一种去除疫苗中Vero细胞DNA的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制品制备领域，具体地说，涉及一种去除疫苗中Vero细胞DNA的 方法。
【背景技术】
[0002] vero细胞的正式名称为"非洲绿猴肾细胞"，是传代细胞的一种。用于疫苗生产的 细胞系均采用非肿瘤细胞系，即正常细胞群的连续传代后繁衍的细胞系，在一定传代限度 内使用。Vero细胞由于具有传代细胞特性，因此也存在理论上的潜在致肿瘤性，目前WHO认 为130~150代细胞无致肿瘤性，可以用于疫苗的生产。国内研制的Vero细胞基质的疫苗， 细胞致肿瘤试验均为阴性，已批准上市多年的产品，未见有安全性方面的问题，然而，有报 导超过170代的Vero细胞致肿瘤试验阳性。由于传代细胞调控生长的基因失调，使得传代 细胞系具有无限的寿命。因此，理论上认为传代细胞系的DNA具有使其他细胞生长失控和 产生致肿瘤活性的潜在能力，所以需对疫苗的Vero细胞残余DNA进行质量控制。关于Vero 细胞残余DNA危害，除了与残余DNA含量的多少有关外，还与残余DNA片断的大小有关，残 余DNA含量越高、片断越大，其潜在的致肿瘤性越大。因此，应该强化疫苗纯化工艺，尽量降 低Vero细胞残余DNA含量。
[0003]目前国内大多采用硫酸鱼精蛋白沉淀法去除外源细胞DNA，此方法操作复杂，应用 于EV71疫苗原液制备时，DNA去除率与EV71抗原回收率成反比，即降低残余DNA含量的同 时，EV71抗原回收率也会随之下降，产品损失较大。
[0004] 全能核酸酶（BenzonaseNuclease)是来源于SerratiaMarcescens经过基因 工程改造的核酸酶。它能够在非常广泛的条件下（6Murea, 0.1MGuanidineHC1，0.4% TritonX100,0.l%SDS，lmMEDTA，lmMPMSF),能够降解各种形式DNA和RNA，对单链、双 链、线状、环状和超螺旋形式的DNA和RNA的磷酸二酯键均具有很高的活性，产生5' -磷酸 核苷酸或5' -磷酸寡核苷酸，且对核酸没有序列要求。
[0005] 中国专利（申请号2012102639082)公开了一种去除疫苗中宿主DNA的方法，使用 阴离子交换色谱法与Benzonase酶结合的方法能够使DNA残留量< 10pg/剂。所述的阴离 子交换介质QSepharoseFF和DEAESepharoseFF，结合后续的核酸酶处理步骤和分子筛 层析步骤，最终得到的病毒液配制成疫苗，但是由于在离子交换步骤中需要调整病毒感染 的宿主细胞培养上清浓缩液的pH值和盐浓度，此方法操作复杂，抗原损失量大。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种去除疫苗中Vero细胞DNA的方法，使用该方法可在有 效降低Vero细胞DNA残留量的同时，保证疫苗原液较高的回收率，且操作简单，成本节约。
[0007] 本发明提供的一种去除疫苗中传代细胞DNA的方法，包括以下步骤：
[0008] (1)病毒液中加入MgCl2;
[0009] (2)再加入Benzonase酶；
[0010] (3)室温下搅拌，静置酶切；
[0011] (4)将酶切液入分子筛层析、超滤透析，除菌过滤后得到疫苗原液。
[0012] 在本发明的实施例中，传代细胞为Vero细胞。
[0013] 本发明的去除疫苗中传代细胞DNA的方法中步骤（1)所述病毒液为采用Vero细 胞培养得到的病毒液，经过简单提纯，杂质少。
[0014] 其中，步骤⑴中加入MgCl2使终浓度为l-3mmol/L。
[0015] 在本发明的实施例中，选择lmmol/L的MgCl2溶液加入病毒液中进行浓度调配，使 MgCl；^终浓度为 2mmol/L。
[0016] 本发明方法中，步骤（2)中加入Benzonase酶使其终浓度为18_72U/ml。优选地， 病毒液中，Benzonase酶终浓度为36U/ml。
[0017] 本发明方法中，步骤（3)室温下搅拌的转速为50-200rpm/min，搅拌时间为2-4小 时。
[0018] 优选地，步骤（3)室温19°C下搅拌的转速为150rpm/min，搅拌时间为2小时。
[0019] 本发明方法中，步骤（3)静置酶切时间为10-20小时。优选地，于室温下静置酶切 16小时。
[0020] 本发明方法中，酶切结束后，立即进行分子筛层析，步骤（4)分子筛层析的凝胶介 质为S印harose4FF，采用0. 01mol/LPBST80为缓冲液，酶切液单次上样量为4± 1 %的柱 内介质体积，以〇. 3-0. 7cm/min的线速度上样，收集时间为64-150min。
[0021] 优选地，酶切液单次上样量为4%的柱内介质体积，以0. 6cm/min的线速度上样， 收集时间为75min。
[0022] 其中，步骤（4)超滤透析是采用0. 01mol/LPBS缓冲液经100KD膜包超滤透析，透 析6-8次，得到病毒精纯液，除菌过滤后得到疫苗原液。
[0023] 本发明提供了上述方法在生物制品质量控制中的应用或在制备生物制品中的应 用。
[0024] 本发明方法具有以下有益效果：
[0025] (1)本发明采用Benzonase酶去除Vero细胞DNA，与本领域常用的硫酸鱼精蛋 白沉淀相比较，操作简便、工作量小，能够有效去除Vero细胞DNA，Vero细胞DNA残留量 < 5pg/ml，远远低于欧盟对Vero细胞DNA残留量的标准（婴幼儿疫苗< 100pg/剂量，1剂 量相当于lml)，适用于大规模工业化生产；
[0026] (2)本发明方法对产品造成的损失较小，Benzonase酶能够通过分子筛层析有效 去除，利用Benzonase酶去除Vero细胞DNA的酶残留量低于0. 2ng/ml，该残留量远远低于 药典要求，安全性良好；
[0027] (3)本发明方法处理后的疫苗原液平均回收率为86%，批间一致性良好；疫苗原 液的比活性平均值为365U/μg。
[0028] 总之，本发明方法能够显著去除疫苗中Vero细胞DNA，且操作简单，成本低，安全 可靠，在疫苗制备领域具有广阔的应用前景。
【具体实施方式】
[0029]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0030] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0031] 实施例1EV71灭活液制备
[0032] 1.选取一支129代Vero工作细胞库用199培养基复苏、换液、传代。收获第137 代Vero细胞。
[0033] 2.配制病毒维持液，加入EV71毒种，使EV71毒种稀释至0. 001M0I后接种Vero细 胞，33. 0°C恒温静置培养9天。
[0034] 3.细胞病变75%以上时收获细胞上清液，即为病毒收获液。
[0035] 4.病毒收获液控制总蛋白质含量在600μg/ml以下进行灭活，加入1:200的福尔 马林溶液，36. 5°C灭活96h。灭活结束后得到EV71灭活液。
[0036] 5.连续制备3批EV71灭活液，批号分别为001、002、003。
[0037] 实施例2EV71疫苗原液制备
[0038] 一、疫苗病毒液纯化
[0039] 1.将实施例1收获的EV71灭活液进行纯化，纯化工艺如下：
[0040] 2.EV71灭活液使用0. 01mol/LPBST80缓冲液经过100KD膜包超滤浓缩60倍，得 到EV71超滤液。
[0041] 3.EV71超滤液加入35%PEG6000溶液放置4°C沉淀2h后离心，第一次离心时间为 120min、温度4°C、离心力7000g，离心后废弃上清，将沉淀用0· 01mol/LPBS重溶，0·Olmol/ LPBS用量为超滤液重量的70%，搅拌10min使沉淀溶解后配平离心，离心时间为35min、温 度4°C、离心力4000g。离心结束后收集离心上清液，沉淀用0· 01m〇l/LPBS重溶，0·Olmol/ LPBS用量为超