热稳定性提高的氨基甲酸乙酯水解酶突变体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及热稳定性提高的氨基甲酸乙酯水解酶突变体，属于基因工程和酶工程
技术领域。
【背景技术】
[0002] 氨基甲酸乙酯（Ethylcarbamate，EC)是发酵食品（如酱油、腐乳、泡菜）和酒精饮 料(葡萄酒、黄酒、白酒)在生产、储藏过程中生成的对人体具有潜在致癌性和遗传毒性的一 种微量有害物质。由于EC的生成机制复杂，性质稳定一旦生成很难用物理或化学方法去除， 目前还没有可以消除不同发酵产品中EC的一种有效方法。应用生物酶法去除成品中的EC是 一种较为安全有效的方法。氨基甲酸乙脂水解酶(Urethanase，UH)能够降解EC，生成无害的 乙醇和二氧化碳，具有潜在的工业应用价值。本发明中野生氨基甲酸乙酯水解酶稳定性较 差，在40°C下的半衰期为3.67min。热稳定差不利于氨基甲酸乙酯水解酶在工业中的应用， 因此通过分子改造提高氨基甲酸乙酯水解酶稳定性显得尤为重要。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的问题是提供热稳定性提高的氨基甲酸乙酯水解酶突变体，其相对 亲本氨基甲酸乙酯水解酶有一个点进行突变。
[0004] 所述氨基甲酸乙酯水解酶亲本的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。在此基础上，将 328位的谷氨酰胺突变为半胱氨酸、精氨酸或缬氨酸。
[0005] 本发明还提供一种所述氨基甲酸乙酯水解酶突变体的制备方法，具体步骤如下：
[0006] 1)设计定点突变多用引物，以携带氨基甲酸乙酯水解酶编码基因的载体为模板进 行全质粒扩增，获得含突变氨基甲酸乙酯水解酶的重组载体；
[0007] 2)将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，纯化获得氨基甲酸乙酯水解 酶突变体。
[0008] 本发明提供的氨基甲酸乙酯水解酶突变体热稳定性都有所提高，其中，突变体 Q328C、Q328V和Q328R在40°C下的半衰期由对照（突变前）的3.67min分别提高到27.4min、 7.18min和3.99min。突变体Q328C、Q328R、Q328V在30°C以上都具有比原酶更好的耐受性。同 时突变体Q328C对乙醇的耐受性和酸耐受性也有所提高。氨基甲酸乙酯水解酶突变体将能 更好地用于降解食品和发酵饮料酒中的氨基甲酸乙酯。
【附图说明】
[0009] 图1:温度对野生酶和突变酶活性的影响
【具体实施方式】
[0010] 实施例1氨基甲酸乙酯水解酶突变体的制备
[0011] 通过对氨基甲酸乙酯水解酶的结构进行分析，我们选择对其第328位的氨基酸进 行突变，设计相对应的定点突变引物(表1)。以重组质粒pET20b-UH为模版，采用PCR酶，利用 突变引物对重组质粒pET20b-UH进行扩增。将扩增后片段利用胶回收试剂盒进行回收纯化。 将纯化后片段采用磷酸化酶对片段进行磷酸化。将磷酸化后的片段，利用连接酶进行连接， 转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，筛选阳性转化子，提取质粒，经酶切鉴定后，送至上海生 物工程有限公司测序验证。将含有测序正确质粒的大肠杆菌重组工程菌接种到LB培养基 中，于37°C、220r/min条件下过夜培养。将种子液按3%的接种量转接到TB培养基中，于37 °C、220r/min条件下培养至0D6QQ为0.6，加入ITPG至终浓度为0.lmmo1/L，在25°C、220r/min 条件下培养18h。
[0012] 将重组菌菌液在4°C、9000r/min下离心15min收集菌体。用20mmol/L、pH7.0的磷 酸盐缓冲溶液洗涤菌体2次并重悬菌体，超声破碎。将破碎后的菌液于4°C、9000r/min条件 下离心20min并收集上清液。纯化时先用缓冲液A(含250mmol/LNaCl，20mmol/L咪唑的 20mmol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液)平衡镍柱，流速为lmL/min。然后上样，用缓冲液A平衡镍 柱后，用缓冲液8(含250111111〇1/1^1(：1，500111111〇1/1咪唑的20111111〇1/1、？!17.4的磷酸盐缓冲溶 液)梯度洗脱蛋白。收集有酶活的洗脱组分进行脱盐处理。
[0013]表1氨基甲酸乙酯水解酶突变引物序列
[0015]实施例2酶活测定方法
[0016]取lmL酶液和lmL超纯水(对照），各加入lmL3%的EC溶液，于37°C恒温水浴箱中反 应15min后，加入lmL10%三氯乙酸终止反应。反应终止后加入111^显色剂1(158苯酚和 0.625g亚硝基铁氰化钠定容至250mL)和lmL显色剂II(13.125gNaOH和7.5mL次氯酸钠定容 至250mL)，混匀后在37°C水浴箱中保温20min，反应结束后用超纯水定容至10mL，测定625nm 下的吸光度。酶活定义:常压、37°C、pH7.0条件下，lmin分解EC产生Ιμπιο?氨所需酶量为一 个酶活力单位(U)。
[0017]实施例3突变提高氨基甲酸乙酯水解酶热稳定性和半衰期
[0018]将纯化后的野生酶及其突变体在不同温度下（20°C~65°C，间隔5°C)进行酶促反 应，测定其最适反应温度。野生酶和突变体的最适反应温度均为30°C，但突变体Q328C、 Q328R、Q328V在30°C以上比野生酶的稳定性好。在37°C保温1时间后，Q328C、Q328R、Q328V和 UH的残留酶活分别为76.9%、60.8 %、75.8%和51.9 %，分别比原酶提高了 24.0 %、8.9%和 23.9%。在40°C，上述突变体的残留酶活分别比原酶提高了31.7%、19.7%和28.9% (图1)。 [0019]将纯化后的野生酶及其突变体置于40°C下保温，每隔一定时间取样测定酶活。由 公式1]1(^ = 111〇)+1^，1：1/2 = 1112/1^计算出酶的半衰期。其中，(：()是初始酶活，(：1；是时间为1:时所 对应的酶活。突变体Q328C、Q328V和Q328R在40°C下的半衰期由对照（突变前）的3.67min分 别提高到27.411^11、7.181^11和3.991^11。分别是野生酶的7.46倍、1.96倍和1.1倍。可见两种 突变体都有不同程度的提高，特别是Q328C得到了很大程度的提高。
[0020] 实施例4突变提高氨基甲酸乙酯水解酶耐酸性和耐乙醇性
[0021] 将纯化后的野生UH酶及其突变体在不同的pH(4.5~7.0)条件下进行酶促反应，测 定不同pH值下的酶活。其中而Q328C在酸性条件下酶活的提高幅度较为明显:在pH6.0条件 下相对酶活提高了 11 %，在pH4.5条件下，相对酶活也提高了 11 %。
[0022] 将纯化后的野生UH酶及其突变体分别在浓度为0%、2%、5%、10%、15%的乙醇条 件下反应，测定不同乙醇浓度下的酶活。在2 %的乙醇条件下，野生酶UH的残留酶活为 55.2 %，突变酶Q328C的残留酶活为70.2 %，提高了 25 %。在5 %乙醇条件下，野生酶的残留 酶活为26.9%，Q328C的残留酶活为40.2%，提高13%。
[0023]由此可见，突变体Q328C对乙醇的耐受性和酸耐受性也有所提高。
[0024]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 热稳定性提高的氨基甲酸乙酯水解酶突变体，其特征在于，相对于具有SEQIDNO. 1 所示氨基酸序列的氨基甲酸乙酯水解酶，第328位的谷氨酰胺突变为半胱氨酸、精氨酸或缬 氨酸。2. 编码权利要求1所述的突变体的核苷酸序列。3. 携带权利要求2所述核苷酸序列的载体或重组细胞。4. 一种制备权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 设计定点突变多用引物，以携带氨基甲酸乙酯水解酶编码基因的载体为模板进行全 质粒扩增，获得含突变氨基甲酸乙酯水解酶的重组载体； 2) 将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，纯化获得氨基甲酸乙酯水解酶突 变体。5. 权利要求1所述氨基甲酸乙酯水解酶突变体在降解食品和发酵饮料酒中的氨基甲酸 乙酯中的应用。6. 权利要求3所述载体或重组细胞在降解食品和发酵饮料酒中的氨基甲酸乙酯中的应 用。
【专利摘要】本发明公开了热稳定性提高的氨基甲酸乙酯水解酶突变体，属于基因工程和酶工程中技术领域。本发明通过分子学技术手段获得了热稳定性提高的氨基甲酸乙酯水解酶突变体，所得氨基甲酸乙酯水解酶突变体Q328C和Q328V的半衰期都分别比原酶提高了7.46倍和1.96倍。突变体Q328C、Q328R、Q328V在30℃以上都具有比原酶更好的耐受性。此外，突变体Q328C对乙醇的耐受性和酸耐受性也有所提高。
【IPC分类】C12N15/70, C12N9/18, C12N15/55, C12H1/15
【公开号】CN105420210
【申请号】CN201510971638
【发明人】方芳, 刘晓慧, 吕思熠, 陈坚, 堵国成
【申请人】江南大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月21日