专利名称：一株海球菌及其在降解咪唑乙烟酸中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株海球菌及其在降解咪唑乙烟酸中的应用。
背景技术：
咪唑乙烟酸(imazethapyr)具有杀草谱广、选择性强、活性高等优点，是大豆 田优良的除草剂，自从1993年德国巴斯夫公司普施特申请专利被中国驳回后，咪唑 乙烟酸国产化，成本下降，用量大幅增加，在我国大豆产区得到大面积的推广和应 用，年总用量平均在4000吨左右，应用面积达到4000多万亩以上，占大豆田除草 剂面积的75%以上，至今因品种竞争和政策限制等因素田间用量有所下降，但它仍 然是导致作物频频产生药害主要长残留性除草剂品种之一。
但随着这一产品的在大豆田化学除草中的广泛应用，也暴露出一些问题和不足， 如对恶性杂草的防除效果、土壤处理药效受环境条件制约、长残效对后作的安全性 等问题(Jourdan SW， Majek BA， Ayeni AO. Imazethapyr bioactivity and movement in soil. Weed Science, 1998， 46(5) :608-613;黄春燕，陈铁宝，王宇等.咪唑啉 酮除草剂对后茬作物安全性研究初报.农药学学报，2001， 3 (2) : 29-34)。
咪唑乙烟酸活性极高，且在土壤及水中降解缓慢，故微量残留可能伤害后茬敏 感作物，世界各地有很多关于咪唑乙烟酸不同程度地对后茬敏感作物如高粱、水稻、 甜菜、马铃薯及蔬菜等伤害的报道(窦玉敏，高卫东.土壤中残存咪唑乙烟酸对水 稻生长影响.稻田植保，2000， 3: 22-23)。施药后12个月可以种植玉米、小麦， 施药后24个月正常用量可以种植油菜、马铃薯，对甜菜和白菜仍有药害，36个月可 种甜菜、油菜、亚麻、白瓜(朴英，傅迎春，胡凡等.金豆和普施特施药后对后作 安全性的实验研究.中国农学通报，2002， 18 (6) : 52-54)。
咪唑乙烟酸，通常不易挥发和水解，光解作用轻微，土壤对其吸附性差(Gentile JM， Roneker KR， Crowe SE， Pond WG， Lei XG. Effectiveness of an experimental consensus phytase in improving dietary phytate-phosphorus utilization by weanling pigs. J Anim Science, 2008， 81 (11) : 2751-2757)。我国北方地区 的寒冷气候条件使土壤中长残效除草剂咪唑乙烟酸很难在短时间内降解，南方多季 种植结构仍会造成除草剂的残留药害，不但影响农作物的耕作、换茬，而且严重影 响种植结构的调整。因此如何解决长残效除草剂残留危害的问题，已成为当前保护 土地资源与农业生态环境的重要课题。
目前解决长残留除草剂危害的途径主要有开发除草剂新品种以代替现有长残 留性除草剂，但由于对靶标酶的了解程度不够，加之开发一个农药新品种要投入资金数亿美元，所以难度很大；抗除草剂转基因作物品种的选育，需要投入大量的研 究经费和人力，要经历较长的研究过程，距离实际应用还很遥远；利用一些化学物 质即除草剂的解毒剂(保护剂)解除除草剂对作物产生的药害，但涉及到另外一种化
学物质的投放于环境中，会造成二次污染的问题；利用源于土壤的微生物降解，才 是真正能消除长残留除草剂污染的有效途径。
发明内容
本发明的目的是一株海球菌及其在降解咪唑乙烟酸中的应用。 本发明所提供的海球菌为海球菌(MaW"ococc^ sp.) LPYCGMCC処.2774。 所述海球菌(MflWwococcws sp.) LPYCGMCC 黑龙江省哈尔滨地区长期
施用长残留性除草剂咪唑乙烟酸的土壤中分离得到。其菌落表面光滑、边缘有褶皱、
隆起，不透明，平面生长，培养基乳黄色，菌株细胞呈球状。
所述海球菌(iWaW"ococcws sp.) LPY CGMCC W2.2774，已于2008年11月27
曰保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为
中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCCW2.2774。
本发明的海球菌(Marinococcus sp.) LPY CGMCC W2.2774来源于土样采自黑龙
江省哈尔滨市长期施用长残留性除草剂咪唑乙烟酸的土壤，可以在高浓度咪唑乙烟
酸环境下生长，并且可以高效降解咪唑乙烟酸，为微生物降解长残留除草剂咪唑乙
烟酸的研究提供了重要的基础，可用于受咪唑乙烟酸污染的水体、土壤的生物净化。
图1为海球菌(Afon'/wcoccMsp.) LPY在不同温度下对土壤中咪唑乙烟酸的降 解效果
图2为在不同温度下海球菌(Afor/"ococcwsp.) LPY降解土壤中咪唑乙烟酸的 半衰期
图3为海球菌(JWaWwococcussp.) LPY在不同土壤湿度下对咪唑乙烟酸的降解
效果
图4为在不同土壤湿度下海球菌(Afan'wococcRS sp.) LPY降解咪唑乙烟酸的半
衰期
图5为海球菌(7kfan'"ococcwssp.) LPY在不同类型土壤中对咪唑乙烟酸的降解
效果
图6为在不同类型土壤中海球菌(MflW朋cocc^sp.) LPY降解咪唑乙烟酸的半
衰期
具体实施例方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例l、海球菌(Mfln'"ococc^ sp.) LPYCGMCC W2.2774的分离、纯化及其
鉴定
1、 海球菌(Ma〃'"ococcwsp.) LPYCGMCC W2.2774的分离及纯化
1) 采集样品
土样采自黑龙江省哈尔滨市东北农业大学实验实习基地内长期施用长残留性除 草剂咪唑乙烟酸的土壤。
2) 菌体的富集和分离
将长期施用长残留性除草剂咪唑乙烟酸的土壤样品混合均匀，称取10g加入到 含有100mg'i;'咪唑乙烟酸的100mL富集培养液中，置于3(TC， 150r min 1的摇床 培养。7d后按10X的接种量取培养液将其移入含咪唑乙烟酸浓度为200mgl^新鲜 富集培养液中，继续培养7d;以后每隔一周均从上次的培养液中取出10mL加入到 lOOmL新鲜富集培养液中，咪唑乙烟酸的浓度每次增加lOOmg丄-1，直至增加到600 mg，L—1，共富集培养6次；然后转入到无机盐培养基中进行筛选，共进行3次，培养 基中咪唑乙烟酸的浓度分别为800、 1000、 1200mg丄"。最后取样，在牛肉膏蛋白胨 琼脂培养基上按孢子形态、颜色进行单孢分离，挑出单菌株分别进行纯化培养并保 存。
上述的富集培养液组分及配比为牛肉膏，3g/L;蛋白胨，5g/L; NaCl， 5g/L; K2HP04， 5g/L; PH7.0-7.2。
上述的无机盐培养基组分及配比为KH2P04， 1. 70g/L; K2HP04， 5. 17g/L; (NH4)2SOo 2.6g/L;盐溶液，10mL/L; PH7. 0-7. 2。其中盐溶液为含MgS04， 19. 5g/L; MnS04， 5g/L; FeS04， 5g/L; CaCl2， 0. 3g/L的溶液。
上述的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基组分及配比为牛肉膏，3g/L;蛋白胨，5g/L;
琼脂，18g/L， PH7.0-7.2。
结果得到一株可在高浓度咪唑乙烟酸环境下生长的菌株，其在上述牛肉膏蛋白 胨琼脂培养基上，3(TC条件下生长的菌落表面光滑、边缘有褶皱、隆起，不透明， 平面生长，培养基乳黄色，菌株细胞呈球状。
2、 将上述得到的菌株进行生理生化鉴定，结果其生理生化特征如表1所示。 _表l LPY菌株的生理生化特征_
项目 结果 项目 结果一乙酰甲基醇试验(V-P)一
芽孢的有无无明胶液化—
运动性+柠檬酸盐利用+
需氧性需氧葡萄糖分解代谢形式氧化
最适温度rc)33 36荧光色素+
接触酶一硝酸盐还原+
淀粉水解一反硝化+
甲基红(M.R)+乙醇氧化+
注"+ "表示生长或反应阳性；"-"表示不生长或反应阴性。
经上述鉴定表明该菌株为海球菌(7kfar/"woccMsp.),将其命名为LPY。该海 球菌(似aW"ococc^sp.) LPY,己于2008年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大屯路)，保 藏号为CGMCC N2. 2774。
实施例2、海球菌(A^WwococcMsp.) LPY对土壤中咪唑乙烟酸的降解 1、海球菌(7kfohwococc^sp.) LPY在不同温度下对咪唑乙烟酸的降解效果 将海球菌(M^"ococcz^sp.) LPY CGMCC Ns. 2774用牛肉膏蛋白胨培养液(含 牛肉膏，3g/L;蛋白胨，5g/L; PH7.0-7.2的培养液)在3(TC的条件下进行增值培 养，用于下述效果检测实验。
在黑土 (有机质含量3. 557%，田间最大持水量37. 5%，全氮0. 195%， pH值7. 12) 中加入终浓度为10(Htg'kg—'的咪唑乙烟酸，分成6份每份24kg，其中三份分别按照 5Xl()8cfu/kg黑土的量接种海球菌(Mfln'"oco"船sp.) LPY CGMCC Na. 2774，将该菌 株与土壤混匀，调节土壤含水量为田间最大持水量的50%，然后分别置于2(TC、 25 °C、 3(TC恒温培养箱中放置作为三个实验组；另外三份土壤不接种任何菌，调节土 壤含水量为田间最大持水量的50%，分别置于2(TC、 25°C、 3(TC恒温培养箱中放 置作为三个空白对照组。各组分别在培养后的第l， 7， 15， 30， 45， 60天后，测定 土壤中各处理咪唑乙烟酸的残留量，计算各组处理咪唑乙烟酸的半衰期。
各处理土壤中咪唑乙烟酸的残留量测量结果如图1所示，当温度为20°C、 25°C、 3(TC时，三个空白对照组于第60天测定各对照土壤中咪唑乙烟酸的残留量(图1中 20°C CK、 25°C CK、 30°C CK)，分别为85.79iag.kg-1， 81.35fig.kg-1和79.76ng.kg"，而添加海球菌(Mfl〃'"ococcw"p.) LPY CGMCC Na. 2774后的三个处理组(图1中20 °C处理、25°C处理、30°C处理)残留量分别为9.79， 7.48和6.24吗'kg"，残留率 分别为9.79%、 7.48%、 6.24%， i兑明海球菌(Man.彦o固sp.) LPY CGMCC Mi. 2774 对黑土中咪唑乙烟酸具有很强的降解能力，并且温度为2(TC 3(TC的范围内降解效 果好。
各组处理咪唑乙烟酸的半衰期结果如图2所示，结果表明在2(TC、 25°C、 30°C 条件下，咪唑乙烟酸在黑土中自然降解的半衰期(图2中CK)分别为301. 37天，223. 60 天和203.87天，而在LPY菌的作用下，20°C、 25°C、 30。C条件下(图2中处理)， 其降解半衰期分别为17. 91天、16. 31天和15. 13天。结果表明LPY菌能大幅度降低 土壤中咪唑乙烟酸的半衰期，使土壤中咪唑乙烟酸快速降解，大大提高了咪唑乙烟 酸的降解效率。
2、海球菌(^faW朋cocc^sp.) LPY在不同土壤湿度下对咪唑乙烟酸的降解效果 在黑土(有机质含量3.557%，田间最大持水量37.5%，全氮0. 195%, pH值7. 12) 中加入终浓度为100^*kg—^勺咪唑乙烟酸，分成6份每份24kg，其中三份分别按照 5Xl()8cfu/kg黑土的量接种海球菌(Man'"ococcwssp.) LPY CGMCC NQ. 2774，将该菌 株与土壤混匀，分别调节土壤含水量为田间最大持水量的37. 5%、 50%、 62.5%,然后 分别置于25。C恒温培养箱中放置作为3个菌处理组；另外3份土壤不接种任何菌， 分别调节土壤含水量为田间最大持水量的37.5%、 50%、 62.5%,分别置于25°C恒温 培养箱中放置作为3个空白对照组，分别在培养后的第l， 7， 15， 30， 45， 60天后， 测定各处理土壤中咪唑乙烟酸的残留量，并计算各组处理咪唑乙烟酸的半衰期。
各处理土壤中咪唑乙烟酸的残留量测量结果如图3所示，结果表明于第60天测 定含水量为田间最大持水量的37. 5%、50%、62. 5%时的空白对照组土壤(图3中37. 5% CK、 50%CK、 62. 5°/。CK)中咪唑乙烟酸的残留量，分别为ST.^iLig'kg-1, SGJSjug'kg-1 和8U8ng'kg"，而添加LPY菌后含水量为田间最大持水量的37.5%、 50%、 62. 5%时 的菌处理组土壤(图3中37. 5%处理、50%处理、62. 5%处理)中咪唑乙烟酸的残 留量，分别为残留量分别为15.42， 6.76禾口 8.53吗'kg"说明海球菌(M^'"ococc^sp.) LPY CGMCC N2. 2774在土壤湿度为50% 62.5%的范围内，对黑土中咪唑乙烟酸具有 很强的降解能力。各组处理咪唑乙烟酸的半衰期结果如图4所示，结果表明添加海球菌 (Man'"ococc^ sp.) LPY cgmcc Nq, 2774的含水量为田间最大持水量的37.5%、 50%、 62.5%的菌处理组土壤(图4中处理)中咪唑乙烟酸的降解半衰期分别为21.39天， 15.00天和16.66天，而未加菌处理(空白对照组)(图4中CK)相应含水量的土 壤中咪唑乙烟酸的降解半衰期分别为346.57天，330.07天和239.02天，说明海球菌 (M腦'"ococcm sp.) LPY CGMCC他.2774菌株在较高土壤湿度的情况下降解效率较 显著。
3、海球菌(M—aW"ococc^sp.) LPY在不同类型土壤中对咪唑乙烟酸的降解效果
在黑土(有机质含量3. 557%，田间最大持水量37. 5。/。，全氮0. 195%， pH值7. 12)、 白浆土 (有机质含量3. 145%，田间最大持水量35.6%，全氮0.176%， pH值5.43)、 盐碱土 (有机质含量2. 984%,田间最大持水量39. 8%，全氮0. 149%， pH值8. 24) 3 种土壤中分别添加咪唑乙烟酸使其终浓度为100ng'kg"，向土壤中按照5X108cfu/kg 土壤的量接种海球菌(M^/"ococcws sp.) LPY cgmcc Ns. 2774，将该菌株与土壤混匀， 调节土壤含水量为田间最大持水量的50%，置于25'C恒温培养箱中培养，另设置不 添加降解菌，其他条件均相同的三种土壤处理作为空白对照，记为CK。分别在培养 后的第l， 7， 15， 30， 45， 60天后，测定各处理咪唑乙烟酸的残留量和半衰期。
各处理土壤中咪唑乙烟酸的残留量测量结果如图5所示，结果表明第60天黑土、 白浆土、盐碱土空白对照(图5中黑土 CK、白浆土 CK、盐碱土 CK)中咪唑乙烟 酸的残留量，分别为80.64， 83.39和82.06吗'kg"，而添力口海球菌(M腦'騰oc面sp.) LPYCGMCCN2.2774后的黑土、白浆土、盐碱土处理组(图5中黑土处理、白浆土处 理、盐碱土处理)咪唑乙烟酸残留量分别为7.82、 19.48和11.72pg'kg"，说明LPY 菌对三种土壤中的咪唑乙烟酸都具有很强的降解能力，其中对黑土和盐碱土中咪唑 乙烟酸的降解效果略好于白浆土。
各组处理咪唑乙烟酸的半衰期结果如图6所示，咪唑乙烟酸在黑土、白浆土、 盐碱土中自然降解(图6中CK)的半衰期分别为210.04天，247.55天和223.60天， 而海球菌(MflW"ococc^ sp.) LPY CGMCC Na.2774对黑土、白浆土、盐碱土三种土 壤处理组(图6中处理)中咪唑乙烟酸降解的半衰期分别为16.74天，25.86天和20.27天，表明海球菌(Man'"ococc^sp.) LPY CGMCC Nq. 2774能够显著提高土壤咪唑乙 烟酸的降解速度，且LPY菌在不同类型土壤中均表现出较强的降解能力，尤其在黑 土和盐碱土中表现更佳。
权利要求
1、海球菌(Marinococcus sp.)LPY CGMCC №.2774。
2、 海球菌(Ma〃'"ococc^ sp.) LPY CGMCC JV2.2774在降解咪唑乙烟酸中的应用。
3、 海球菌(MaW"oa ccw sp.) LPY CGMCC Ws.2774在生物净化受咪唑乙烟酸 污染水体或土壤中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株海球菌及其在降解咪唑乙烟酸中的应用。该海球菌为海球菌(Marinococcus sp.)CGMCC №.2774。该菌株可以在高浓度咪唑乙烟酸环境下生长，并且可以高效降解咪唑乙烟酸，为微生物降解长残留除草剂咪唑乙烟酸的研究提供了重要的基础，可用于受咪唑乙烟酸污染的水体、土壤的生物净化。
文档编号C12N1/20GK101457213SQ20091007622
公开日2009年6月17日 申请日期2009年1月6日 优先权日2009年1月6日
发明者刘亚光, 张金花, 滨 赵 申请人:东北农业大学