。
16、权利要求1-15中的任意一项权利要求所述的生物传感器的制备方法，其中，该方法包括
提供导电衬底，该导电衬底优选包括铂或铂合金、金或金合金、或碳；以及
在所述导电衬底上沉积
(i)形成在所述导电衬底上的第一层，该第一层包括钌视紫质；
(ii)形成在所述第一层上的第二层，该第二层包括聚苯胺或具有一个或多个非极性取代基的聚苯胺衍生物；以及
(iii)形成在所述第二层上的第三层，该第三层包括一种或多种酶，该一种或多种酶优选被包埋在基质中或吸附在第二层上。
17、根据权利要求16所述的方法，其中，该方法还包括对含有钌视紫质的层进行电化学循环和/或加热。
18、根据权利要求17所述的方法，其中，进行多于约20个循环和/或使钌视紫质被加热至高于约50℃。
19、根据权利要求18所述的方法，其中，进行约40个循环和/或使钌视紫质被加热至约80℃。
20、权利要求1-15中的任意一项所述的生物传感器在检测一种或多种分析物中的应用。
21、根据权利要求20所述的应用，其中，所述分析物为嘌呤和嘌呤的衍生物。
22、根据权利要求21所述的应用，其中，所述嘌呤和嘌呤衍生物选自次黄嘌呤、腺苷、三磷酸腺苷和/或肌苷。
23、一种胎儿监护装置，该胎儿监护装置包括权利要求1-15中的任意一项所述的生物传感器。
24、根据权利要求23所述的胎儿监护装置，其中，该装置用于检测未出生的小孩体内的次黄嘌呤。
25、一种用于对分析物进行检测的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1-15中的任意一项所述的生物传感器，所述分析物包括嘌呤或嘌呤衍生物。
26、一种如此处所描述的并在附图中说明的生物传感器。
全文摘要
本发明涉及一种生物传感器，该生物传感器包括导电衬底；并具有形成在所述衬底上的第一层，该第一层包括钌视紫质；形成在所述第一层上的第二层，该第二层包括聚苯胺或具有一个或多个非极性取代基的聚苯胺衍生物；以及形成在所述第二层上的第三层，该第三层包括包埋在基质中的一种或多种酶。所述生物传感器用于对分析物(例如，嘌呤和嘌呤衍生物)进行检测，尤其是用于对次黄嘌呤进行检测。
文档编号C12Q1/00GK101611151SQ200880001803
公开日2009年12月23日 申请日期2008年1月3日 优先权日2007年1月4日
发明者N·戴尔, F·田 申请人:华威大学