专利名称：一种谷氨酰胺转胺酶高产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产谷氨酰胺转胺酶的制作方法
技术领域：
一种谷氨酰胺转胺酶高产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产谷氨酰胺转胺酶，属于生物工程技术领域，特别是一株高产谷氨酰胺转胺酶的吸水链霉菌。
背景技术：
随着人类生活水平的逐步提高，对于食品的要求也从以前的温饱型向营养型过渡。而蛋白质作为食物中最重要的成分之一，理应成为我们关注的焦点。由于许多食品蛋白质因氨基酸组成不理想，或缺乏适当的结构和构象，使得这些蛋白质缺乏良好的功能性质，如溶解性、发泡性、乳化性和乳化稳定性，同时也影响了食品本身的营养价值。对这些蛋白质进行化学修饰来改善它们的功能性质，人们曾经做过广泛的研究，但是考虑到化学试剂的安全性问题及其对食品营养可能造成的不良影响，这些方法最终未能被人们普遍接受和应用。而酶法修饰由于安全、快速、专一性强、对食品营养无破坏，而且成本低，越来越得到人们的认可。到目前为止，用酶法对蛋白质进行修饰大量集中在利用一些蛋白水解酶类对蛋白质进行局部水解，以改善它们的溶解性和发泡性，而这些是远不能够达到人们对食品品质的要求的。在这些方面，用谷氨酰胺转胺酶修饰蛋白，是开发新的蛋白质食品最有前景的方向之一谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase，EC2.3.2.13，简称TG)能够催化蛋白质分子之间或之内的酰基转移反应，通过这些催化反应，可在各种蛋白质分子之间或者之内引起共价交联，因此谷氨酰胺转胺酶在食品工业加工过程中的主要功能包括(1)对各种食品蛋白质进行改性，保护赖氨酸不发生各种化学反应，包封类脂质和脂溶性物质；(2)形成抗热和抗水薄膜，胶凝蛋白质时避免进行热处理；(3)提高弹性和持水能力；(4)改变可溶性和各种功能性质，从而生产出营养价值较高并含有人体所必需氨基酸的食品蛋白。多年来，商业化谷氨酰胺转胺酶主要从动物组织中提取，但由于其分离和纯化过程较复杂，且来源稀少，因而价格昂贵($80/U)。近年来，人们开始转向于研究利用微生物发酵来生产转谷氨酰胺转胺酶(Microbial Transglutaminase，简称MTG)，并使之应用于食品工业。经过微生物谷氨酰胺转胺酶处理后的食品，其功能性质得到了明显改善。
发明内容
本发明的目的是提供一种谷氨酰胺转胺酶高产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产谷氨酰胺转胺酶，所制备的谷氨酰胺转胺酶可作为食品工业上蛋白质交联剂使用。
本发明的技术方案，系从无锡奶牛厂土壤中分离得到的一株吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13(本研究室保藏)，已于2003年7月8日保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NOM203062。
吸水链霉菌CCTCC NOM203062的筛选方法是从奶牛厂土壤经平板菌落特征初步筛选，然后采用一级发酵逐一摇瓶培养，利用标准色带进行对比测试，选出颜色较深的部分菌株，进行酶活测定，并比较谷氨酰胺转胺酶活性大小而得到。
以标准色带进行对比测试.用微量注射器吸取100ul发酵液，置试管中，Φ8×100，加入50ul A试剂，置37℃水浴锅中反应10分钟，再加入100ul的B试剂，根据颜色的深浅与标准色带比较来判断酶活的有无和高低。
试剂A100mg的N-α-CBZ-Gln-Gly溶解于2ml 0.2moL/L的NaOH溶液中，加入0.2mol/L pH6.0的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液4ml，0.1mol/L盐酸羟胺2ml，0.01mol/L的还原型谷胱甘肽2ml，并调节pH至6.0。
试剂B3mol/L的HCL，12％三氯乙酸(TCA)，5％FeCL3按1∶1∶1混合。
取1mL酶活为2.0u/mL的发酵液，用蒸馏水分别稀释至0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0u/mL酶活梯度，然后按照上述先加A试剂反应，再加B试剂反应的操作流程，得到一系列颜色由浅到深的色带。
一个谷氨酰胺转胺酶酶活单位(1u)定义(u/mL)37℃时每分钟催化形成1μmolL-谷氨酸-γ-单羟胺酸的酶量。
采用吸水链霉菌CCTCC NOM203062为出发菌株，经种子培养和液体深层发酵制得谷氨酰胺转胺酶。
平板分离培养基(g/L)精氨酸0.83，甘油12.50，氯化钠1.0，硫酸镁0.50，琼脂15.0，土壤浸出汁200，蒸馏水800，调pH7.0；灭菌后降温至60℃时添加经无菌过滤的放线菌酮0.05，制霉菌素0.08，30℃下培养一周。
土壤浸出汁制备取300克土壤，加入1000ml蒸馏水，高压灭菌30分钟，沉淀后取上清液，过滤，置冰箱中保存。
斜面培养基(g/L)麦芽汁100(10°Be)，酵母膏5，葡萄糖5，琼脂15，pH7.0，30℃培养5天。
种子培养基(g/L)甘油20，蛋白胨20，酵母膏5，无水硫酸镁2，磷酸氢二钾2，无水磷酸二氢钾2，pH7.0，30℃，摇瓶转速200转/分，培养时间为20～24小时。
发酵培养基(g/L)甘油15～20，葡糖糖10～15，蛋白胨20～25，酵母膏5，无水硫酸镁2，磷酸氢二钾2，无水磷酸二氢钾2，碳酸钙5，pH 7.0，30℃，摇瓶转速200转/分，发酵时间为44～48小时。
本发明的有益效果提出了一种谷氨酰胺转胺酶的高产菌，用该菌株经液体深层发酵可制备谷氨酰胺转胺酶，酶活达到5.0u/ml，可作为食品工业上蛋白质交联剂使用。
生物材料样品保藏.
吸水链霉菌WSH03-13，保藏日期2003年7月8日，保藏单位名称及简称中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为NOM203062。
具体实施例方式
从斜面上刮取一环菌种，置于装有100ml种子培养基的500ml三角瓶中进行种子培养。条件为培养时间24小时，温度30℃，摇床转速200rpm。再以8％接种量接入装有50ml发酵培养基的500ml三角瓶中进行发酵培养。条件为培养时间48小时，温度30℃，摇床转速200rpm。即可得到酶活5.0u/ml的发酵液。
权利要求
1.一种谷氨酰胺转胺酶高产菌，分类命名为吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)WSH03-13，其保藏编号为CCTCC NOM203062。
2.一种吸水链霉菌CCTCC NOM203062的筛选方法，其特征是从奶牛厂土壤经平板菌落特征初步筛选，然后采用一级发酵逐一摇瓶培养，利用标准色带进行对比测试，选出颜色较深的部分菌株，进行酶活测定，并比较谷氨酰胺转胺酶活性大小而得到。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是以标准色带进行对比测试，用微量注射器吸取100ul发酵液，置试管中，Φ8×100，加入50ul A试剂，置37℃水浴锅中反应10分钟，再加入100ul的B试剂，根据颜色的深浅与标准色带比较来判断酶活的有无和高低；试剂A100mg的N-α-CBZ-Gln-Gly溶解于2ml 0.2moL/L的NaOH溶液中，加入0.2mol/L pH6.0的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液4ml，0.1mol/L盐酸羟胺2ml，0.01mol/L的还原型谷胱甘肽2ml，并调节pH至6.0；试剂B3mol/L的HCL，12％三氯乙酸(TCA)，5％FeCL3按1∶1∶1混合。
4.一种谷氨酰胺转胺酶的制备方法，其特征是采用吸水链霉菌CCTCC NOM203062为出发菌株，经种子培养和液体深层发酵制得谷氨酰胺转胺酶。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是种子培养，种子培养基(g/l)甘油20，蛋白胨20，酵母膏5，无水硫酸镁2，磷酸氢二钾2，无水磷酸二氢钾2，pH7.0；培养条件培养时间为20-24小时，温度30℃。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是液体深层发酵，发酵培养基(g/l)甘油15-20，葡萄糖10-15，蛋白胨20-25，酵母膏5，无水硫酸镁2，磷酸氢二钾2，无水磷酸二氢钾2，碳酸钙5，pH 7.0；发酵条件发酵时间44-48小时，温度30℃。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征是所制备的谷氨酰胺转胺酶酶活达到5u/ml。
8.吸水链霉菌CCTCC NOM203062发酵所制备谷氨酰胺转胺酶的应用，其特征是可用于食品工业蛋白质交联剂。
全文摘要
一种谷氨酰胺转胺酶高产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产谷氨酰胺转胺酶，属于生物工程技术领域。本发明菌种为一株吸水链霉菌(Streptomyceshygeroscopicus)CCTCC NOM203062，是从奶牛厂土壤中经平板菌落特征初筛，采用一级发酵逐一摇瓶培养，利用标准色带进行对比测试，再经酶活测定，比较谷氨酰胺转胺酶活性大小而得到。经液体深层发酵可得谷氨酰胺转胺酶，酶活5.0u/ml。该谷氨酰胺转胺酶可用于食品工业蛋白质交联剂。
文档编号C12N1/20GK1493685SQ0315295
公开日2004年5月5日 申请日期2003年9月5日 优先权日2003年9月5日
发明者陈坚, 堵国成, 柏映国, 李寅, 陈 坚 申请人:江南大学