专利名称：生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够简单、快速和高精度地对试样中的基质进行定量的生物传感器。
作为蔗糖、葡萄糖等糖类的定量分析方法，已开发了使用光度计法、比色法、还原滴定法及各种色谱法等方法。但是，由于这些方法对糖类的特异性都不太高，所以，精度较差。在这些方法中，光度计法虽然操作较简单，但操作时受温度影响较大。所以，光度计法作为一种在一般家庭等对糖类进行简单的定量方法是不适合的。
因此，近年来利用酶所具有的特异催化剂作用的各种类型的生物传感器被开发了。
以下，作为一种对试样溶液中的基质进行定量的方法，对葡萄糖的定量法进行说明。作为电化学葡萄糖定量法，众所周知的方法是使用葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4以下略称为GOD)和氧化电极或过氧化氢电极来进行定量的方法(例如，铃木周一编《生物传感器》讲谈社)。
GOD以氧为电子传递体可选择性地将作为基质的β-D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖-δ-内酯。在氧存在下GOD进行的氧化反应过程中，氧被还原为过氧化氢。利用氧电极，可测定氧的减少量，或者利用过氧化氢电极能够测定过氧化氢的增加量。由于氧的减少量及过氧化氢的增加量与试样溶液中的葡萄糖含量呈正比，所以，根据氧的减少量或过氧化氢的增加量能够对葡萄糖进行定量。
上述方法虽然能够在反应过程中推测出结果，但其欠缺点是结果受试样溶液中含氧浓度的影响很大，如果试样溶液中不含氧，则不能够进行测定。
因此，开发了不是以氧为电子传递体，而是以铁氰化钾、二茂铁衍生物、苯醌衍生物等有机化合物和金属络合物作为电子传递体的新型葡萄糖传感器。该类型的传感器使酶反应产生的电子传递体的还原体在电极上氧化，通过氧化电流量求得试样溶液中所含葡萄糖的浓度。用上述有机化合物和金属络合物代替氧作为电子传递体使用时，可以使已知量的GOD和这些电子传递体在稳定状态下正确地负载在电极上，并能够形成试药层。此时，试药层能够在接近干燥的状态下与电极系统合为一体。以此技术为基础的一次性葡萄糖传感器近年来正倍受瞩目。这种一次性葡萄糖传感器，只要在与测定器装卸连接方便的传感器中导入试样溶液，就能够容易地用测定器对葡萄糖浓度进行测定。该方法不仅可对葡萄糖进行定量，还能够对试样溶液中的其它基质进行定量。
用上述传感器进行测定时，还原型电子传递体在工作电极上氧化，利用此时的氧化电流值能够求得基质浓度。但是，在测定血液和果汁等试样时，因这些试样中含有抗坏血酸、尿酸等易氧化性物质，可与还原型电子传递体同时在工作电极上被氧化。所以有时这些易氧化性物质的氧化反应会对测定结果产生影响。
在使用上述传感器进行测定时，形成试药层的电子传递体在被还原的同时，还进行了作为电子传递体的溶存氧生成了过氧化氢的反应。而且，这一反应中生成的过氧化氢使还原型电子传递体再被氧化。其结果是，基于还原型电子传递体的氧化电流对基质浓度进行测定时，有时会出现溶存氧使测定结果产生负误差的情况。
为了解决上述问题，本发明提供了一种生物传感器，该生物传感器具备以下3部分，即电绝缘性基板，具有形成于前述基板的工作电极、配极及作为检测杂质的电极的第3电极的电极系统，以及至少含有氧化还原酶和电子传递体的试药层。第3电极被设置在工作电极或配极的任一方的对面，或两者的对面，前述试药层被设置在除第3电极以外的规定位置上。
试药层和第3电极的位置关系是一般在试样溶液供给通道中，试药层设置在第3电极的下游。但是，如果试样溶液在试药溶解前提供给传感器时，即溶解试药，将含有因酶反应而被还原的电子传递体的试样溶液传递到第3电极前，此时第3电极中的试样溶液不含有前述被还原的电子传递体，如果试样溶液含有氧化物质，并利用氧化电流能够对此氧化物质进行测定，则在这种情况下试药层不一定非设置在第3电极的下游。
以卵磷脂为主成分的层设置在与前述第3电极不相连的位置，最好是设置在与试药层相连接的位置。
另外，前述试药层中最好还含有亲水性高分子。
图1为本发明的一个实施例中的葡萄糖传感器在除去了试药层后的分解斜视图。
图2为本发明的另一实施例中的葡萄糖传感器在除去了试药层后的分解斜视图。
图3为本发明的其它实施例中的葡萄糖传感器在除去了试药层后的分解斜视图。
本发明的生物传感器具备包含了工作电极和配极的电极系统，含有氧化还原酶和电子传递体的试药层，以及支承上述两个部分的电绝缘性基板。是对使在上述试药层中加入试样溶液而发生的酶反应所产生的还原型电子传递体在工作电极上氧化，由此时的氧化电流值求得基质浓度的生物传感器进行改良后的产品。另外，附加了作为检测杂质的电极的第3电极，该第3电极设置在工作电极或配极的至少一方的对面，而且，试药层被设置在与第3电极不相连的规定位置上。
本发明理想的状态是生物传感器由电绝缘性基板，夹在基板间的形成试样溶液供给通道的电绝缘性覆盖部件，以及暴露在试样溶液供给通道中形成于基板或覆盖部件之间的电极系统及试药层构成。试样溶液供给通道内的第3电极位于工作电极及配极的至少一方的对面，而且，试药层被设置在与第3电极不接触的位置。
本发明的另一较理想的状态是前述覆盖部件由绝缘性基板和可形成试样溶液供给通道的具有槽的间隔层构成。即，传感器由2块电绝缘性基板和间隔层构成。具备该结构的实施例1中，在一块基板上设置了工作电极和配极，在另一块基板上设置了第3电极。实施例2中，在一块基板上设置了工作电极，在另一块基板上设置了配极和第3电极。实施例3中，在一块基板上设置了工作电极和第3电极，在另一块基板上设置了配极。上述实施例1和2中，试药层在具备工作电极的基板上形成，实施例3中，试药层在设置了配极的基板上形成。
试药层最好与第3电极对面的电极相连。但是，由于在试样溶液供给通道中，试药层能溶于供给的试样溶液中，从而导致酶反应所产生的生成物在被传递到第3电极前存在一定的时间差，所以在试药层配置时，须假设试样液已到达第3电极为好。
本发明的生物传感器中如果试样溶液中含有易氧化性物质，则试样添加后的初期阶段，即因酶反应而生成的还原型电子传递体被传递到第3电极前的阶段，第3电极和配极间可产生氧化电流，此电流只反映易氧化性物质的浓度。在经过足够的时间后，如果对工作电极和配极间的氧化电流进行测定，则会引起存在于试样中的易氧化性物质的氧化反应和因酶反应而生成的还原型电子传递体的氧化反应。所以，如果用先前测得的氧化电流值来修正后来测得的氧化电流值，就能够求得试样中基质的确切浓度。
试样溶液中如果含有溶存氧，则在添加与前述同样的试样后的初期阶段，通过在第3电极施加适当的电压，能够测得反映溶存氧浓度的氧化电流。利用由酶反应产生的还原型电子传递体在氧化时产生的氧化电流，来求得试样溶液中基质的浓度时，试样溶液中的溶存氧会使测定结果产生负误差。但是，如前所述用反映溶存氧的氧化电流值对其进行修正，就能够不受溶存氧的影响而求得确切的基质浓度。
本发明中，试药层中含有的氧化还原酶可根据试样溶液中含有的基质进行适当的选择。例如，果糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶、乙醇氧化酶、乳酸氧化酶、胆固醇氧化酶、黄嘌呤氧化酶、氨基酸氧化酶等。
电子传递体包括铁氰化钾、对苯醌、吩嗪メトサルフェ-ト、亚甲蓝、二茂铁衍生物等。作为电子传递体，可使用其中的1种或2种以上。
上述酶和电子传递体可溶于试样溶液，或者因试药层是固定在基板等上的，所以也可不溶于试样溶液。在酶和电子传递体固定的情况下，试药层中最好含有以下列举的亲水性高分子。
试药层中所含的亲水性高分子包括羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、羧甲基乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚赖氨酸等聚氨基酸、聚苯乙烯磺酸、明胶及其衍生物、丙烯酸或其盐的聚合物、甲基丙烯酸或其盐的聚合物、淀粉及其衍生物、马来酸酐或其盐的聚合物等。其中，较好的是羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、羧甲基乙基纤维素。
以下的实施例中，为检测供给的试样溶液中的抗坏血酸，或者为检测出溶存氧而在第3电极上施加了500mV或-1300mV的电压，对此施加电压并没有特别限定。此外，为了获得应答电流而在工作电极上施加500mV的电压，对此施加电压也没有特别的限定。只要能够达到使一系列反应所产生的电子传递体的还原体被氧化的电位即可。关于测定电流值的时间，也不局限于实施例中记载的特定值。
另外，用图表示了实施例中的电极系统，但电极形状、电极及导线配置、传感器部件的组装方法等都不仅限于此。
在实施例中，作为第3电极的电极材料，对碳极进行了说明，但并不仅限于此，也可使用其他导电性材料和银/氯化银电极等。
以下，参考实施例对本发明进行说明。
实施例1作为生物传感器的一个例子，对葡萄糖传感器进行说明。图1为除去了试药层的葡萄糖传感器的分解斜视图。
在绝缘性基板1上设置了工作电极2和配极4，还分别设置了与它们通电相连的导线3和5。在另一块绝缘性基板11上设置了第3电极7，还设置了与电极7通电相连的导线8。为了覆盖基板1上的工作电极2和配极4，沿配极4的外周设置了外周为圆形的试药层(图中未显示)。图中，6和9为绝缘层。
该葡萄糖传感器由2块聚对苯二甲酸乙二醇酯绝缘性基板1和11，以及夹在上述两块基板间的间隔层12构成。它们按照图1中的虚线所表示的相关位置连接构成了葡萄糖传感器。
在间隔层12上形成了构成试样溶液供给通道的槽13，另外在绝缘性基板11上形成了气孔10。间隔层12夹在两基板1和11间，层叠相连，两基板1、11和间隔层12形成了试样溶液供给通道的空间部分(图中未显示)。在该空间部分中槽的开口端14是起始端，它是试样溶液供给的通道口，而终端部分与气孔10连通。
基板11和间隔层12组合在一起相当于上述覆盖部件。本实施例是由2个部件构成的，也可以仅由设置了相当于间隔层12的槽13那样的沟槽的部件来构成。
按照以下步骤可制得上述葡萄糖传感器。
利用网版印刷法在聚对苯二甲酸乙二醇酯形成的绝缘性基板上涂上含银糊状物，分别形成导线端3和5。在另一绝缘性基板11上也涂上含银糊状物，形成导线端8。然后，在绝缘性基板1上涂上含有树脂粘合剂的导电性碳糊，形成工作电极2。同样，在另一绝缘性基板11上形成第3电极7。工作电极2和第3电极7分别与导线端3和8通电接触。
接着，在绝缘性基板1和11上涂上绝缘性糊状物，分别形成绝缘层6和9。绝缘层6和9分别覆盖工作电极2和第3电极7的外周部，这样就可确保工作电极2和第3电极7露出部分的面积一定。绝缘层6和9分别覆盖一部分导线端3、5和8。
然后，在绝缘性基板1上涂上含有树脂粘合剂的导电性碳糊，形成配极4。配极4与导线端5通电接触。
接着，在工作电极2和配极4上滴下含有作为酶的GOD和作为电子传递体的铁氰化钾的水溶液，干燥后形成试药层。
为使试样溶液能够更顺利地提供给试药层，可从试样溶液供给口14开始在试药层上涂上卵磷脂的有机溶剂溶液，例如甲苯溶液，干燥后形成卵磷脂层。
但是，如果卵磷脂层与第3电极7接触，则应答的误差就较大。这是因为卵磷脂层给第3电极7表面带来变化，所以，就导致了上述情况的发生。
然后，按照图1所示的点划线位置，连接两基板1、11及间隔层12，便制得了葡萄糖传感器。
第3电极7与工作电极2和配极4设置在同一平面上时，第3电极7的一部分被试药层覆盖，有时会给测定结果带来误差。但是，在上述传感器中由于第3电极7是与工作电极2及配极4对向设置的，所以，因上述试药层的形成而引起的测定误差会大幅度减小。
将上述传感器装在专用测定器上，以配极4为基准，在第3电极7上施加500mV的电压，在施加了该电压的状态下，从试样溶液供给口14导入3μl含有抗坏血酸杂质的葡萄糖水溶液。该试样溶液经过空间部分到达气孔10，并溶解电极系统上的试药层。
在供给试样溶液的同时，根据第3电极7和配极4之间的电变化，即根据试样溶液引起的前述两电极间的盐桥，可启动溶液供给的检测系统，使测定定时器开始工作。此时，继续在第3电极7和配极4间施加电压，检测试样溶液的供给后，再经过一定时间，测定第3电极7和配极4间的电流值。该电流值会引起作为杂质的抗坏血酸的氧化反应，并与其浓度呈比例关系。测定第3电极7和配极4间的电流值之后，解除施加在两电极间的电压。
如上所述，第3电极7设置在工作电极2和配极4的对面，第3电极7上未配置试药层。因此，酶反应生成的亚铁氰化离子在到达第3电极7附近时需要一定的时间。即，在亚铁氰化离子到达第3电极7附近的这段时间内，第3电极7和配极4间的电流值主要只反映抗坏血酸的浓度。
检测试样溶液的供给后再过25秒钟，以配极4为基准对工作电极2施加500mV的电压，测定5秒钟后工作电极2和配极4间的电流值。
溶解了试药层的试样溶液中的铁氰化离子、葡萄糖及GOD进行反应后产生的结果是，葡萄糖被氧化成葡萄糖酸内酯，铁氰化离子被还原成亚铁氰化离子。该亚铁氰化离子的浓度与葡萄糖浓度呈比例。检测试样溶液的供给后再过30秒钟，工作电极2和配极4间的电流会引起亚铁氰化离子和预先存在的抗坏血酸的氧化反应。即，抗坏血酸会给测定结果带来正误差。但是，如上所述，第3电极7和配极4间的电流值主要只反映抗坏血酸的浓度。因此，以此为基准对测定结果进行修正，能够除去抗坏血酸带来的影响，求得正确的葡萄糖浓度。
实施例2除了试药层中含有羧甲基纤维素(以下略称为CMC)之外，其他操作与实施例1相同，制得葡萄糖传感器。进行与实施例1相同的测定。
首先，在基板1的工作电极2和配极4上滴下CMC水溶液，干燥后便形成CMC层。然后，在上述CMC层上滴下含有酶和电子传递体的混合水溶液，使CMC层溶解，在随后的干燥过程中与酶等混合形成试药层。但是，由于未进行搅拌，所以不可能形成完全的混合状态，电极系统表面只被CMC覆盖。也就是说，酶和电子传递体未与电极系统表面接触，所以，能够防止蛋白质等吸附在电极系统表面。
其结果是，传感器应答的数据误差有所减弱。
实施例3图2是除去了试药层的葡萄糖传感器的分解斜视图。
利用与实施例1同样的方法，分别在绝缘性基板1上形成工作电极2和碳层15，在另一块绝缘性基板11上形成第3电极7和配极4。然后，与实施例2同样，在工作电极2和碳层15上形成试药层和卵磷脂层。这里的碳层15没有电极功能。但是，在工作电极2周围配置碳层15，能够使试药层的形成变得容易。与实施例1同样，将两基板1、11和间隔层12组合在一起，便制得葡萄糖传感器。
接着，与实施例1同样，采用混合有抗坏血酸的葡萄糖溶液，对葡萄糖浓度进行测定.其结果是，能够除去抗坏血酸带来的影响，求得正确的葡萄糖浓度。
葡萄糖浓度在高浓度范围内(约1000mg/dl以上)的情况下，工作电极2和配极4间的电流值也有所增加。即，由于配极4上生成的副产物增多，所以，在工作电极周围设置了配极的情况下，副产物有时会影响传感器的应答。如果导入本实施例的电极装置，就可减弱这种影响。
实施例4图3是除去了试药层的葡萄糖传感器的分解斜视图。
利用与实施例1同样的方法，分别在绝缘性基板1上形成工作电极2和第3电极7，在另一块绝缘性基板11上形成配极4d。然后，与实施例2同样，在配极4d上形成试药层和卵磷脂层。与实施例1同样，将两基板1、11和间隔层12组合在一起，便制得葡萄糖传感器。
接着，与实施例1同样，采用混合有抗坏血酸的葡萄糖水溶液，对葡萄糖浓度进行测定。其结果是，能够除去抗坏血酸带来的影响，求得正确的葡萄糖浓度。
在本实施例中，配极4d的电极面积比工作电极2和第3电极7的大。而且，由于在配极4d上设置了试药层，所以，在施加电压时基准电极电压将更稳定。
利用上述效果，可减弱传感器应答的数据误差程度。
实施例5与实施例2同样，制得葡萄糖传感器。
将传感器装在专用测定器上，以配极4为基准，在第3电极7上施加-1300mV的电压。在施加此电压的状态下，从试样溶液供给口14导入3μl空气饱和状态的葡萄糖水溶液。该试样溶液经过空间部分到达气孔10，溶解电极系统上的试药层。
在供给试样溶液的同时，根据配极4和第3电极7之间的电流变化，可启动溶液供给的检测系统，使测定定时器开始工作。此时，继续在配极4和第3电极7间施加电压，检测试样溶液的供给后，再经过一定的时间，测定配极4和第3电极7间的电流值。该电流值会引起溶存氧的还原反应，在供给用氩气脱氢后的葡萄糖溶液时，上述还原电流激剧减少。测定配极4和第3电极7间的电流值之后，解除施加在两电极间的电压。
如上所述，第3电极7上未配置试药层。因此，试药层中含有的铁氰化离子到达第3电极7附近需要一定的时间。也就是说，在铁氰化离子到达第3电极7附近的这段时间内，配极4和第3电极7间的电流值主要只反映溶存氧的浓度。
在试样溶液检测后再过25秒钟，以第3电极7为基准对工作电极2施加500mV的电压，测定5秒钟后配极4和工作电极2间的电流值。
溶液中的铁氰化离子、葡萄糖及GOD进行反应后的结果是，葡萄糖被氧化成葡萄糖酸内酯，铁氰化离子被还原成亚铁氰化离子。另一方面，作为该反应的竞争反应，同时进行了以氧为电子传递体的葡萄糖酸内酯和过氧化氢的酶反应。而且，该反应中生成的过氧化氢使亚铁氰化离子再氧化为铁氰化离子。其结果是，用亚铁氰化离子的氧化电流来测定葡萄糖浓度时，溶存氧会给测定结果带来负的误差。
但是，如上所述，配极4和第3电极7间的电流值主要只反映溶存氧的浓度。因此，以此结果为基准对测定结果进行修正，能够除去溶存氧的影响，求得正确的葡萄糖浓度。
实施例6
与实施例2同样，制得葡萄糖传感器。
将传感器装在专用测定器上，以配极4为基准，在第3电极7上施加500mV的电压。在施加了此电压的状态下，从试样溶液供给口14导入3μl含有空气饱和状态的抗坏血酸的葡萄糖水溶液。该试样溶液经过空间部分到达气孔10，溶解电极系统上的试药层。
在供给试样溶液的同时，根据电极系统的配极4和第3电极7之间的电流变化，可启动溶液供给的检测系统，使测定定时器开始工作。此时，继续在配极4和第3电极7间施加电压。
在试样溶液检测后再过2秒钟，将施加在第3电极7上的电压改为-1300mV。测定电压变为-1300mV前时，和改为-1300mV3秒钟后时这两个时间点的配极4和第3电极7间的电流值。电压变为-1300mV前时的电流值主要依赖于抗坏血酸的浓度，而电压改为-1300mV3秒钟后时的电流值则主要依赖于溶存氧的浓度。
测定试样溶液供给2秒钟后和5秒钟后的配极4和第3电极7间的电流值，然后，解除施加在两电极间的电压。
试样溶液检测后再过25秒钟，以第3电极7为基准对工作电极2施加500mV的电压，测定5秒钟后配极4和工作电极2间的电流值。
如上所述，由于配极4和第3电极7间的电流值主要反映抗坏血酸和溶存氧的浓度，所以，能够根据该电流值求得上述两种物质的浓度。因此，用该结果对测定结果进行修正，能够除去抗坏血酸和溶存氧的影响，求得正确的葡萄糖浓度。
如上所述，本发明提供了对试样溶液中除基质以外的物质无不良影响的信赖性较高的生物传感器。
权利要求
1.一种生物传感器，由具有工作电极、配极及作为检测杂质的第3电极的电极系统，至少含有氧化还原酶和电子传递体的试药层，以及支承前述电极系统和试药层的电绝缘性基板构成；其特征在于，第3电极被设置在工作电极和配极的至少一方的对面，前述试药层被设置与第3电极不接触的规定位置上。
2.一种生物传感器，具备电绝缘性基板，在基板间形成试样溶液供给通道的电绝缘性覆盖部件，具有工作电极、配极及作为检测杂质的第3电极的电极系统，以及试药层；其特征在于，前述电极系统和试药层形成于基板或覆盖部件，并暴露在试样溶液供给通道中，试样溶液供给通道中的第3电极被设置在工作电极和配极的至少一方的对面，且试药层被设置在与第3电极不接触的位置上。
3.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中，以卵磷脂为主成分的层被设置在除前述第3电极以外的规定位置上。
4.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中，前述试药层中还含有亲水性高分子。
全文摘要
本发明揭示了一种可减少试样溶液中的杂质和溶存氧等的影响的信赖性较高的生物传感器。该生物传感器由具有工作电极、配极及作为检测杂质依赖的第3电极的电极系统,至少含有氧化还原酶和电子传递体的试药层,以及支承电极系统和试药层的电绝缘性基板构成。第3电极被设置在工作电极和配极的至少一方的对面,试药层被设置在与第3电极不接触的规定位置上。
文档编号G01N33/487GK1246614SQ9911805
公开日2000年3月8日 申请日期1999年8月19日 优先权日1998年8月26日
发明者池田信, 吉冈俊彦, 南海史朗 申请人:松下电器产业株式会社