专利名称：一种真菌的筛选方法以及采用该菌种生产纤维素酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌及应用该菌种生产纤维素酶(包括CMC酶、滤纸酶 等)的方法。
背景技术：
纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，在食品、饲料、 医药、纺织、洗涤剂和造纸等工业领域有广泛的应用价值。自从1906年Seilliere 从蜗牛消化液中发现纤维素酶以来，人们对纤维素酶做了大量的研究，特别 是20世纪80年代以来，由于分子生物学的发展及生物工程技术的兴起，纤 维素酶的研究出现了新的前景。大量的纤维素酶产生菌种被发现，包括真菌 和细菌等。
^^0^y/7/^w/" 是一种植物致病菌，能够导致苹果等许多水果的
腐烂，也用于印染行业的污水处理，未见有生产纤维素酶的报道。
发明内容
.
本发明需要解决的技术问题之一是公开一种真菌的筛选培养方法。 本发明用于生产纤维素酶(包括CMC酶、滤纸酶等)的微生物是一种真 菌5o^70sp/weWa fifoAWea，并按照菌种筛选分离的顺序命名为万0^Ka^/2aenb ^A/^"M12，该真菌是已知现有菌种，各大菌种保藏库中均有保存。 本发明需要解决的技术问题之二是公开一种以真菌5o^vo^/2^n'a ^^/nVfeaM12生产纤维素酶(包括CMC酶、滤纸酶等)的方法。
1. 该菌种具有如下的性质
形态生理生化特征
形态特征丝状真菌，'菌落呈白色，圆柱形菌丝体，不透明。 生理生化特征产纤维素酶。
2. 本发明提供了一种真菌的筛选培养方法，其特征在于，包括以下步骤
将没有完全腐烂的苹果切成小块置于密封容器中，于20-3(TC培养40-60 天，生成白色絨毛状菌体，挑取单菌落保存在斜面保存培养基上20-40。C培养 48-72小时并保存于4'C冰箱；斜面保存培养基组成为NaN03 2; K2HP04 1; KC1 0.5; MgS04 0.5; FeS04
0.01;蔗糖30;琼脂15-20;其余为去离子水，以上数据均为质量/体积比g/L，
用盐酸调节pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3'C灭菌30分钟；
将冰箱保存的菌株无菌条件下用接种环接于纤维素降解菌固体筛选培养 基，20-4(TC培养48-72小时，并保存于4。C冰箱；
纤维素降解菌固体筛选培养基组成为NaN03.2; K2HP041; KC10.5; MgSO40.5; FeS04 0.01;羧甲基纤维素钠10;琼脂15-20;其余为去离子 水，以上数据均为质量/体积比g/L，用盐酸调节pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3°C 灭菌30分钟； -
对该真菌提取总DNA后，使用FTGENE5D型PCR仪在ITS4-ITS5区域 PCR扩增，进行测序后得到如下序列
CTTCAGTTTGGTTCCTACTGATCCGAGGTCACCTTAGAAAAATAAA GTTGGGTGTCGGCTGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCAGGTGACAAAG CCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGC
AAGCAACAAGGTACGATAGACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGG
TACGACTTTTTACTTCCC
测序所得序列经NCBI上BLAST (http:〃www.ncbi.nim.nih.gov)同源 性检索和分析，得到GeneBank中与之亲缘关系最近的菌种Sofo/o^/^er/a t/of/2/^a，同源性达99%;
可确定该真菌为Bo^yo^/zaeWai/oAWea,并按照菌种筛选分离的顺序命 名为Bo/o^ypteen'a^^^feaM12，该真菌是已知现有菌种，各大菌种保藏库 中均有保存。3.本发明利用Bo^vosp/iaer/fl必决i&a M12制备纤维素酶的方法，其步骤 顺序如下
(1) 斜面培养将上述菌株于无菌条件下用接种环接于液体富集培养基 中，20-4(TC条件下，摇床振荡培养48-72小时，制得种子液。其中液体富集 培养基包括NaN03 2; K2HP041; KC1 0. 5;蔗糖30;以上均为质量/体积 比g/L，溶于Mandels无机营养盐液，用盐酸调节pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3°C 灭菌30分钟；
(2) 摇瓶培养将种子液接种于液体产酶培养基中，20-4(TC有氧条件下， 摇床振荡培养48-120小时，制得发酵液；其中液体产酶培养基组成为玉米 皮纤维粉20;小麦麸皮浸出液5;蛋白胨1;碳酸钙5;吐温-80 2，以上数
据均为质量/体积比g/L，溶于Mandds无机营养盐液，用盐酸调节pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3。C灭菌30分钟；.
(3) 粗酶液制备取步骤(2)溶于Mandels无机营养盐液后的发酵液以 5000-10000转/分钟离心3-5分钟收集上清液，得到粗酶液；
其中Mandels无机营养盐液的组成为KH2P04 3.0 g/L; (NH4)2S04 2.0 g/L; MnS04'H20 0.0025 g/L; CaCl20.5g/L; CoCl2 0.003 g/L; FeS04'7H20 0.0075 g/L;尿素0.5g/L; MgSO4'5H2O0.5g/L; ZnS04'7H20 0.002 g/L;其余为去离 子水。
4.酶活的测定方法
(1) 纤维素酶活(CMC酶活)测定取0.5 mL稀释10倍的酶液，加入1.5mL 0.625。/。CMC溶液，于50。C保温30min，加入2mL 10%的氢氧化钠溶液终止反 应，再加入3mLDNS试剂，于沸永中煮15min，使用UV-2000型紫外可见分 光光度计在550nm处比色。以酶液每分钟产生lpmol还原糖所需的酶量为1 个酶活单位IU。
(2) 滤纸酶活力(FF'A)的测定方法取lmL稀释10倍的酶液，加入lmg 滤纸条，再加入lmL柠檬酸缓冲溶液于55。C保温60min再加入3mL DNS试 剂，于沸水中煮15min，使用UV-2000型紫外可见分光光度计在550nm处比 色。以每分钟酶液产生l^imol还原糖所需的酶量为1个酶活单位IU。
(3) 在上述方法中，DNS试剂的配制取200g酒石酸钾钠溶于一定量的 水中加热溶解后添加10.0g3,5-二硝基水杨酸，10.0g氢氧化钠溶解后加入2.0g
6苯酚，0.5g无水亚硫酸钠，加热溶解后冷却至室温，定容至1000mL。用之前 一周配制。
(4) 葡萄糖标准曲线的绘制用电子天平准确称取0.2750g葡萄糖，用蒸 馏水溶解定容至250mL制成1.0 mg/mL的葡萄糖标准溶液，取葡萄糖标准溶 液5、 10、 15、 20、 25mL于50mL容量瓶中，稀释定容。取2mL配制好的溶 液以蒸馏水作空白参比，分别加入1.5mLDNS试剂在10(TC水浴锅中加热 15min显色后，使用UV-2000型紫外可见分光光度计在554nm处测定吸光值， 以吸光值为纵坐标，糖浓度为横坐标得到标准曲线或计算回归方程。葡萄糖 标准曲线是所有的实施例所共用的，数据和曲线相同，见图l。
(5) 酶活的结果计算分别按照(l)、 (2)的方法进行纤维素酶活和滤纸酶活 的测定，在550nm处测得比色值，根据曲线拟合方程y=0.7692x得到测定样 品中的葡萄糖含量，由纤维素酶活和滤纸酶活的定义可得到最终的酶活数值。
图1葡萄糖标准曲线的绘制
具体实施例方式
将没有完全腐烂的苹果切成小块置于密封容器中，于2(TC培养40天，生 成白色绒毛状菌体，挑取单菌落保存在斜面保存培养基上，在THZ-C恒温振 荡器中2(TC培养72小时并保存于4"冰箱；
斜面保存培养基组成为NaN032; K2HP04 1; KC1 0.5; MgSO40.5; FeS04
0.01;蔗糖30;琼脂15-20;其余为去离子水，以上数据均为质量/体积比g/L，
用盐酸调节pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3。C灭菌30分钟；
将冰箱保存的菌株无菌条件下用接种环接于纤维素降解菌固体筛选培养
基，在THZ-C恒温振荡器中20。C培养72小时，并保存于4。C冰箱；
纤维素降解菌固体筛选培养基组成为NaNO30.2; K2HP041; KC10.5;
MgSO40.5; FeS04 0.01;羧甲基纤维素钠10;琼脂15-20;其余为去离子
水，以上数据均为质量/体积比g/L，用盐酸调节pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3°C
灭菌30分钟；
筛选后的菌株经分子生物学鉴定为Bo^;a^/2fleWa ^^Vfe化 斜面培养将上述菌株于无菌条件下用接种环接于液体富集培养基中，2(TC条件下，在THZ-C恒温振荡器中振荡培养72小时，制得种子液。其中 液体富集培养基包括NaN032; K2HP041; KC10.5;蔗糖30;以上均为质 量/体积比g/L，溶于Mandels无机营养盐液，用盐酸调节pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3"灭菌30分钟；
摇瓶培养将种子液接种于液体产酶培养基中，2(TC有氧条件下，在 THZ-C恒温振荡器中振荡培养120小时，制得发酵液。其中液体产酶培养基
组成为玉米皮纤维粉20;小麦麸皮浸出液5;蛋白胨1;碳酸钙5;吐温
-80 2，以上数据均为质量/体积比g/L，溶于Mandels无机营养盐液，用盐酸 调节pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3。C灭菌30分钟；
粗酶液制备取上步摇瓶培养的发酵液溶于Mandels无机营养盐液使用 ALC PK121R型冷冻离心机以5000-10000转/分钟离心3-5分钟收集上清液， 得到粗酶液；
酶活测定结果在该条件下获得的酶液其纤维素酶活(CMC酶活)为2.215 IU/mL，滤纸酶活(FPA)为2.263 IU/mL。
实施例2:
将没有完全腐烂的苹果切成小块置于密封容器中，在THZ-C恒温振荡器 中于25'C培养50天，生成白色绒,状菌体，挑取单菌落保存在斜面保存培养 基上25T:培养56小时并保存于4。C冰箱；
斜面保存培养基组成为NaN03 2; K2HP04 1; KC1 0.5; MgS04 0.5; FeS04
0.01;蔗糖30;琼脂15-20;其余为去离子水，以上数据均为质量/体积比g/L，
用盐酸调节pH至5.0; 1.05kg/cm2, 121.3。C灭菌30分钟；
将冰箱保存的菌株无菌条件下用接种环接于纤维素降解菌固体筛选培养
基，在THZ-C恒温振荡器中25'C培养56小时，并保存于4。C冰箱；
纤维素降解菌固体筛选培养基组成为NaNO30.2; K2HP041; KC10.5;
MgSO40.5; FeS04 0.01;羧甲基纤维素钠10;琼脂15-20;其余为去离子
水，以上数据均为质量/体积比g/L，用盐酸调节pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3°C
灭菌30分钟； '
筛选后的菌株经分子生物学鉴定为5c^70^/2aw/ac/o决/^a，并命名为 5o吵05p/we由(ioA/cfefl Ml 2;斜面培养将上述菌株于无菌条件下用接种环接于液体富集培养基中，
在THZ-C恒温振荡器中25'C条件下振荡培养56小时，制得种子液。其中液 体富集培养基包括NaN032; K2ttP04l; KC10.5;蔗糖30;以上均为质量 /体积比g/L，溶于Mandds无机营养盐液，用盐酸调节pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3"灭菌30分钟；
摇瓶培养将种子液接种于液体产酶培养基中，在THZ-C恒温振荡器中 25t:有氧条件下振荡培养72小时，制得发酵液。其中液体产酶培养基组成为
玉米皮纤维粉20;小麦麸皮浸出液5;蛋白胨1;碳酸钙5;吐温-80 2，以
上数据均为质量/体积比g/L，溶于Mandels无机营养盐液，用盐酸调节pH至 5.0; 1.05kg/cm2， 121.3。C灭菌30分钟；
粗酶液制备..取上步摇瓶培养的发酵液溶于Mandds无机营养盐液，使 用ALC PK121R型冷冻离心机50Q0-10000转/分钟离心3-5分钟收集上清液， 得到粗酶液；
酶活测定结在该条件下获得的酶液其纤维素酶活(CMC酶活)为 3.407 IU/mL，滤纸酶活(FPA)为4.039 IU/mL。
实施例3:
将没有完全腐烂的苹果切成小块置于密封容器中，在THZ-C恒温振荡器 中4(TC培养60天，生成白色绒毛状菌体，挑取单菌落保存在斜面保存培养基 上4(TC培养48小时并保存于4X:冰箱；
斜面保存培养基组成为NaN03 2; K2HP04 1; KC1 0.5; MgS04 0.5; FeS04
0.01;蔗糖30;琼脂15-20;其余为去离子水，以上数据均为质量/体积比g/L，
用盐酸调节pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3。C灭菌30分钟；
将冰箱保存的菌株无菌条件下用接种环接于纤维素降解菌固体筛选培养
基，在THZ-C恒温振荡器中20。C培养72小时，并保存于4。C冰箱；
纤维素降解菌固体筛选培养基组成为NaNO30.2; K2HP041; KC10.5;
MgSO40.5; FeS04 0.01;羧甲基纤维素钠10;琼脂15-20;其余为去离子
水，以上数据均为质量/体积比g/L，用盐酸调节pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3°C
灭菌30分钟；筛选后的菌株经分子生物学鉴定为万o^70^^aen'a Af/2zWea，并命名为 5o吵osp/wfm'fl M12;
斜面培养将上述菌株于无菌条件下用接种环接于液体富集培养基中，
在THZ-C恒温振荡器中2(TC条件下振荡培养72小时，制得种子液。其中液 体富集培养基包括NaN032; K2HP041; KC10.5;蔗糖30;以上均为质量 /体积比g/L，溶于Mandds无机营养盐液，用盐酸调节pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3"C灭菌30分钟；
摇瓶培养将种子液接种于液体产酶培养基中，在THZ-C恒温振荡器中 4(TC有氧条件下，振荡培养48小时，制得发酵液。其中液体产酶培养基组成
为玉米皮纤维粉20;小麦麸皮浸出液5;蛋白胨1;碳酸钙5;吐温-80 2，
以上数据均为质量/体积比g/L，溶于Mandds无机营养盐液，用盐酸调节pH 至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3。C灭菌30分钟；
粗酶液制备取上步摇瓶培养的发酵液溶于Mandds无机营养盐液，使 用ALC PK121R型冷冻离心机5000-10000转/分钟离心3-5分钟收集上清液， 得到粗酶液；
酶活测定结果在该条件下获得的酶液其纤维素酶活(CMC酶活)为 3.166 IU/mL，滤纸酶活(FPA)为3.058 IU/mL。
10
权利要求
1. 一种真菌Botryosphaeria dothidea M12的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤将没有完全腐烂的苹果切成小块置于密封容器中，于20-30℃培养40-60天，生成白色绒毛状菌体，挑取单菌落保存在斜面保存培养基上20-40℃培养48-72小时并保存于4℃冰箱；斜面保存培养基组成为NaNO3 2；K2HPO4 1；KCl 0.5；MgSO4 0.5；FeSO4 0.01；蔗糖30；琼脂15-20；其余为去离子水，以上数据均为质量/体积比g/L，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；将冰箱保存的菌株无菌条件下用接种环接于纤维素降解菌固体筛选培养基，20-40℃培养48-72小时，并保存于4℃冰箱；纤维素降解菌固体筛选培养基组成为NaNO3 0.2；K2HPO41；KCl 0.5；MgSO4 0.5；FeSO4 0.01；羧甲基纤维素钠10；琼脂15-20；其余为去离子水，以上数据单位均为质量/体积比g/L，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；筛选后的菌株经分子生物学鉴定为Botryosphaeria dothidea，并命名为Botryosphaeria dothidea M12。
2. —种以BWo^/ /jaen'a cfof/n'tfea M12菌为菌种生产纤维素酶的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)斜面培养将筛选后的菌株万o^70sp/2"en'a do^/dea M12 于无菌条件下用接种环接于液体富集培养基中，20-40。C条件下， 摇床振荡培养48-72小时，制得种子液；其中液体富集培养基包括NaN032; K2HP041; KC10.5; 蔗糖30;以上数据均为质量/体积比g/L，溶于Mandels无机营 养盐液，用盐酸调节pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3"灭菌30分 钟；(2) 摇瓶培养以上述种子液和液体产酶培养基体积比为5%的接种量将种子液接种于液体产酶培养基中，20-4(TC有氧条 件下，摇床振荡培养48-120小时，制得发酵液；其中液体产酶培养基组成为玉米皮纤维粉20;小麦麸皮浸出液5;蛋白胨1;碳酸钙5;吐温-80 2，以上数据单位均为质量/体积比g/L，将发酵液溶于Mandels无机营养盐液，用盐 酸调节pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3。C灭菌30分钟；(3) 粗酶液制备取上述溶于Mandels无机营养盐液后的发 酵液以5000-10000转/分钟离心3-5分钟收集上清液，得到粗酶 液。
全文摘要
本发明涉及一种真菌的筛选方法以及采用该菌种生产纤维素酶的方法。菌种培养方法将没有完全腐烂的苹果切成小块置于密封容器中，于20-30℃培养40-60天，生成白色绒毛状菌体，挑取单菌落保存在斜面保存培养基上20-40℃培养48-72小时并保存于4℃冰箱；将冰箱保存的菌株无菌条件下用接种环接于纤维素降解菌固体筛选培养基，20-40℃培养48-72小时，并保存于4℃冰箱。本发明还公开一种采用该菌种生产纤维素酶的方法。
文档编号C12Q1/04GK101463384SQ20091007629
公开日2009年6月24日 申请日期2009年1月9日 优先权日2009年1月9日
发明者刘洁丽, 安明泉, 靖 王 申请人:中国石油大学(北京)