专利名称：花生四烯酸高产菌种分离筛选方法
技术领域：
本发明属于微生物筛选技术，具体涉及合成花生四烯酸油脂的微生物分离筛选方法。
背景技术：
花生四烯酸和亚油酸、亚麻酸作为人体必需的3种脂肪酸具有多种生理功能。花生四烯酸主要存在于器官肌肉和血液组织中、与磷脂结合成结构脂类，对人体起着重要作用。花生四烯酸是许多二十碳烯酸衍生物的直接前体，包括前列腺素E2(PGE2)、前列环素(PGI2)、血栓烷素A2(TXA2)、白细胞三烯B4(LTB4)和C4(LTC4)等等。这些生物活性物质对脂蛋白的代谢、血液流变学、血管弹性、白细胞功能和血小板激活等具有重要的调节作用。花生四烯酸还具有酯化胆固醇，抑制血小板聚集、增加血管弹性、降低血液粘度、调节白细胞功能、提高免疫力等一系列生理活性。
花生四烯酸是母乳中的天然成分，是婴儿大脑和视网膜的重要组成成分，对婴儿发育非常重要。花生四烯酸在怀孕的最后三月，这种脂肪酸会沉积在胎儿的脑和视网膜上，而且其在脑和眼中的相对含量在出生后的几个月里还会继续增加，所以对处于视力发育和神经发育的婴儿格外重要。已有大量研究报告表明花生四烯酸有利于婴儿的生长，中枢神经系统的发育，视网膜的发育，智力和认知能力的发育，脉管系统发育和免疫系统发育。用补充了DHA和花生四烯酸的奶粉喂养的婴儿与用普通奶粉喂养的婴儿相比，都表现出更好的视力准确性，在解决问题的测试中表现更好，在神经发育测试中的得分更高。
在植物油中，绝大多数都不含花生四烯酸，虽然花生四烯酸广泛存在于动物体内，但来源于动物组织的花生四烯酸无论是在产量上还是在成本上都无法满足市场的需求。人们长期以来渴望获得大量成本低、花生四烯酸含量高的产品。
采用发酵法由微生物来生产花生四烯酸是一种替代性来源，已发现许多微生物都能合成花生四烯酸，其中以高山被孢霉(Mortierella alpina)最具应用前景。高山被孢霉是一种丝状真菌，它在以碳水化合物为碳源的培养基中生长时，菌体内会积累较多的油脂，其油脂的脂肪酸组成中含有丰富的多不饱和脂肪酸，尤其是花生四烯酸含量较高，被认为是最好的生产花生四烯酸油脂的菌种，并且荷兰、英国和美国FDA先后通过了野生被孢霉及其产物食用安全的认证。
红四氮唑是一种氧化剂，是脱氢酶的辅酶。红四氮唑被活细胞吸收，与脱氢酶释放的氢原子作用而被还原。我们发现菌体的红四氮唑染色程度与花生四烯酸含量具有正相关性，花生四烯酸含量高的菌株红四氮唑染色程度深。
对于花生四烯酸的生产，一株好的产生菌是至关重要的。它不仅能够利用廉价的培养基，获得高的产量，而且产物中花生四烯酸含量要高，因为这将简化后处理中的分离纯化过程。传统的花生四烯酸产生菌的筛选方法包括利用低温、阿司匹林选择性培养基来筛选，但无论采用哪种筛选方法，在分离获得大量菌株后都需要进行花生四烯酸含量的测定以寻找其中的高产菌株，这是一个非常耗时的工作，包括菌体干燥、油脂提取和气相色谱分析等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种花生四烯酸高产菌种分离筛选方法，该方法可以快速高效地筛选出花生四烯酸高产菌种。
本发明提供的一种花生四烯酸高产菌种分离筛选方法，其步骤为(1)花生四烯酸产生菌的低温分离将所采土样通过无菌水稀释后进行平板分离，在0℃-10℃培养，待长出霉菌菌落，挑出单菌落，分离纯化后保存；(2)花生四烯酸高产菌筛选(2.1)初筛将低温分离的单菌落进行液体培养5-12天，收获湿菌体，洗涤后将菌体置于容器中，加入pH7.0-9.0的0.2％-0.8％的红四氮唑溶液，放置0.5-4小时，菌体洗涤后碾磨成匀浆，再从匀浆中提取三苯基甲臜，上清液在485nm波长下比色测定吸收值确定染色程度；(2.2)复筛选取红四氮唑染色程度深的霉菌，对菌体进行干燥，提取菌体油脂进行气相色谱分析，获得花生四烯酸含量高的菌种。
由于低温下可以分离到被孢霉属被孢霉亚属真菌，而被孢霉亚属真菌可以合成花生四烯酸，而且菌体中的花生四烯酸含量与红四氮唑染色具有正相关性，因此本发明采用低温筛选与红四氮唑染色相结合的方法可以快速高效地筛选花生四烯酸高产菌。本申请人利用本发明所提出的筛选方法，获得了一株花生四烯酸高产菌株高山被孢霉Mortierella alpina M0223，其中花生四烯酸残基含量最高达到了72.8％。(本申请人已于2003年3月10日在中国科学院典型培养物保藏委员会保藏花生四烯酸高产菌株高山被孢霉，保藏编号为CGMCC No.0903)。
具体实施例方式
下述结合实例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1(1)利用低温筛选花生四烯酸产生菌取华中科技大学校园内各处土壤，混合。所采土样通过无菌水稀释，取10-2、10-3两个稀释度各涂6个平板，平板培养基为土豆培养基(PDA，20％土豆汁，2％葡萄糖，2％琼脂，pH自然)。将平板放置于4℃低温下培养，获得72株霉菌菌株。这些霉菌都具有极为相似的菌落形态，菌落表面颜色为白色，背面颜色黄色，孢子颜色白或黄。菌落初长出时很薄，圆形，然后一层层扩展，形成花瓣状(有的为玫瑰花瓣状，有的如菊花状)，并长出长长的毛状菌丝。显微镜下观察，菌丝体内有较多的油脂颗粒。所有这些霉菌都可以在4℃低温和25℃温度下生长，在25℃温度下生长较快。
选取了其中几株生长较快的菌种，进行液体培养10天，收获菌体，提取油脂，进行菌体油脂的脂肪酸分析。结果见表1。
表1 低温筛选的几株菌种及其油脂中的花生四烯酸含量花生四烯酸含量菌株编号(％)M4 42.8M10 15.6M23 42.5M25 5.7L31 30.8
L2418.5H2218.2H2532.5H2731.7(2)利用菌体的红四氮唑染色程度与菌体中花生四烯酸含量具有正相关性进行初筛将低温分离的单菌落进行液体培养7天，收获湿菌体，用蒸馏水洗涤两遍，取0.1g菌体置于有盖试管，加入2ml pH8.5的0.2％的红四氮唑(Triphenyltetrazolium chloride)溶液，25℃置于暗处放置1小时。菌体用蒸馏水洗涤两遍后碾磨成匀浆，用2ml 酸乙酯室温抽提红色的三苯基甲臜(triphenylformazan)三遍，合并抽提液，在485nm波长下用分光光度计比色测定吸收值确定染色程度。结果见表2，显示菌体的红四氮唑染色程度与菌体油脂中的花生四烯酸含量具有正相关关系。
将低温筛选的各菌株进行液体培养10天，将菌丝进行红四氮唑染色并定量染色程度，选取其中染色较深的24株菌株(结果见表3)进行下一步复筛。
表2不同菌株菌体的红四氮唑染色程度与油脂中的花生四烯酸含量关系染色程度 油脂中AA含菌株号(A485nm) 量M23 0.86139.6M10 0.32516.1M40.95545.8L31 0.47228.4(3)利用气相色谱分析方法进行复筛将染色较深的24株菌株(结果见表3)进行菌体干燥，提取菌体油脂，并进行气相色谱分析，考查各菌株的生长、产油及花生四烯酸生产能力。从该表可以看出油脂中的花生四烯酸与菌体染色程度具有正相关性，利用红四氮唑和低温相结合的方法能有效筛选花生四烯酸高产菌种。菌株M0223的油脂中花生四烯酸含量达到72.3％，花生四烯酸产量达到4.82g/l，表现出良好的花生四烯酸生产能力，该菌株经过形态特征、生理特征和核糖体18S rDNA序列鉴定为高山被孢霉(Mortierella alpina)。
表3 花生四烯酸高产菌的筛选染色程 生物量油脂含量 油脂产量 花生四烯酸 花生四烯酸产菌株号度A485 (g L-1)(％) (g L-1) 含量(％) 量(g L-1)M20.637 14.433.1 4.77 35.1 1.67M30.673 18.944.8 8.47 44.5 3.76M40.966 20.139.8 8.01 51.2 4.10M12 0.442 15.433.3 4.92 30.4 1.50M20 0.519 19.735.7 7.00 42.5 2.98M21 0.451 12.740.1 5.11 34.1 1.74M28 0.450 15.151.0 7.70 34.2 2.63M0223 1.065 19.534.2 6.67 72.3 4.82Y10.451 21.239.6 8.47 36.0 3.05Y80.624 20.541.2 8.45 41.2 3.48Y12 0.700 22.136.3 8.02 45.5 3.65H21 0.440 13.537.6 5.08 34.6 1.76H24 0.403 14.233.5 4.76 29.5 1.40H25 0.416 17.142.1 7.20 32.6 2.35H27 0.462 20.143.2 8.63 34.3 2.96L50.615 21.239.9 8.43 41.5 3.50L80.663 18.843.7 8.21 44.8 3.68L90.754 19.242.6 8.18 49.6 4.06L23 0.408 14.833.3 4.92 30.8 1.51L25 0.405 18.247.2 8.61 29.5 2.95L31 0.454 17.541.9 7.34 33.2 2.43G10.520 12.932.8 4.22 38.8 1.63W51 0.415 16.138.1 6.12 31.7 1.94实施例2(1)利用低温筛选花生四烯酸产生菌取武汉市区各处土壤，混合。所采土样通过无菌水稀释，取10-2、10-3两个稀释度各涂3个平板，平板培养基为察氏培养基(硝酸钠2g/l，磷酸氢二钾1g/l，氯化钾0.5g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸亚铁0.01g/l，葡萄糖30g/l，琼脂20g/l，pH自然)。将平板放置于10℃低温下培养，获得42株霉菌菌株。这些霉菌菌落形态与实施例1相似。
(2)利用菌体的红四氮唑染色程度与气相色谱分析方法进行筛选将分离到的单菌落进行液体培养5天，收获湿菌体，洗涤两遍，取0.1g菌体置于有盖试管，加入4ml pH9.0的0.4％的红四氮唑溶液，室温下置于暗处放置4小时。菌体用蒸馏水洗涤两遍后碾磨成匀浆，用2ml乙醇室温抽提三遍，合并抽提液，在485nm波长下用分光光度计比色测定吸收值确定染色程度。选取其中染色较深的5株菌株进行菌体干燥，提取菌体油脂，并进行气相色谱分析，考查各菌株的生长、产油及花生四烯酸生产能力，获得一株高山被孢霉Y6，其菌体油脂中花生四烯酸含量达42.5％，花生四烯酸产量为3.12g/L。
实施例3(1)利用低温筛选花生四烯酸产生菌取武汉市区各处土壤，混合。所采土样通过无菌水稀释，取10-2、10-3两个稀释度各涂3个平板，平板培养基为土豆培养基(PDA，20％土豆汁，2％葡萄糖，2％琼脂，pH自然)。将平板放置于0℃低温下培养，获得10株霉菌菌株。这些霉菌菌落形态与实施例1相似。
(2)利用菌体的红四氮唑染色程度与气相色谱分析方法进行筛选将分离到的单菌落进行液体培养12天，收获湿菌体，洗涤两遍，取0.1g菌体置于有盖试管，加入2ml pH7.0的0.8％的红四氮唑溶液，25℃置于暗处放置0.5小时。菌体用蒸馏水洗涤两遍后碾磨成匀浆，用2ml丙酮室温抽提三遍，合并抽提液，在485nm波长下用分光光度计比色测定吸收值确定染色程度。选取其中染色较深的4株菌株进行菌体干燥，提取菌体油脂，并进行气相色谱分析，考查各菌株的生长、产油及花生四烯酸生产能力，获得一株高山被孢霉M6，其菌体油脂中花生四烯酸含量达62.5％，花生四烯酸产量为4.12g/L。
权利要求
1.一种花生四烯酸高产菌种分离筛选方法，其步骤包括(1)花生四烯酸产生菌的低温分离将所采土样通过无菌水稀释进行平板分离，在0℃-10℃培养，待长出霉菌菌落，挑出单菌落，分离纯化后保存；(2)花生四烯酸高产菌筛选(2.1)初筛将低温分离的单菌落进行液体培养5-12天，收获湿菌体，洗涤后将菌体置于容器中，加入pH7.0-9.0的0.2％-0.8％的红四氮唑溶液，放置0.5-4小时，菌体洗涤后碾磨成匀浆，从匀浆中提取三苯基甲臜，上清液在485nm波长下比色测定吸收值确定染色程度；(2.2)复筛选取红四氮唑染色程度深的霉菌，对菌体进行干燥，提取菌体油脂进行气相色谱分析，获得花生四烯酸含量高的菌种。
全文摘要
本发明公开了一种花生四烯酸高产菌种分离筛选方法，其步骤为(1)产生菌的低温分离将所采土样通过无菌水稀释后进行平板分离，在0－10℃培养，待长出霉菌菌落，挑出单菌落，分离纯化后保存；(2)高产菌筛选(2.1)初筛将低温分离的单菌落进行液体培养5－12天，收获湿菌体，洗涤后将菌体置于容器中，加入pH7.0－9.0的0.2％－0.8％的红四氮唑溶液，放置0.5－4小时，菌体洗涤后碾磨成匀浆，从匀浆中提取三苯基甲臜，上清液在485nm波长下比色测定吸收值确定染色程度；(2.2)复筛选取红四氮唑染色程度深的霉菌，对菌体进行干燥，提取菌体油脂进行气相色谱分析。利用该方法可以快速高效地筛选高产菌种，筛选出的高产菌株高山被孢霉菌体油脂中花生四烯酸含量达到了72.3％。
文档编号C12N1/14GK1587378SQ20041006062
公开日2005年3月2日 申请日期2004年7月22日 优先权日2004年7月22日
发明者余龙江, 朱敏, 周蓬蓬 申请人:华中科技大学