含三氯生的聚（β‑氨酯）制备方法及在选择性杀灭口腔变形链球菌生物被膜中的应用与流程

本发明属于纳米生物医药材料领域，涉及一种新型的含三氯生聚合物胶束的制备及其在口腔变形链球菌选择性杀灭中的应用。

背景技术：

从理论上讲，口腔微生物不断与含有唾液涂层的(或防护薄膜)表面进行着相互作用。在这些表面上，有的微生物可以先行附着，随后再引导其它的微生物附着。宿主的饮食习惯，免疫反应等系统因素将决定着整个口腔环境健康与否。例如，频繁并过多地摄入糖分会促进毒性生物膜的发展。在这些生物膜中存在着高度致酸的微生物群落。这些微生物产生的酸会破坏牙釉质，导致龋齿的形成。

为了应对上述危机，近年来纳米技术已经被广泛应用于对抗致病的口腔细菌。纳米颗粒可以作为抗菌剂的载体，在酸性ph下具有靶向细菌的功能性能，或者增强生物膜渗透和停留能力，或者在细菌分泌酶的作用下响应性药物释放细菌酶，或者利用纳米颗粒强阳性表面电荷诱导直接细胞裂解。在大多数情况下，抗菌剂通常通过疏水相互作用封装在纳米载体中。因此，在体内储存，运输或循环期间的药物泄漏是不可避免的。药物共轭聚合物或使用含药物的结构单元来构建聚合物可以很好解决药物泄露问题。而这样的解决方案在抗癌药物递送系统中有很好的应用。而在抗菌领域，人们急需开发一种利用含有抗菌剂的单体合成聚合物的新方法，并且用于防治致病的口腔细菌。

技术实现要素：

本发明的目的是解决现有封装在纳米载体中的抗菌剂在体内储存、运输或循环期间存在药物泄漏的问题，提供一种含三氯生的聚(β-氨酯)制备方法及在选择性杀灭口腔变形链球菌生物被膜中的应用。本发明同时利用活体成像技术对本发明体系中合成的新型含三氯生的聚(β-氨酯)对口腔变形链球菌(s.mutansatcc700610)的杀菌效率进行评估。

本发明的聚合物胶束体系具备以下一些优势：1)利用含有三氯生的单体将极大提高抗菌剂的负载率；2)通过胶束的表面自适应可以渗透和停留在生物被膜内部，并增强和细菌的相互作用；3)在生物膜内部酶的作用下，连接抗菌剂和聚合物之间的酯键发生断裂，释放抗菌剂；4)可以选择性地杀灭口腔变形链球菌而不会杀灭口腔正常菌群唾液链球菌(s.salivariushb)。

本发明的技术方案：

一种含三氯生的聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物胶束的制备方法，步骤如下：

1)将10-50毫克含三氯生的聚(β-氨酯)溶解于2-5毫升二甲基亚砜中，配制得到5-10毫克/毫升的溶液；

2)将步骤1)配制的聚合物有机溶液逐滴缓慢地加入到2500转/分钟搅拌条件下的5毫升去离子水中，水溶液逐渐由无色透明变为泛着微弱蓝色乳光，证明胶束的形成；

3)将得到的胶束溶液在去离子水中用截留分子量为7000的透析袋透析一天，以除去有机溶剂。最后加入去离子水定容到10毫升，得到浓度为1毫克/毫升的胶束溶液。

其中，所述的含三氯生的聚(β-氨酯)制备步骤如下：

1)将聚乙二醇单丙烯酸酯(一倍量)溶解在干燥的氯仿中并置于schlenk瓶中；

2)加入含有三氯生的单体(五倍量或者十倍量)和tdp(五倍量或者十倍量)；

3)氮气保护下于55℃的油浴中反应三天；

4)反应完毕后冷至室温，加入适量二氯甲烷稀释，然后在冰乙醚中沉淀。待沉淀完全后，抽滤，滤饼用冰乙醚洗涤三次，真空干燥后所得到的白色粉末状固体即为含三氯生的聚(β-氨酯)。

进一步的，所述的含有三氯生的单体制备步骤如下：

1)将28.9克三氯生和31.5克3-(丙烯酰氧基)-2-((丙烯酰氧基)甲基)-2-甲基丙酸加入到干燥过的schlenk瓶中，并加入200毫升二氯甲烷进行溶解；

2)加入24.9克edc·hcl和15.9克dmap；

3)体系在室温下反应12小时；

4)反应完毕后加入1000毫升二氯甲烷将体系稀释；

5)分别用1000毫升饱和碳酸钠溶液和1000毫升稀盐酸溶液洗涤；

6)分离得到有机相后用无水硫酸镁干燥，过滤，真空除去有机溶剂；

7)粗产品用200-300目硅胶，石油醚/乙酸乙酯(5:1)做淋洗剂纯化；

8)产品为无色液体。

本发明的优点是：

本发明利用便宜易得的抗菌剂三氯生为原料，能够以高于80％的收率合成含有三氯生的可聚合单体，通过不同单体的投入比例得到具有不同药物负载率的聚合物。本发明有如下的优势：1)原料简单易得；2)合成收率高，容易大批量制备；3)有很好的生物膜渗透停留能力和细菌酯酶响应性；4)可以选择性地杀灭口腔变形链球菌而不会杀灭口腔正常菌群唾液链球菌(s.salivariushb)。

附图说明

图1为聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物胶束自组装，响应性机制示意图及合成路线图。

图2为聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物胶束对口腔变形链球菌生物膜的渗透能力测试结果。

图3为聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物胶束对口腔变形链球菌生物被膜选择性杀灭。

图4为聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物胶束对唾液链球菌生物被膜杀灭效果图。

具体实施方式

实施例1：含三氯生的聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物胶束的制备方法

(一)含有三氯生的单体制备，步骤如下：

1)将28.9克三氯生和31.5克3-(丙烯酰氧基)-2-((丙烯酰氧基)甲基)-2-甲基丙酸加入到干燥过的schlenk瓶中，并加入200毫升二氯甲烷将其溶解；

2)加入24.9克edc·hcl和15.9克dmap；

3)体系在室温下反应12小时；

4)反应完毕后加入1000毫升二氯甲烷将体系稀释；

5)分别用1000毫升饱和碳酸钠溶液和1000毫升稀盐酸溶液洗涤；

6)分离得到有机相后用无水硫酸镁干燥，过滤，真空除去有机溶剂；

7)粗产品用200-300目硅胶，石油醚/乙酸乙酯(5:1)做淋洗剂纯化；

8)所得含有三氯生的单体产品为无色液体。

(二)含三氯生的聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)的制备，步骤如下：

1)将一倍量的聚乙二醇单丙烯酸酯溶解在干燥的氯仿中并置于schlenk瓶中；

2)加入步骤(一)制备的含有五倍量或者十倍量三氯生的单体和tdp；

3)氮气保护下于55℃的油浴中反应三天；

4)反应完毕后冷至室温，加入适量二氯甲烷稀释，然后在冰乙醚中沉淀。待沉淀完全后，抽滤，滤饼用冰乙醚洗涤三次，真空干燥后所得到的白色粉末状固体即为含三氯生的聚(β-氨酯)。

(三)一种含三氯生的聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物胶束的制备方法，步骤如下：

1)将10-50毫克含三氯生的聚(β-氨酯)溶解于2-5毫升二甲基亚砜中，配制得到5-10mgml^–1的溶液；

2)将聚合物有机溶液逐滴缓慢地加入到剧烈的搅拌条件下的5-10毫升去离子水中，水溶液逐渐由无色透明变为泛着微弱蓝色乳光，证明胶束的形成；

3)将得到的胶束溶液在去离子水中用截留分子量为7000的透析袋透析一天，以除去有机溶剂。最后加入去离子水定容到10毫升，得到浓度为1毫克/毫升的胶束溶液。

实施例2：聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物胶束对口腔变形链球菌生物膜的渗透能力测试实验。渗透能力测试实验步骤如下：

1)利用口腔变形链球菌在12孔板中培养生物膜48小时；

2)利用syto9对所得的生物膜样品避光染色15分钟；

3)得到的生物膜样品与浓度为0.2毫克/毫升含有尼罗红的聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物胶束混合；

4)在60转/分钟，37℃下培养2分钟；

5)生物膜样品再利用tcssp2型激光共聚焦荧光显微镜观测。用488纳米波长激发syto9和尼罗红，接收波长设置为490-540纳米(绿色)and583-688纳米(红色)，扫描间隔设置为2微米；

6)得到的层扫荧光显微照片利用imagej软件处理得到每层照片中的荧光强度、荧光面积以及三维叠加照片。

附图2给出了含三氯生的聚(β-氨酯)聚合物胶束对口腔变形链球菌生物膜的渗透能力测试结果：表明含三氯生的聚(β-氨酯)聚合物胶束能够在2分钟内完全渗透生物膜，并能完全停留在生物膜内部。

实施例3：含三氯生的聚(β-氨酯)聚合物胶束对口腔变形链球菌生物膜的选择性杀灭能力实验。

步骤如下：

1)利用口腔变形链球菌在12孔板中培养生物膜48小时；

2)将新制备的聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物胶束胶束或者三氯生溶液(三氯生浓度分别为100和200微克/毫升，唾液缓冲液，ph6.8)混合；

3)在60转/分钟，37℃下培养2分钟后除去胶束溶液，再加入300微升唾液缓冲液；

4)在1小时，3小时和5小时后，利用live/dead染色剂对所得的生物膜样品避光染色15分钟；

5)生物膜样品再利用tcssp2型激光共聚焦荧光显微镜观测。用488纳米波长激发和propidiumiodide，接收波长设置为490-540纳米(绿色)and583-688纳米(红色)，扫描间隔设置为2微米；

6)得到的层扫荧光显微照片利用imagej软件处理得到每层照片中的荧光面积以及三维叠加照片。

7)细菌存活率定义为绿色荧光面积/(红色荧光面积+绿色荧光面积)×100％

附图3给出了含三氯生的聚(β-氨酯)聚合物胶束对口腔变形链球菌生物膜的选择性杀灭能力评估结果，由图可知聚合物胶束能够有效地杀灭口腔变形链球菌，5小时后，能够达到92％的杀菌率，而且键合在聚合物中的三氯生比未键合的三氯生在杀菌效果上有明显的优势。

实施例4：聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物胶束对唾液链球菌生物膜的选择性杀灭能力实验。

步骤如下：

1)利用唾液链球菌在12孔板中培养生物膜48小时；

2)将新制备的聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物胶束胶束或者三氯生溶液(三氯生浓度分别为100和200微克/毫升，唾液缓冲液，ph6.8)混合；

3)在60转/分钟，37℃下培养2分钟后除去胶束溶液，再加入300微升唾液缓冲液；

4)在1小时，3小时和5小时后，利用live/dead染色剂对所得的生物膜样品避光染色15分钟；

5)生物膜样品再利用tcssp2型激光共聚焦荧光显微镜观测。用488纳米波长激发和propidiumiodide，接收波长设置为490-540纳米(绿色)and583-688纳米(红色)，扫描间隔设置为2微米；

6)得到的层扫荧光显微照片利用imagej软件处理得到每层照片中的荧光面积以及三维叠加照片。

7)细菌存活率定义为绿色荧光面积/(红色荧光面积+绿色荧光面积)×100％

附图4给出了含三氯生的聚(β-氨酯)聚合物胶束对唾液链球菌生物膜的选择性杀灭能力评估结果，表明含三氯生的聚(β-氨酯)聚合物胶束对唾液链球菌只有20％左右的杀灭能力。

本发明由含有三氯生的单体通过michael加成合成了聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物，其制备及作用机制参见附图1。能够在模拟刷牙过程的2分钟内完全渗透并停留在生物膜内部(参见附图2)。本发明中的：聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物胶束可以选择性地杀灭有害的口腔变形链球菌(参见附图3)而对有益菌唾液链球菌(参见附图4)则没有明显的杀灭效果。

需要说明的是，本发明是针对三氯生键合的聚合物胶束制备方法，其目的是得到一种三氯生键合，具有响应性聚合物胶束，同时将该胶束用于有害细菌生物膜的渗透和停留并测试其杀灭效果。本发明产品所具有的特点，但并非属于对疾病的针对及治疗。背景技术中所描述的相关治疗等内容，只是为了起到对本发明的背景的了解作用。另外，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的显而易见的改进和修饰都应该在本发明的保护范围之内。