一种肿瘤疫苗及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种肿瘤疫苗及其应用。本发明提供的肿瘤疫苗，其制备方法依次包括如下步骤：(1)将特异融合蛋白的编码基因导入离体的肿瘤细胞，得到重组肿瘤细胞；所述特异融合蛋白自N端至C端依次包括多聚肽段和B7-1肽段；所述多聚肽段自N端至C端依次包括多聚赖氨酸和多聚谷氨酸；(2)将所述重组肿瘤细胞进行细胞灭活，得到肿瘤疫苗。本发明提供的肿瘤疫苗与直接灭活肿瘤细胞得到的肿瘤疫苗相比，具有非常显著的疗效。本发明对于肿瘤的治疗和预防，特别是黑色素瘤和肺腺癌的治疗和预防具有重大价值。
【专利说明】一种肿瘤疫苗及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种肿瘤疫苗及其应用。
【背景技术】
[0002]近年来，随着对肿瘤发生发展分子机制的深入研究和生物技术的迅速发展，以免疫治疗为基础的肿瘤生物治疗被视为是继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗模式。与传统的治疗方法不同，肿瘤生物治疗是在不损伤和机体免疫系统和功能的前提下，通过调动肿瘤宿主防御机制或给予天然(或基因工程)产生的针对性靶向性很强的物质来取得抗肿瘤的效应。目前生物疗法主要包括细胞因子治疗、免疫细胞治疗、基因治疗、分子靶向治疗、抗体治疗和肿瘤疫苗技术等。其中，肿瘤疫苗治疗已发展成为一种比较有效的治疗方法，在个体体内注射肿瘤疫苗，可有效减轻患者病情并达到防治高危个体癌症复发的效果。
[0003]由于肿瘤的疫苗治疗无明显毒副作用，因而近年来发展很快，目前的肿瘤疫苗主要有以细胞为载体的肿瘤疫苗、单克隆抗体肿瘤疫苗、肿瘤基因疫苗、肿瘤多肽疫苗等。其中，肿瘤细胞为载体的肿瘤疫苗作为肿瘤生物治疗的一种重要手段，越来越受到人们广泛重视。然而，由于肿瘤细胞表达抗原的免疫原性较弱，表面MHC分子、共刺激分子表达低下或缺乏，加上肿瘤本身复杂的遗传背景，原始的肿瘤细胞疫苗往往不能诱导很强的免疫应答。为改变这一不足，可采用分子修饰技术改变肿瘤细胞的免疫特性或遗传背景，以提高其免疫原性，诱导更强的免疫应答。因而，研制开发疗效好、应用范围广的肿瘤疫苗已成为目前肿瘤防治研究的一个迫切问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种肿瘤疫苗及其应用。
[0005]本发明提供的肿瘤疫苗，其制备方法依次包括如下步骤:
[0006](I)将特异融合蛋白的编码基因导入离体的肿瘤细胞，得到重组肿瘤细胞；
[0007]所述特异融合蛋白自N端至C端依次包括多聚肽段和B7-1肽段；所述多聚肽段自N端至C端依次包括多聚赖氨酸(具体可为由25-35个赖氨酸残基组成多聚赖氨酸；优选为由30个赖氨酸残基组成多聚赖氨酸)和多聚谷氨酸(具体可为由25-35个谷氨酸残基组成的多聚谷氨酸；优选为由30个谷氨酸残基组成的多聚谷氨酸)；
[0008](2)将所述重组肿瘤细胞进行细胞灭活，得到肿瘤疫苗。
[0009]为避免所述多聚肽段和所述B7-1肽段的空间结构彼此影响，所述多聚肽段和所述B7-1肽段之间还可具有连接肽。所述连接肽优选为由4个丙氨酸残基组成的连接肽。
[0010]所述特异融合蛋白具体可如序列表的序列I所示。
[0011]所述特异融合蛋白的编码基因具体可如序列表的序列2所不。
[0012]所述肿瘤疫苗的制备方法中，在步骤(I)和步骤(2)之间还可包括如下步骤:取所述重组肿瘤细胞，用化疗药物进行处理(模拟临床治疗)。所述化疗药物具体可为顺钼(Cisplatin，⑶DP)。所述“用化疗药物进行处理”的方式具体如下:①取所述重组肿瘤细胞的细胞悬液，加入顺钼并使其浓度为0.05mg/ml，培养5天后收集细胞，用PBS缓冲液洗涤后培养30天完成步骤①后，收集活细胞，用PBS缓冲液洗涤后悬浮，得到细胞悬液取步骤②得到的细胞悬液，加入顺钼并使其浓度为0.05mg/ml，培养5天后收集细胞，用PBS缓冲液洗涤后培养30天完成步骤③后，收集活细胞，用PBS缓冲液洗涤后悬浮，得到细胞悬液。
[0013]所述步骤(2)中，所述细胞灭活具体采用丝裂霉素C进行。所述细胞灭活的具体条件可为:在100 μ g/ml的丝裂霉素C浓度下培养I个小时。
[0014]所述肿瘤疫苗的制备方法具体如下:
[0015]( I )将所述特异融合蛋白的编码基因导入离体的肿瘤细胞，得到重组肿瘤细胞；
[0016]( II )用RPM1-1640培养液悬浮所述重组肿瘤细胞，得到活细胞浓度为I X 16个/ml的细胞悬液；
[0017](III)取步骤(II )得到的细胞悬液，加入顺钼并使其浓度为0.05mg/ml，在37°C、5% CO2的环境中静置培养5天，然后收集细胞，用pH7.4,0.0lM的PBS缓冲液洗涤，然后在RPM1-1640培养液中培养30天；
[0018](IV)完成步骤(III)后，收集活细胞，用ρΗ7.4、0.01Μ的PBS缓冲液洗涤，然后用RPM1-1640培养液悬浮，得到活细胞浓度为I X 16个/ml的细胞悬液；
[0019]( V )取步骤(IV )得到的细胞悬液，加入顺钼并使其浓度为0.05mg/ml，在37°C、5% CO2的环境中静置培养5天，然后收集细胞，用pH7.4,0.0lM的PBS缓冲液洗涤，然后在RPM1-1640培养液中培养30天；
[0020](VI)完成步骤(V)后，收集活细胞，用ρΗ7.4、0.0lM的PBS缓冲液洗涤，然后用RPM1-1640培养液悬浮，得到活细胞浓度为I X 16个/ml的细胞悬液；
[0021](W)取步骤(VI)得到的细胞悬液，加入丝裂霉素C并使其浓度为100 μ g/ml，在37°C、5% CO2的环境中静置培养I个小时；
[0022]( VDI)完成步骤(Vn )后，收集被丝裂霉素C灭活的细胞，用pH7.4,0.0lM的PBS缓冲液洗涤，然后用RPM1-1640培养液悬浮，得到细胞浓度为I X 16个/ml的细胞悬液，即为肿瘤疫苗。
[0023]所述离体的肿瘤细胞可为黑色素瘤细胞或肺腺癌细胞。
[0024]所述黑色素瘤细胞是指来自黑色素瘤的离体肿瘤细胞，可以通过原代分离得到，也可以通过商购途径获得。黑色素瘤细胞具体可为B16-F10细胞(410^0^-64751
[0025]所述肺腺癌细胞是指来自肺腺癌的离体肿瘤细胞。所述肺腺癌细胞可以通过原代分离LA795肺腺癌荷瘤鼠(由中国医学科学院肿瘤医院动物室提供，合格号:SCXKl 1-00-0005)肿瘤组织得到，也可以通过商购途径获得。肺腺癌细胞具体可为LA795细胞(上海研生实业有限公司，货号为YS2359)。
[0026]可在本发明提供的肿瘤疫苗的基础上可通过添加免疫佐剂诱导更强的免疫应答。
[0027]所述特异融合蛋白跨膜表达，多聚赖氨酸嵌入肿瘤细胞的细胞膜，B7-1肽段游离在肿瘤细胞的细胞膜外。B7-1肽段提供共刺激信号，诱导T淋巴细胞增殖和分泌细胞因子，从而增强T细胞的活化和肿瘤的特异性杀伤作用。与现有的肿瘤疫苗(直接灭活肿瘤细胞得到的肿瘤疫苗)相比，本发明提供的肿瘤疫苗的免疫原性更强、抗肿瘤效应更高，针对化疗后转移或耐药的肿瘤细胞更为有效，对肿瘤的预防和治疗具有重要应用价值。
[0028]与现有的肿瘤疫苗(直接灭活肿瘤细胞得到的肿瘤疫苗)相比，本发明提供的肿瘤疫苗可有效预防和治疗多种肿瘤发生，具有非常显著的疗效。本发明对于肿瘤的治疗和预防，特别是黑色素瘤和肺腺癌的治疗和预防具有重大价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为载体pDisplay的结构示意图。
[0030]图2为重组细胞甲和重组细胞乙的表征结果。
【具体实施方式】
[0031]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0032]载体pDisplay (结构示意图见图1):1nvitrogen 公司，USA。B16-F10 细胞:ATCC*CRL-6475?,。LA795细胞:上海研生实业有限公司，产品货号为YS2359。RPM1-1640培养液:HyClone，商品号为SH30809.01B。鼠抗人B7-1单抗:美国B1science公司。顺钼(Cisplatin，CDDP):美国 Sigma公司，产品目录号为 P4394。丝裂霉素C(Mitomycin C，MMC):购自Sigma，产品目录号为M0503。C57BL/J6小鼠:北京维通利华公司，雄性，体重18_26g。T739小鼠:中国医学科学院肿瘤医院动物室，雄性，体重18-26g。
[0033]实施例1、制备肿瘤疫苗
[0034]一、制备重组肿瘤细胞
[0035]1、将序列表的序列2所示的双链DNA分子正向插入载体pDisplay的Sma I和SalI酶切位点之间，得到重组质粒。
[0036]2、将步骤I得到的重组质粒转染B16-F10细胞，得到重组细胞甲。
[0037]3、将载体pDisplay转染B16-F10细胞，得到对照细胞甲。
[0038]4、将步骤I得到的重组质粒转染LA795细胞,得到重组细胞乙。
[0039]5、将载体pDisplay转染LA795细胞，得到对照细胞乙。
[0040]二、重组细胞的表征
[0041]1、重组细胞甲的表征
[0042](I)用RPM1-1640培养液悬浮重组细胞甲、对照细胞甲或B16-F10细胞，得到细胞浓度为I X 16个/ml的细胞悬液；
[0043](2)取100 μ I步骤一得到的细胞悬液，加入2 μ L鼠抗人B7_l单抗并使其浓度为2001^/1111，室温静置孵育111，然后用？!17.4、0.0现的？83缓冲液洗涤并悬浮，然后加入60&七anti mouse IgG/FITC并4°C静置孵育lh，然后用ρΗ7.4、0.0lM的PBS缓冲液洗涤并悬浮，得到I X 16个/ml的细胞悬液，滴取I滴细胞悬液于载玻片上，进行免疫荧光激光共聚焦显微镜观察。
[0044]照片见图2，A为重组细胞甲，B为对照细胞甲。B16-F10细胞与对照细胞甲的表型一致。可以观察到，重组细胞甲表面显示荧光(即具有B7-1)，对照细胞甲和B16-F10细胞表面均不显示荧光。
[0045]2、重组细胞乙的表征
[0046](I)用RPM1-1640培养液悬浮重组细胞乙、对照细胞乙或LA795细胞，得到细胞浓度为I X 16个/ml的细胞悬液；
[0047](2)同步骤 I 的(2)。
[0048]照片见图2，A为重组细胞乙，B为对照细胞乙，C为LA795细胞。LA795细胞与对照细胞乙的表型一致。可以观察到，重组细胞乙表面显示荧光(即具有B7-1)，对照细胞乙和LA795细胞表面均不显示荧光。
[0049]三、制备肿瘤疫苗
[0050]1、制备肿瘤疫苗甲-1
[0051](I)用RPM1-1640培养液悬浮重组细胞甲，得到活细胞浓度为IX 16个/ml的细胞悬液。
[0052](2)取步骤⑴得到的细胞悬液，加入顺钼并使其浓度为0.05mg/ml，在37°C、5% CO2的环境中静置培养5天，然后收集细胞，用pH7.4,0.0lM的PBS缓冲液洗涤，然后在RPM1-1640培养液中培养30天。
[0053](3)完成步骤⑵后，收集活细胞，用pH7.4,0.0lM的PBS缓冲液洗涤，然后用RPM1-1640培养液悬浮，得到活细胞浓度为I X 16个/ml的细胞悬液。
[0054](4)取步骤(3)得到的细胞悬液，加入顺钼并使其浓度为0.05mg/ml，在37°C、5% CO2的环境中静置培养5天，然后收集细胞，用pH7.4,0.0lM的PBS缓冲液洗涤，然后在RPM1-1640培养液中培养30天。
[0055](5)完成步骤⑷后，收集活细胞，用pH7.4,0.0lM的PBS缓冲液洗涤，然后用RPM1-1640培养液悬浮，得到活细胞浓度为I X 16个/ml的细胞悬液。
[0056](6)取步骤(5)得到的细胞悬液，加入丝裂霉素C(作用是灭活细胞)并使其浓度为100μ g/ml，在37°C、5% CO2的环境中静置培养I个小时。
[0057](7)完成步骤(6)后，收集被丝裂霉素C灭活的细胞，用pH7.4,0.0lM的PBS缓冲液洗涤，然后用RPM1-1640培养液悬浮，得到细胞浓度为IX 16个/ml的细胞悬液，即为肿瘤疫苗甲-1。
[0058]2、制备肿瘤疫苗甲-1I
[0059](I)用RPM1-1640培养液悬浮重组细胞甲，得到活细胞浓度为I X 16个/ml的细胞悬液。
[0060](2)取步骤(I)得到的细胞悬液，加入丝裂霉素C(作用是灭活细胞)并使其浓度为100μ g/ml，在37°C、5% CO2的环境中静置培养I个小时。
[0061](3)完成步骤(2)后，收集被丝裂霉素C灭活的细胞，用pH7.4,0.0lM的PBS缓冲液洗涤，然后用RPM1-1640培养液悬浮，得到细胞浓度为IX 16个/ml的细胞悬液，即为肿瘤疫苗甲-1I。
[0062]3、制备肿瘤疫苗乙-1
[0063]用重组细胞乙代替重组细胞甲，其它同步骤1，得到肿瘤疫苗乙-1。
[0064]4、制备肿瘤疫苗乙-1I
[0065]用重组细胞乙代替重组细胞甲，其它同步骤2，得到肿瘤疫苗乙-1I。
[0066]5、制备对照品甲-1
[0067]用对照细胞甲代替重组细胞甲，其它同步骤1，得到对照品甲-1。
[0068]6、制备对照品甲-1I
[0069]用对照细胞甲代替重组细胞甲，其它同步骤2，得到对照品甲-1I。
[0070]7、制备对照品甲-1II
[0071]用B16-F10细胞代替重组细胞甲，其它同步骤1，得到对照品甲_ III。
[0072]8、制备对照品甲-1V
[0073]用B16-F10细胞代替重组细胞甲，其它同步骤2，得到对照品甲-1V。
[0074]9、制备对照品乙-1
[0075]用对照细胞乙代替重组细胞甲，其它同步骤1，得到对照品乙-1。
[0076]10、制备对照品乙-1I
[0077]用对照细胞乙代替重组细胞甲，其它同步骤2，得到对照品乙-1I。
[0078]11、制备对照品乙-1II
[0079]用LA795细胞代替重组细胞甲，其它同步骤1，得到对照品乙-1II。
[0080]12、制备对照品乙-1V
[0081]用LA795细胞代替重组细胞甲，其它同步骤2，得到对照品乙-1V。
[0082]实施例2、肿瘤疫苗甲的免疫效应
[0083]一、促进淋巴细胞增殖
[0084]1、取C57BL/J6小鼠，取脾脏，分离获取淋巴细胞。
[0085]2、用RPM1-1640培养液悬浮步骤I得到的淋巴细胞，得到细胞浓度为I X 16个/ml的淋巴细胞悬液。
[0086]3、将50 μ I待测品与50 μ I步骤2得到的淋巴细胞悬液混合，在37 °C、5 %CO2的环境中静置培养3天，然后采用MTT比色法测定吸光值(A570nm)，计算增殖指数(Proliferat1n Index, PI)。待测品分别为实施例1制备的肿瘤疫苗甲-1、肿瘤疫苗甲-11、对照品甲-1、对照品甲-11、对照品甲-1II或对照品甲-1V。设置用等体积RPM1-1640培养液代替待测品的处理，作为空白对照。每种待测品设置5个重复处理，空白对照设置5个重复处理。
[0087]PI =(试验孔的吸光值-空白对照孔的吸光值)/空白对照孔的吸光值。
[0088]加入肿瘤疫苗甲-1的试验组的PI为3.95±0.6。
[0089]加入肿瘤疫苗甲-1I的试验组的PI为3.93±0.3。
[0090]加入对照品甲-1的试验组的PI为1.71 ±0.2。
[0091]加入对照品甲-1I的试验组的PI为1.74±0.3。
[0092]加入对照品甲-1II的试验组的PI为1.70±0.4。
[0093]加入对照品甲-1V的试验组的PI为1.73±0.7。
[0094]结果表明:与各个对照品相比，肿瘤疫苗甲-1和肿瘤疫苗甲-1I能显著的刺激淋巴细胞增殖，各个对照品的效果没有显著差异。
[0095]二、促进淋巴细胞分泌细胞因子
[0096]1、肿瘤细胞的预处理
[0097](I)用RPM1-1640培养液悬浮B16-F10细胞，得到活细胞浓度为I X 16个/ml的细胞悬液。
[0098](2)取步骤⑴得到的细胞悬液，加入顺钼并使其浓度为0.05mg/ml，在37°C、5% CO2的环境中静置培养5天，然后收集细胞，用pH7.4,0.0lM的PBS缓冲液洗涤，然后在RPM1-1640培养液中培养30天。
[0099](3)完成步骤⑵后，收集活细胞，用pH7.4,0.0lM的PBS缓冲液洗涤，然后用RPM1-1640培养液悬浮，得到活细胞浓度为I X 16个/ml的细胞悬液。
[0100](4)取步骤(3)得到的细胞悬液，加入顺钼并使其浓度为0.05mg/ml，在37°C、5% CO2的环境中静置培养5天，然后收集细胞，用pH7.4,0.0lM的PBS缓冲液洗涤，然后在RPM1-1640培养液中培养30天。
[0101](5)完成步骤⑷后，收集活细胞，用pH7.4,0.0lM的PBS缓冲液洗涤，然后用RPM1-1640培养液悬浮，得到活细胞浓度为I X 16个/ml的细胞悬液。
[0102]2、制备鼠模型
[0103]取C57BL/J6小鼠，每周在右前肢皮下注射一次步骤I得到的细胞悬液(即注射日期分别为实验第I天、第8天和第15天；每次每只小鼠注射的细胞悬液中含2 X 16个活细胞)。实验第5天、第12天和第19天，小鼠的原位肿瘤大小依次为1.4cm3、2.1cm3和3.2cm3,得到了模型小鼠。
[0104]3、实验第36天，取模型小鼠的小鼠的脾脏，分离获取淋巴细胞。
[0105]4、用RPM1-1640培养液悬浮步骤3得到的淋巴细胞，得到细胞浓度为IX 16个/ml的淋巴细胞悬液。
[0106]5、将50 μ I待测品与50 μ I步骤4得到的淋巴细胞悬液混合，在37°C、5% CO2的环境中静置培养48小时，然后250g离心4min，收集上清液。待测品分别为实施例1制备的肿瘤疫苗甲-1、肿瘤疫苗甲-11、对照品甲-1、对照品甲-11、对照品甲-1II或对照品甲-1V。设置用等体积RPM1-1640培养液代替待测品的处理，作为空白对照。每种待测品设置5个重复处理，空白对照设置5个重复处理。
[0107]6、检测步骤5得到的上清液，检测其中IFN- Y的浓度和IL_2的浓度。用于检测IFN- Y的试剂盒为Mouse IFN-gamma Quantikine ELISA Kit (美国RD公司，产品目录号:MIF00) ο用于检测IL-2的试剂盒为Mouse IL_2Quantikine ELISA Kit (美国RD公司，产品目录号:M2000)。
[0108]结果见表I。
[0109]表I小鼠脾细胞分泌IFN- Y和IL-2的检测结果(pg/ml)
[0110]
IlFN-yI IL-2
空白对照39.0 + 2.515.6 + 0.5
对照品甲-1V 46.2 + 3.526.9+1.3
对照品甲 -1II 45.6 + 2.826.3+1.5
对照品甲-1I 46.4 + 3.126.7+1.2
【权利要求】
1.一种肿瘤疫苗，其制备方法依次包括如下步骤: (1)将特异融合蛋白的编码基因导入离体的肿瘤细胞，得到重组肿瘤细胞； 所述特异融合蛋白自N端至C端依次包括多聚肽段和B7-1肽段；所述多聚肽段自N端至C端依次包括多聚赖氨酸和多聚谷氨酸； (2)将所述重组肿瘤细胞进行细胞灭活，得到肿瘤疫苗。
2.如权利要求1所述的肿瘤疫苗，其特征在于:所述多聚肽段和所述B7-1肽段之间还具有连接肽。
3.如权利要求2所述的肿瘤疫苗，其特征在于:所述连接肽为由4个丙氨酸残基组成的连接肽。
4.如权利要求3所述的肿瘤疫苗，其特征在于:所述特异融合蛋白如序列表的序列I所示。
5.如权利要求4所述的肿瘤疫苗，其特征在于:所述特异融合蛋白的编码基因如序列表的序列2所示。
6.如权利要求1至5中任一所述的肿瘤疫苗，其特征在于:所述肿瘤疫苗的制备方法中，在步骤(I)和步骤(2)之间还可包括如下步骤:取所述重组肿瘤细胞，用化疗药物进行处理。
7.如权利要求6所述的肿瘤疫苗，其特征在于:所述化疗药物为顺钼。
8.如权利要求1至7中任一所述的肿瘤疫苗，其特征在于:所述离体的肿瘤细胞为黑色素瘤细胞或肺腺癌细胞。
【文档编号】A61P35/00GK104127868SQ201410189676
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】卢戌 申请人:卢戌